專(zhuān)利名稱(chēng)：細(xì)胞中變化的檢測(cè)方法
細(xì)胞中變化的檢測(cè)方法優(yōu)先權(quán)本申請(qǐng)是2008年12月15日提出的U. S. 12/335，393的繼續(xù)申請(qǐng)，本文以引用的方式將其整體并入。本申請(qǐng)交叉引用2008年12月15日提出的題為“離子通道調(diào)節(jié)劑的識(shí)別方法 (Methods For Identifying Modulators of Ion Channels) ” 的美國(guó)序號(hào) 12/3；35，433 專(zhuān)利，本文以引用的方式將其整體并入。
背景技術(shù)：
藥物探索科學(xué)需要更為有效的工具，這些工具用于測(cè)定生物材料和試驗(yàn)化合物對(duì)人細(xì)胞和組織的影響。通常，許多生物學(xué)平臺(tái)(一些使用工程的細(xì)胞或標(biāo)記物)建立在基于細(xì)胞的系統(tǒng)中的用于這些測(cè)定的組織內(nèi)。這些平臺(tái)需要許多不同的讀數(shù)器，這些讀數(shù)器經(jīng)常提供不一致的數(shù)據(jù)集。它們經(jīng)常使用工程的細(xì)胞，所述工程的細(xì)胞含有在疾病過(guò)程中涉及的特別目標(biāo)的過(guò)度表達(dá)。這種工程的系統(tǒng)的凈效果和最初所尋求的恰好相反，結(jié)果被從天然或自然的響應(yīng)中除去。在其它情況下，這些平臺(tái)使用標(biāo)記物以監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在標(biāo)記物中引入新的化學(xué)實(shí)體也會(huì)以難以測(cè)定的方式對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。所需要的是可以和許多不同種類(lèi)的細(xì)胞一起用于試驗(yàn)潛在治療法的單一平臺(tái)，所述治療法反映對(duì)試驗(yàn)材料的自然的細(xì)胞反應(yīng)。
發(fā)明概要本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)方法。該方法包括(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將細(xì)胞加入生物傳感器；或(ii)將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面。細(xì)胞在這兩種情況下可以
在無(wú)血清培養(yǎng)基中。將細(xì)胞暴露于刺激源并檢測(cè)細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)。所述刺激源可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體(transient receptor)電勢(shì)通道、磷脂酶C、 受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β-抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)(印igenetic signal)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。和檢測(cè)方法中不包括一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的方法相比，細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)可以增大。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供用于試驗(yàn)的細(xì)胞的制備方法。該方法包括用缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞；從細(xì)胞除去所述缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液；將等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑加入細(xì)胞；用緩沖鹽水溶液中和所述等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑；用緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞；和將細(xì)胞加到生物傳感器表面并使細(xì)胞附著于生物傳感器的表面?？梢栽谡持{(diào)節(jié)劑的存在下將細(xì)胞加到生物傳感器表面。生物傳感器表面可具有固定于其的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體，或者其中在細(xì)胞加入生物傳感器表面前，將它們和一種或多種細(xì)胞外配體混合?？梢詸z測(cè)到細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)配體的結(jié)合。本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案提供細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)方法。該方法包括用緩沖鹽水溶液洗滌所述細(xì)胞。然后(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將細(xì)胞加入生物傳感器；或(ii)將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面。將細(xì)胞暴露于刺激源并檢測(cè)細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)。在所列舉的方法步驟之前，可進(jìn)行下列步驟用缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞；從細(xì)胞除去所述缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液；將等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑加入細(xì)胞；和用緩沖鹽水溶液中和所述等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑?？梢栽谡持{(diào)節(jié)劑的存在下將細(xì)胞加到生物傳感器表面。所述刺激源可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、 受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供測(cè)定試驗(yàn)試劑是否影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法。該方法包括將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器，且其中所述孔具有微流體通道，所述微流體通道可將試驗(yàn)試劑遞送至該孔內(nèi)的一個(gè)位置。將具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體特異性的細(xì)胞表面受體的細(xì)胞加入所述孔。使用所述微流體通道將試驗(yàn)試劑加入孔；其中所述試驗(yàn)試劑是疑似趨化劑(suspected chemotactic agent)。檢測(cè)細(xì)胞在孔中的運(yùn)動(dòng)，其中如果檢測(cè)到細(xì)胞在孔中的運(yùn)動(dòng)，則所述試驗(yàn)試劑影響細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。所述試驗(yàn)試劑可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供測(cè)定試驗(yàn)化合物是否影響細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)配體的特異性結(jié)合的方法。該方法包括將第一細(xì)胞加入第一比色共振反射生物傳感器表面或第一基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述生物傳感器表面包括固定的細(xì)胞外基質(zhì)配體，其中第一細(xì)胞具有對(duì)所述細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體，使第一細(xì)胞附著于第一生物傳感器的表面，和對(duì)第一細(xì)胞測(cè)定峰波長(zhǎng)值或信號(hào)。將第二細(xì)胞加入第二比色共振反射生物傳感器表面或第二基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述第二生物傳感器表面包括固定的細(xì)胞外基質(zhì)配體，其中第二細(xì)胞具有對(duì)所述細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體，將試驗(yàn)化合物加入生物傳感器表面，使第二細(xì)胞附著于生物傳感器的表面，和對(duì)第二細(xì)胞測(cè)定峰波長(zhǎng)值或信號(hào)。比較對(duì)第一細(xì)胞獲得的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)和對(duì)所述第二細(xì)胞獲得的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；其中如果對(duì)第二細(xì)胞的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)基本上不同于對(duì)第一細(xì)胞的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)，則所述試驗(yàn)化合物影響細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)配體的特異性結(jié)合。所述試驗(yàn)化合物可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、Ρ13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供實(shí)時(shí)分析細(xì)胞變化的方法。該方法包括將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面； 將細(xì)胞加入生物傳感器，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；將細(xì)胞暴露于刺激源；和使用分辨率約2到10微米的檢測(cè)裝置檢測(cè)細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)。所述刺激源可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、Ρ13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。所述細(xì)胞變化可以是細(xì)胞生長(zhǎng)模式、細(xì)胞死亡模式、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞尺寸或體積或者細(xì)胞粘著中的變化。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供檢測(cè)細(xì)胞響應(yīng)變化的方法。該方法包括將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面； 在無(wú)血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞加入所述生物傳感器，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；將細(xì)胞暴露于刺激源而不洗去所述無(wú)血清培養(yǎng)基；和檢測(cè)細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)。所述刺激源可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、Ρ13激酶、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β-抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的活性的化合物。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述生物傳感器通過(guò)將卵清蛋白或胎牛血清和兩種或更多種細(xì)胞外基質(zhì)配體施用于所述生物傳感器的表面并將所述生物傳感器的表面干燥而制備。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供識(shí)別影響細(xì)胞粘著的化合物的方法。該方法包括(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將細(xì)胞加入生物傳感器；或(ii)將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面。用試驗(yàn)化合物處理細(xì)胞。檢測(cè)比色共振反射光學(xué)第一 PWV或信號(hào)，并將它和來(lái)自未用所述試驗(yàn)化合物處理的對(duì)照細(xì)胞的第二 PWV或信號(hào)比較，以測(cè)定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述細(xì)胞的粘著。所述試驗(yàn)化合物可以是調(diào)節(jié)G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道或磷脂酶C的活性的化合物。在試驗(yàn)期間，在加入試驗(yàn)化合物之前或加入期間，或者在加入之后，可將粘著調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞，其中對(duì)照細(xì)胞也用粘著調(diào)節(jié)劑處理。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供識(shí)別影響細(xì)胞粘著的經(jīng)修飾的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)配體的方法。該方法包括將細(xì)胞施用至比色共振反射光學(xué)生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中將經(jīng)修飾的ECM配體固定于生物傳感器的表面；將粘著調(diào)節(jié)劑加入細(xì)胞；對(duì)細(xì)胞檢測(cè)比色共振反射光學(xué)第一 PWV或信號(hào)，并將第一 PWV或信號(hào)和第二 PWV或信號(hào)比較，所述第二 PWV或信號(hào)來(lái)自加入比色共振反射光學(xué)生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面的對(duì)照細(xì)胞，其中將未經(jīng)修飾的ECM配體固定于生物傳感器的表面，以測(cè)定所述試驗(yàn)化合物是否影響細(xì)胞粘著。本發(fā)明的又一實(shí)施方案提供測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否生產(chǎn)重組蛋白的方法。該方法包括將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；將細(xì)胞加入所述生物傳感器的表面，所述細(xì)胞已用編碼重組蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染且具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；對(duì)所述細(xì)胞測(cè)定第一 PWV或信號(hào)；加入調(diào)節(jié)劑，和不表達(dá)所述重組蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，所述調(diào)節(jié)劑在表達(dá)所述重組蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中引起差別響應(yīng)；對(duì)所述細(xì)胞測(cè)定第二 PWV或信號(hào)；比較第一峰波長(zhǎng)值或信號(hào)和第二峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；其中如果第二峰波長(zhǎng)值或信號(hào)基本上不同于第一峰波長(zhǎng)值或信號(hào)，則所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)所述重組蛋白。本發(fā)明提供細(xì)胞粘著作為監(jiān)測(cè)細(xì)胞對(duì)刺激源響應(yīng)的模式之一。許多主要的科學(xué)來(lái)源報(bào)道，細(xì)胞性活動(dòng)(cellular event)的過(guò)剩及響應(yīng)和幾種細(xì)胞粘著模式之一有聯(lián)系。本發(fā)明描述生物傳感器的操作方法，用于監(jiān)測(cè)對(duì)刺激源的自然響應(yīng)中的細(xì)胞粘著。本發(fā)明提供商業(yè)上可行的高通量方法，它可以進(jìn)行高靈敏度的基于細(xì)胞的試驗(yàn)， 而沒(méi)有任何類(lèi)型的標(biāo)記物，其在型式(format)上容易和最常用于高通量生物分子相互作用分析的基于微量滴定板或基于微陣列的基礎(chǔ)設(shè)施相容。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示細(xì)胞-蛋白相互作用試驗(yàn)的示意圖。圖2顯示細(xì)胞-蛋白相互作用試驗(yàn)的結(jié)果。發(fā)明詳述本文使用的單數(shù)形式“a”、“an”和“the”包括復(fù)數(shù)個(gè)指示物，除非上下文另外清楚地指明。生物傳感器本發(fā)明的生物傳感器可以是比色共振反射生物傳感器。參見(jiàn)例如，Cunningham 等人， “Colorimetric resonant reflection as a direct biochemical assay technique (作為直接生化試驗(yàn)技術(shù)的比色共振反射)〃，Sensors and Actuators B，81卷， 316-328頁(yè)，2002年1月5日；美國(guó)專(zhuān)利公布號(hào)2004/0091397 ；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，094，595 ；美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，沈4，973。比色共振生物傳感器不是表面等離子共振(SPR)生物傳感器。SI3R生物傳感器具有薄金屬層，比如銀、金、銅、鋁、鈉和銦。該金屬必須具有能夠和適當(dāng)波長(zhǎng)的光共振的導(dǎo)帶電子。暴露于光的sra生物傳感器表面必須是純金屬。氧化物、硫化物及其它膜干擾SPR。比色共振生物傳感器不具有金屬層，而是，它們具有高折射率材料(比如硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭和氮化硅)的電介質(zhì)涂層。基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5，738，825中。基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器包括波導(dǎo)膜和衍射光柵，它將入射光場(chǎng)耦合進(jìn)入波導(dǎo)膜，產(chǎn)生衍射光場(chǎng)。檢測(cè)到波導(dǎo)膜的有效折射率變化。諸如基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的裝置(其中波必須在裝置內(nèi)傳輸顯著距離)缺乏本發(fā)明的空間分辨率。比色共振反射生物傳感器可以不使用熒光標(biāo)簽(tag)、比色標(biāo)記物(label)或任何其它類(lèi)型的檢測(cè)標(biāo)簽或檢測(cè)標(biāo)記物而在生物傳感器的表面上測(cè)量生物化學(xué)相互作用。生物傳感器表面含有光學(xué)結(jié)構(gòu)，該光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)成用準(zhǔn)直光和/或白光照明時(shí)僅反射窄波長(zhǎng)帶(“共振光柵效應(yīng)”)。該窄波長(zhǎng)帶被描述為波長(zhǎng)“峰”。當(dāng)生物傳感器表面上沉積或者除去材料(比如生物材料)時(shí)，該“峰波長(zhǎng)值”(PWV)變化。使用讀數(shù)儀器以準(zhǔn)直光和/或白光照明生物傳感器表面上的不同位置(distinct location)，并收集反射的光。將收集的光聚集于波長(zhǎng)分光計(jì)內(nèi)用以測(cè)定PWV。通過(guò)將該結(jié)構(gòu)(生物傳感器一側(cè)朝上)和無(wú)底的微量滴定板筒的底部結(jié)合，可將生物傳感器并入標(biāo)準(zhǔn)的一次性實(shí)驗(yàn)室物品(比如微量滴定板)。由于和現(xiàn)有微量滴定板處理設(shè)備(比如混合器、培養(yǎng)箱和液體分配設(shè)備)的相容性，將生物傳感器并入常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)室型式的筒是合乎需要的。生物傳感器也可并入，例如，微流體、大流體或微陣列裝置(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，033，819、美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，033，821)。生物傳感器可以本領(lǐng)域公知方法(參見(jiàn)，例如，Jun-Lin Guan 編輯的 Methods of Molecular Biology (分子生物學(xué)方法)，294 卷，Humana Press, Totowa, New Jersey)用于監(jiān)測(cè)暴露于一種或多種細(xì)胞外試劑時(shí)的細(xì)胞行為變化或缺乏這些變化。比色共振反射生物傳感器包括亞波長(zhǎng)結(jié)構(gòu)的表面(SWS)且是可以模仿薄膜涂層效果的非常規(guī)類(lèi)型的衍射光學(xué)。(Peng和Morris，“Resonant scattering from two-dimensional gratings ( 二維光柵的共振散射)”，J. Opt. Soc. Am. A, 13 卷，No. 5，993 頁(yè)，1996 年 5 月；Magnusson 禾口 Wang，"New principle for optical filters (濾光器新原理)”，Appl. Phys. Lett.，61，No. 9，1022 頁(yè)，1992 年 8 月；Peng 和 Morris，“Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings ( 二維光柵衍射中共振異常的實(shí)驗(yàn)證實(shí))”，Optics Letters, 21卷，No. 8，549頁(yè)， 1996年4月)。SffS結(jié)構(gòu)含有一維、二維或三維光柵，其中光柵周期和入射光的波長(zhǎng)相比要小，從而除反射和透射的零級(jí)外沒(méi)有衍射級(jí)可以傳播(propagation)。導(dǎo)模(guided mode) 沿著橫向的傳播不被支持。而是，導(dǎo)模共振效果在距任何光子進(jìn)入生物傳感器結(jié)構(gòu)的點(diǎn)大約3微米的高度局部化區(qū)域內(nèi)發(fā)生。比色共振反射生物傳感器的反射或透射的光可以通過(guò)將分子(比如配體或結(jié)合配偶體(binding partner)或者兩者)加入生物傳感器的上表面而調(diào)制。加入的分子增大入射輻射經(jīng)過(guò)該結(jié)構(gòu)的光程長(zhǎng)度，并因此改變將發(fā)生最大反射或透射的波長(zhǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，比色共振反射生物傳感器設(shè)計(jì)成用白光和/或準(zhǔn)直光照明時(shí)反射單一波長(zhǎng)或窄波長(zhǎng)帶(“共振光柵效應(yīng)”)。當(dāng)物質(zhì)沉積在生物傳感器的表面上時(shí)，反射的波長(zhǎng)因生物傳感器上顯示的光的光程變化而移動(dòng)。檢測(cè)系統(tǒng)包括例如光源(其通過(guò)例如光纖探針以法向入射而照明生物傳感器的小點(diǎn))和光譜儀(其通過(guò)例如第二光纖探針收集反射的光，所述第二光纖探針也處于法向入射)。由于激發(fā)/檢測(cè)系統(tǒng)和生物傳感器表面之間不發(fā)生物理接觸，因此不需要特殊的耦合棱鏡，且該生物傳感器可以容易地適應(yīng)包括例如微量滴定板的任何常用試驗(yàn)平臺(tái)。單個(gè)光譜儀讀數(shù)可在幾毫秒內(nèi)進(jìn)行，因此可以快速測(cè)量在生物傳感器表面上并行發(fā)生的大量分子間相互作用，并可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。比色共振反射生物傳感器包括，例如，由高折射率材料組成的光學(xué)光柵、支持光柵的襯底層，以及任選的一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或連接物，其固定于和襯底層相反的光柵表面上。該高折射率材料具有比襯底層更高的折射率。參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 7，094，595;美國(guó)專(zhuān)利號(hào)7，070，987。任選地，覆蓋層覆蓋光柵表面。光學(xué)光柵涂有高折射率電介質(zhì)膜，該膜可由包括例如硫化鋅、二氧化鈦、氧化鉭、氮化硅和二氧化硅的材料組成。具有光學(xué)特征的光柵的截面分布可以包括任何周期性重復(fù)功能，例如，“方波”。光學(xué)光柵也可包括選自線(一維)、正方形、圓形、橢圓形、三角形、梯形、正弦波、卵形、矩形和六邊形的形狀的重復(fù)圖案。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器也可包括光學(xué)光柵，該光學(xué)光柵由例如涂有高折射率材料的塑料或環(huán)氧樹(shù)脂組成。線性光柵(S卩，一維光柵)具有照射光偏振垂直于光柵周期而取向的共振特征。比色共振反射生物傳感器也可包括，例如，二維光柵，例如，孔或正方形的六角形陣列?？墒褂闷渌螤?。線性光柵具有和六角形陣列光柵相同的間距(即高和低折射率的區(qū)域之間的距離)、周期、層厚度和材料性質(zhì)。然而，光必須垂直于光柵線偏振以共振地耦合進(jìn)入該光學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，必須在照明源和生物傳感器表面之間插入以其偏振軸垂直于線性光柵而取向的偏振濾光器。由于僅小部分照射光源被正確偏振，因此需要較長(zhǎng)的積分時(shí)間，以收集和六角形光柵相比等量的共振反射光。光學(xué)光柵也可包括，例如，“臺(tái)階式”分布，其中單一的固定高度的高折射率區(qū)域嵌入較低折射率覆蓋層內(nèi)。高和低折射率的交替區(qū)域提供平行于生物傳感器頂面的光學(xué)波導(dǎo)。本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器可以進(jìn)一步包括在和襯底層相反的光學(xué)光柵表面上的覆蓋層。存在覆蓋層時(shí)，所述一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)固定在和光柵相反的覆蓋層的表面上。優(yōu)選地，覆蓋層包括折射率比組成光柵的材料低的材料。覆蓋層可以由例如玻璃(包括旋涂玻璃(spin on glass，SOG))、環(huán)氧樹(shù)脂或塑料組成。例如，滿(mǎn)足生物傳感器的折射率要求的各種聚合物可用于覆蓋層。可以使用S0G， 這是由于它的良好的折射率、易于處理以及容易使用玻璃表面活化技術(shù)的資源而由特異性結(jié)合物質(zhì)活化。當(dāng)生物傳感器表面的平坦度對(duì)于特別的系統(tǒng)設(shè)置不是問(wèn)題時(shí)，SiN/玻璃的光柵結(jié)構(gòu)可以直接用作感應(yīng)表面，它的活化可以使用和玻璃表面上相同的方法來(lái)完成。光學(xué)光柵上沒(méi)有平坦化(planarizing)覆蓋層也可以獲得共振反射。例如，生物傳感器可以?xún)H含有涂有高折射率材料的結(jié)構(gòu)化薄膜層的襯底。不使用平坦化覆蓋層，則周?chē)橘|(zhì)(比如空氣或水)填充該光柵。因此，將特異性結(jié)合物質(zhì)在暴露于該特異性結(jié)合物質(zhì)的所有光學(xué)光柵表面上固定于生物傳感器，而不是僅僅在上表面上?？偟膩?lái)說(shuō)，比色共振反射生物傳感器可以用白光和/或準(zhǔn)直光照明，所述白光和/ 或準(zhǔn)直光將會(huì)含有每個(gè)偏振角的光。偏振角相對(duì)于生物傳感器光柵中的重復(fù)特征的取向?qū)Q定共振波長(zhǎng)。例如，由一組重復(fù)的線和間隔組成的“線性光柵”(即，一維光柵)生物傳感器將具有兩種光學(xué)偏振，它們可以產(chǎn)生單獨(dú)的共振反射。垂直于線而偏振的光稱(chēng)作“S-偏振”，同時(shí)平行于線而偏振的光稱(chēng)作“P-偏振”。入射光的S和P組分兩者同時(shí)存在于未濾光的照明束中，且各自產(chǎn)生單獨(dú)的共振信號(hào)。生物傳感器可以通常設(shè)計(jì)成僅使一種偏振 (S-偏振)的性能最佳，并通過(guò)偏振濾光器容易地除去未最佳化的偏振。為了除去偏振依賴(lài)性，從而每個(gè)偏振角產(chǎn)生相同的共振反射光譜，可以使用由一組同心環(huán)組成的替代性生物傳感器結(jié)構(gòu)。在這個(gè)結(jié)構(gòu)中，各個(gè)同心環(huán)的內(nèi)徑和外徑之間的差異等于光柵周期的約一半。各個(gè)連續(xù)的環(huán)的內(nèi)徑大于前面的環(huán)的內(nèi)徑約一個(gè)光柵周期。 同心環(huán)圖案延伸至覆蓋單個(gè)傳感器位置-比如陣列點(diǎn)或微量滴定板孔。各個(gè)單獨(dú)的微陣列點(diǎn)或微量滴定板孔具有位于其中心的單獨(dú)的同心環(huán)圖案。這種結(jié)構(gòu)的所有偏振方向具有相同的截面分布。必須精確地照射在同心環(huán)結(jié)構(gòu)中心以保持偏振獨(dú)立性。同心環(huán)結(jié)構(gòu)的光柵周期小于共振反射的光的波長(zhǎng)。光柵周期為約0.01微米到約1微米。光柵深度為約0.01 到約1微米。在另一實(shí)施方案中，孔或柱的陣列排列為緊密地近似于上述同心圓結(jié)構(gòu)，無(wú)需照明束在柵格的任何特別位置居于中心。這樣的陣列圖案通過(guò)在表面上以相等角度從三個(gè)方向入射的三個(gè)激光束的光學(xué)干涉而自動(dòng)產(chǎn)生。在這個(gè)圖案中，孔(或柱)在密堆積六邊形陣列的角上位于中心?？谆蛑泊嬖谟诟鱾€(gè)六邊形的中心。這樣的孔或柱的六角形柵格具有“看得到”相同截面分布的三個(gè)偏振方向。因此，該六角形柵格結(jié)構(gòu)使用任何偏振角的光提供相同的共振反射光譜。因此，不需要偏振濾光器除去不需要的反射信號(hào)組分?？谆蛑闹芷诳梢允羌s0.01微米到約1微米且深度或高度可以是約0. 01微米到約1微米。檢測(cè)系統(tǒng)可以包括比色共振反射生物傳感器、將光導(dǎo)向比色共振反射生物傳感器的光源和檢測(cè)從生物傳感器反射的光的檢測(cè)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用濾光器簡(jiǎn)化讀數(shù)儀器，使得僅超過(guò)確定閾值的正結(jié)果觸發(fā)檢測(cè)。通過(guò)測(cè)量共振波長(zhǎng)在本發(fā)明的比色共振反射生物傳感器的各個(gè)不同位置的移動(dòng)， 可以測(cè)定例如哪個(gè)不同位置上面沉積了生物材料。移動(dòng)的程度可用于測(cè)定例如試樣中的結(jié)合配偶體的量，以及一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)和試樣的結(jié)合配偶體之間的化學(xué)親合性。比色共振反射生物傳感器可以照明兩次。第一次測(cè)量在例如生物傳感器上沒(méi)有生物材料時(shí)測(cè)定生物傳感器的一個(gè)或多個(gè)不同位置的反射光譜。第二次測(cè)量在例如將一種或多種細(xì)胞施用于生物傳感器后測(cè)定反射光譜。這兩次測(cè)量之間的峰波長(zhǎng)差異是生物傳感器上的細(xì)胞的存在或者數(shù)量的量度。這種照明方法可以控制生物傳感器表面中的小缺陷，這些小缺陷可以引起在峰共振波長(zhǎng)中具有輕微變化的區(qū)域。該方法也可控制生物傳感器上的細(xì)胞物質(zhì)的變化的濃度或密度。生物傳感器的表面進(jìn)行一種或多種配體在生物傳感器上的固定，使得配體不會(huì)被任何漂洗程序洗掉，從而配體和試樣中的結(jié)合配偶體的結(jié)合不受生物傳感器表面妨礙。一種或多種配體可以通過(guò)物理吸附(即，不使用化學(xué)連接物)或通過(guò)化學(xué)結(jié)合(即，使用化學(xué)連接物)以及電化學(xué)結(jié)合、靜電結(jié)合、疏水結(jié)合和親水結(jié)合而附著于生物傳感器表面?；瘜W(xué)結(jié)合可以在生物傳感器表面上產(chǎn)生較強(qiáng)的配體附著并提供表面結(jié)合的分子的限定的取向和構(gòu)造。配體也可通過(guò)特異性結(jié)合物質(zhì)(比如核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、含有來(lái)自組合化學(xué)庫(kù)(combinatorial chemical library)的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有機(jī)分子、病毒、聚合物或生物樣品)特異性地和生物傳感器表面結(jié)合，其中該特異性結(jié)合物質(zhì)固定于生物傳感器的表面。此外，配體可以排列于生物傳感器表面上的一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列中，所述表面存在于多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔內(nèi)并組成多孔板或微陣列的一個(gè)或多個(gè)表面。配體的陣列包括微孔板內(nèi)的生物傳感器表面上的一種或多種配體，從而表面含有一個(gè)或多個(gè)不同位置，每個(gè)具有不同配體。例如，陣列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000或更多的不同位置。因此，多孔板或微陣列的各個(gè)孔可在其內(nèi)部具有和該多孔板的其它孔分離的一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列，這允許多個(gè)不同樣品在一個(gè)多孔板上被處理。在任何一個(gè)孔內(nèi)的陣列(一個(gè)或多個(gè))可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可見(jiàn)的陣列(一個(gè)或多個(gè))相同或不同。將配體固定于生物傳感器表面也可通過(guò)和例如下列官能連接物結(jié)合而起作用 鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有機(jī)磷酸鹽基、脂基、磷脂基或類(lèi)固醇基。此外，配體可以通過(guò)物理吸附、化學(xué)結(jié)合、電化學(xué)結(jié)合、靜電結(jié)合、疏水結(jié)合或親水結(jié)合，以及免疫捕獲 (immunocapture)方法而固定于生物傳感器表面上。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，生物傳感器可以涂有連接物，比如，例如，鎳基、胺基、醛基、酸基、烷基、烯基、炔基、芳基、醇基、醚基、酮基、酯基、酰胺基、氨基酸基、硝基、氰基、糖基、硫醇基、有機(jī)磷酸鹽基、脂基、磷脂基或類(lèi)固醇基。例如，胺表面可用于附著幾種連接物分子而醛表面可用于直接結(jié)合蛋白，無(wú)需另外的連接物。鎳表面可用于結(jié)合具有并入的組氨酸(“his”)標(biāo)簽的分子。用鎳活化的表面檢測(cè)“his-標(biāo)簽”的分子在本領(lǐng)域是公知的(Whitesides，Anal. Chem. 68，490，(1996))。連接物、配體和特異性結(jié)合物質(zhì)可以固定于生物傳感器的表面上，使得各個(gè)孔具有固定于其中的相同的連接物、配體和/或特異性結(jié)合物質(zhì)?；蛘?，各個(gè)孔可以含有連接物、配體和/或特異性結(jié)合物質(zhì)的不同組合。配體可以特異性地或非特異性地和固定于生物傳感器表面上的連接物或特異性結(jié)合物質(zhì)結(jié)合?；蛘撸飩鞲衅鞯谋砻婵刹痪哂羞B接物或特異性結(jié)合物質(zhì)且配體可以非特異性地和生物傳感器表面結(jié)合。進(jìn)行一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)或連接物在生物傳感器上的固定，使得特異性結(jié)合物質(zhì)或連接物不會(huì)被漂洗程序洗掉，從而它和試樣中的配體的結(jié)合不受生物傳感器表面妨礙。對(duì)于特異性結(jié)合物質(zhì)共價(jià)附著到例如用于多種類(lèi)型的微陣列和生物傳感器中的玻璃，已實(shí)施了幾種不同類(lèi)型的表面化學(xué)策略。這些相同的方法可以容易地適應(yīng)本發(fā)明的生物傳感器。表面制備生物傳感器，以便它含有用于結(jié)合一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的正確的官能團(tuán)，是生物傳感器制造方法的整體部分。一種或多種特異性配體可以通過(guò)物理吸附(即，不使用化學(xué)連接物)或通過(guò)化學(xué)結(jié)合(即，使用化學(xué)連接物)以及電化學(xué)結(jié)合、靜電結(jié)合、疏水結(jié)合和親水結(jié)合而附著于生物傳感器表面?；瘜W(xué)結(jié)合可以產(chǎn)生配體在生物傳感器表面上的較強(qiáng)附著，并提供表面結(jié)合的分子的限定的取向和構(gòu)造。配體固定到塑料、環(huán)氧樹(shù)脂或高折射率材料可以基本上如對(duì)于固定到玻璃所描述的那樣進(jìn)行。然而，可以除去酸洗步驟，其中這種處理會(huì)損壞固定了特異性結(jié)合物質(zhì)的材料。配體配體是和另一個(gè)分子結(jié)合的分子。配體和特異性結(jié)合物質(zhì)是相似的術(shù)語(yǔ)。配體可以是，例如，核酸、肽、細(xì)胞外基質(zhì)配體(參見(jiàn)表1)、蛋白溶液、肽溶液、單鏈或雙鏈DNA溶液、 RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有來(lái)自組合化學(xué)庫(kù)的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有機(jī)分子、細(xì)胞、病毒、 細(xì)菌、聚合物或生物樣品。生物樣品可以是例如，血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤的勻漿、滑液、糞便、唾液、痰、囊內(nèi)液、羊水、腦脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、淚液或前列腺液。聚合物選自每分子具有多個(gè)活性位點(diǎn)的長(zhǎng)鏈分子的組，該組由水凝膠、葡聚糖、聚氨基酸和它們的衍生物組成，包括聚賴(lài)氨酸(包括聚-1-賴(lài)氨酸和聚-d-賴(lài)氨酸)、 聚-Phe-賴(lài)氨酸和聚-glu-賴(lài)氨酸。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，配體是細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體。優(yōu)選地，一種或多種配體排列于生物傳感器上的一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列中。 配體的陣列包括本發(fā)明生物傳感器表面上的一種或多種配體，從而表面含有許多不同位置，每個(gè)具有不同配體或具有不同配體數(shù)量。例如，陣列可以包括1、10、100、1，000、10，000 或100，000個(gè)不同的位置。這樣的生物傳感器表面稱(chēng)作陣列，因?yàn)橐粋€(gè)或多個(gè)配體一般在 x-y坐標(biāo)中按規(guī)則的柵格圖案布局。然而，本發(fā)明的陣列可以包括任何類(lèi)型的規(guī)則或不規(guī)則圖案中的一個(gè)或多個(gè)配體。例如，不同的位置可以限定一個(gè)或多個(gè)配體的點(diǎn)的陣列。陣列點(diǎn)的直徑可以是約50到約500微米。陣列點(diǎn)的直徑也可以是約150到約200微米。一種或多種配體可以和它們的特異性受體結(jié)合。本發(fā)明生物傳感器上的陣列可通過(guò)將一種或多種配體的微滴放在例如光柵或覆蓋層表面上的位置的x-y柵格上而產(chǎn)生。當(dāng)生物傳感器暴露于包括一種或多種結(jié)合配偶體的試樣(例如，具有針對(duì)配體的受體的細(xì)胞)時(shí)，結(jié)合配偶體會(huì)被優(yōu)先吸引到微陣列的不同位置上，所述微陣列包括對(duì)該結(jié)合配偶體具有高親合力的配體。這些不同位置中的一些會(huì)將結(jié)合配偶體聚集在它們的表面上，而其它的位置則不會(huì)。配體特異性地和加入本發(fā)明生物傳感器表面的結(jié)合配偶體結(jié)合。配體特異性地和它的結(jié)合配偶體結(jié)合，而基本上不和加入生物傳感器表面的其它結(jié)合配偶體結(jié)合。例如，配體是抗體且它的結(jié)合配偶體是特別的抗原時(shí)，抗體特異性地和該特別的抗原結(jié)合，而基本上不和其它抗原結(jié)合。結(jié)合配偶體可以是，例如，核酸、肽、蛋白溶液、肽溶液、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白受體、整合蛋白(參見(jiàn)表1)、單鏈或雙鏈DNA溶液、RNA溶液、RNA-DNA混合溶液、含有來(lái)自組合化學(xué)庫(kù)的化合物的溶液、抗原、多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體(ScFV)、F(ab)片段、F(ab' )2片段、Fv片段、小有機(jī)分子、細(xì)胞、病毒、細(xì)菌、聚合物或生物樣品。生物樣品可以是，例如，血液、血漿、血清、胃腸分泌物、組織或腫瘤的勻漿、滑液、糞便、唾液、痰、囊內(nèi)液、羊水、腦脊髓液、腹膜液、肺灌洗液、精液、淋巴液、淚液和前列腺液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合配偶體是可以和生物傳感器上固定的配體結(jié)合的受體，其中該受體在細(xì)胞表面上。盡管微量滴定板是用于生物化學(xué)試驗(yàn)的最常見(jiàn)形式，但微陣列作為使一次可測(cè)的生物化學(xué)相互作用數(shù)最大同時(shí)使貴重試劑的量最小的裝置越來(lái)越多見(jiàn)。通過(guò)用微陣列點(diǎn)樣器將配體施用于本發(fā)明生物傳感器上，可以獲得10，000配體/in2的配體密度。通過(guò)聚焦照明束以查詢(xún)(interrogate)單個(gè)微陣列位置，可將生物傳感器用作無(wú)標(biāo)記物微陣列讀數(shù)系統(tǒng)。此外，可將微陣列和微量滴定板實(shí)施方案兩者組合，使得一種或多種配體排列于生物傳感器表面上的一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列中，所述表面存在于微量滴定板的一個(gè)或多個(gè)孔內(nèi)并包括微量滴定板的一個(gè)或多個(gè)表面，優(yōu)選為底表面。配體的陣列包括微量滴定板孔內(nèi)的傳感器表面上的一種或多種配體，從而表面含有一個(gè)或多個(gè)不同位置，每個(gè)具有不同配體或具有不同配體量。例如，陣列可包括1、10、100、1，000、10，000或100，000個(gè)不同位置。因此，微量滴定板實(shí)施方案的各個(gè)孔可在它之內(nèi)具有一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列， 它和微量滴定板實(shí)施方案的其它孔分離，這允許在一個(gè)本發(fā)明微量滴定板上處理多個(gè)不同樣品，每個(gè)單獨(dú)的孔一個(gè)或多個(gè)樣品。在任何一個(gè)孔內(nèi)的陣列(一個(gè)或多個(gè))可以和相同微量滴定板的任何其它微量滴定孔中可見(jiàn)的陣列(一個(gè)或多個(gè))相同或不同。含液體容器本發(fā)明的光柵可以構(gòu)成含液體容器的內(nèi)表面，例如，底表面。含液體容器可以是， 例如，微量滴定板孔、試管、陪替氏培養(yǎng)皿或微流體通道。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是并入到任何類(lèi)型的微量滴定板中的生物傳感器。例如，生物傳感器可以通過(guò)將反應(yīng)容器壁組裝在生物傳感器表面之上而并入微量滴定板的底表面，從而各個(gè)反應(yīng)“點(diǎn)”可以暴露于不同的試樣。因此，各個(gè)單獨(dú)的微量滴定板孔可以充當(dāng)單獨(dú)的反應(yīng)容器。因此，單獨(dú)的化學(xué)反應(yīng)可以在相鄰孔內(nèi)發(fā)生而不混合反應(yīng)流體，且在化學(xué)上不同的試驗(yàn)溶液可施用于單獨(dú)的孔。為了將本發(fā)明的生物傳感器或光柵附著于無(wú)底微量滴定板的底表面，可以使用幾種方法，包括，例如，粘合劑附著、超聲波焊接和激光焊接。用于藥物高通量篩分實(shí)驗(yàn)室、分子生物學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室和診斷試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的最常用試驗(yàn)形式是微量滴定板。這些板是標(biāo)準(zhǔn)尺寸的塑料筒，可含有約2、6、8、24、48、96、384、 1536,3456,9600或更多個(gè)排列在柵格中的單獨(dú)的反應(yīng)容器。由于這些板的標(biāo)準(zhǔn)機(jī)械構(gòu)造， 設(shè)計(jì)了液體分配、自動(dòng)化板處理和檢測(cè)系統(tǒng)以對(duì)該常用形式作用。本發(fā)明的生物傳感器可以并入標(biāo)準(zhǔn)微量滴定板的底表面。因?yàn)樯飩鞲衅鞅砻婵梢砸源竺娣e制造，且因?yàn)樽x數(shù)系統(tǒng)不和生物傳感器表面物理接觸，可以限定任意數(shù)量的單獨(dú)的生物傳感器區(qū)域，這僅受照明光學(xué)裝置的聚焦分辨率和x_y階段(stage)的限制，所述x_y階段跨生物傳感器表面掃描照明/檢測(cè)探針。使用生物傳感器的方法本發(fā)明生物傳感器可用于并行研究一種或許多種配體/結(jié)合配偶體相互作用。一種或多種配體和它們各自的結(jié)合配偶體的結(jié)合，可以通過(guò)將一種或多種結(jié)合配偶體施用至在其表面上固定了一種或多種配體的生物傳感器進(jìn)行檢測(cè)，而不使用標(biāo)記物。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種配體是一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體且一種或多種結(jié)合配偶體是細(xì)胞上的受體，其中該受體(例如，整合蛋白)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體是特異性的。 用光照明生物傳感器，并檢測(cè)來(lái)自生物傳感器光的反射波長(zhǎng)的最大值或透射波長(zhǎng)的最小值。從基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器檢測(cè)信號(hào)，并按照和比色共振反射生物傳感器相似的方式彼此相比或和對(duì)照相比。本文描述的所有試驗(yàn)或方法可以在比色共振反射生物傳感器和基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器上進(jìn)行。如果一種或多種配體已經(jīng)和它們各自的結(jié)合配偶體結(jié)合，則和一種或多種配體未與它們各自的結(jié)合配偶體結(jié)合的情形相比，光的反射波長(zhǎng)移動(dòng)。 生物傳感器覆蓋有含一種或多種配體的一個(gè)或多個(gè)不同位置的陣列時(shí)，則從生物傳感器的各個(gè)不同位置檢測(cè)光的反射波長(zhǎng)的最大值或透射波長(zhǎng)的最小值。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，多種配體(例如，ECM配體)可以以陣列形式固定在本發(fā)明生物傳感器上。然后將該生物傳感器和包括結(jié)合配偶體(比如帶有ECM配體受體 (例如整合蛋白或粘著斑蛋白)的細(xì)胞)的關(guān)注的試樣接觸。僅有特異性地和配體結(jié)合的細(xì)胞固定于生物傳感器上。一旦結(jié)合，這些細(xì)胞響應(yīng)于刺激源，不像未結(jié)合的細(xì)胞。不需要使用酶或熒光標(biāo)記物。對(duì)于高通量應(yīng)用，生物傳感器可以排列于陣列的陣列中，其中將包括特異性結(jié)合物質(zhì)的陣列的幾個(gè)生物傳感器排列在陣列中。這種陣列的陣列可以，例如，浸入微量滴定板以一次進(jìn)行許多試驗(yàn)。在另一實(shí)施方案中，生物傳感器可以存在于纖維探針端質(zhì)的體內(nèi)檢測(cè)。或者，可將細(xì)胞和ECM配體混合，或者作為細(xì)胞和ECM的混合物取得然后加入生物傳感器表面。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案允許直接檢測(cè)細(xì)胞變化，比如細(xì)胞生長(zhǎng)模式、細(xì)胞死亡模式的變化、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的變化、細(xì)胞尺寸或體積的變化或細(xì)胞粘著的變化，因?yàn)樗鼈儗?shí)時(shí)存在于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器且不需要并入或者不受輻射測(cè)量、比色或熒光標(biāo)記物(盡管需要的話可以使用標(biāo)記物)的干擾。隨著細(xì)胞被擾亂，可以檢測(cè)到細(xì)胞性能和形態(tài)的變化。然后可以使用高速、高分辨率儀器(比如BIND Scanner (BP, 比色共振反射生物傳感器系統(tǒng)))實(shí)時(shí)檢測(cè)細(xì)胞變化，并使用相應(yīng)算法定量化數(shù)據(jù)。參見(jiàn)， 例如，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，951，715和美國(guó)專(zhuān)利公開(kāi)2004/01516 。通過(guò)組合該方法、儀器操作和計(jì)算分析，可以以無(wú)標(biāo)記物的方式便利地實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞行為(即，在細(xì)胞響應(yīng)于刺激源瞬間以及在細(xì)胞響應(yīng)于刺激源的同時(shí)隨著時(shí)間便利且方便地觀察并定量細(xì)胞反應(yīng))。比色共振反射生物傳感器，比如SRU Biosystems, Inc. BIND 技術(shù)(Woburn，ΜΑ) 具有從納米規(guī)模生物學(xué)系統(tǒng)測(cè)量關(guān)于大量附著的表面變化的能力。應(yīng)用和方法(其中比色共振反射生物傳感器在之前已實(shí)施)已隨儀器分辨率改進(jìn)而變化。之前，附著于比色共振反射生物傳感器表面的細(xì)胞數(shù)量的測(cè)量是首要目標(biāo)。然而，在觀看細(xì)胞的一些較差分辨率圖像時(shí)，注意到對(duì)于占據(jù)的像素?cái)?shù)、信號(hào)/像素的強(qiáng)度、每個(gè)像素的PWV變化等，細(xì)胞給出有差別的信號(hào)。在設(shè)法減小這些數(shù)據(jù)的變化性時(shí)，以下變得清晰變化性在于單獨(dú)的細(xì)胞內(nèi)， 且它們的有差別的形態(tài)響應(yīng)于刺激源。為了進(jìn)一步研究這些細(xì)胞活動(dòng)，構(gòu)造了更高分辨率版本的BIND Scanner (即，比色共振反射生物傳感器系統(tǒng))。該掃描器具有比之前使用的掃描器更高分辨率的透鏡。這些透鏡具有約2-5、2-10、2-15、2-20、2-50、2-100、2-200或 2-300微米的分辨率。另外，開(kāi)發(fā)了以更好的分辨率實(shí)時(shí)分析細(xì)胞變化的方法。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供檢測(cè)細(xì)胞遷移和趨化性的方法。特別地，細(xì)胞可以在孔內(nèi)，或者在陣列形式中，生長(zhǎng)在比色共振反射光學(xué)生物傳感器的一端上。通過(guò)使用半透膜或微流體通道，含有細(xì)胞的生物傳感器的端部可以任選地和放置了趨化性劑的相對(duì)端分離。然后可以使用由成像光譜儀，或者可以移動(dòng)以從生物傳感器的多個(gè)位置讀取的光纖探針?biāo)M成的檢測(cè)系統(tǒng)以檢測(cè)細(xì)胞的位置，并繼而允許計(jì)算細(xì)胞遷移速度。本發(fā)明的另一實(shí)施方案提供檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)模式的變化的方法。簡(jiǎn)單地說(shuō)，細(xì)胞可以生長(zhǎng)在比色共振反射光學(xué)生物傳感器上；檢測(cè)PWV ；將試驗(yàn)試劑施用于細(xì)胞；檢測(cè)PWV ； 并比較初始PWV和后續(xù)PWV，其中初始PWV相對(duì)于后續(xù)PWV之間的差異指示細(xì)胞生長(zhǎng)模式的變化。PWV的差異與細(xì)胞生長(zhǎng)模式的變化有關(guān)。細(xì)胞生長(zhǎng)模式的變化可以選自細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞粘著、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖和細(xì)胞死亡。一種原核或真核細(xì)胞或者兩種或更多種真核或原核細(xì)胞可以生長(zhǎng)于生物傳感器上。生物傳感器可以包括選自微量滴定孔、微量滴定板、試管、陪替氏培養(yǎng)皿和微流體通道的容器的內(nèi)表面。通過(guò)測(cè)量光的反射波長(zhǎng)的移動(dòng)，本發(fā)明的生物傳感器也能夠從樣品檢測(cè)并定量結(jié)合配偶體的量，所述樣品和界定陣列的一個(gè)或多個(gè)不同位置結(jié)合。例如，可將一個(gè)或多個(gè)不同位置的波長(zhǎng)移動(dòng)和其它不同位置的正和負(fù)對(duì)照相比，以測(cè)定結(jié)合的特異性結(jié)合物質(zhì)的量。重要地，許多這樣的一個(gè)或多個(gè)不同位置可以排列于生物傳感器表面上，且生物傳感器可以包括容器(比如約2、6、8、24、48、96、384、1536、3456、9600或更多孔的微量滴定板)的內(nèi)表面。舉例來(lái)說(shuō)，96個(gè)生物傳感器附著于固定器且各個(gè)生物傳感器包括約100個(gè)不同位置時(shí)，可以同時(shí)進(jìn)行約9600個(gè)生物化學(xué)試驗(yàn)。檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)系統(tǒng)可以包括生物傳感器、將光導(dǎo)向生物傳感器的光源和檢測(cè)從生物傳感器反射的光的檢測(cè)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，可通過(guò)使用濾光器簡(jiǎn)化讀數(shù)儀器，使得僅超過(guò)確定閾值的正結(jié)果觸發(fā)檢測(cè)。光源可以從比色共振反射生物傳感器頂面(即，固定了一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的表面)對(duì)其照明，或從其底面照明。通過(guò)測(cè)量本發(fā)明生物傳感器的各個(gè)不同位置的共振波長(zhǎng)移動(dòng)，可以確定哪個(gè)不同位置具有和它們結(jié)合的結(jié)合配偶體。移動(dòng)的程度可用于測(cè)定試樣中的結(jié)合配偶體的量以及一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)和試樣的結(jié)合配偶體之間的化學(xué)親合性。生物傳感器可以照明兩次。第一次測(cè)量測(cè)定生物傳感器上固定了一種或多種特異性結(jié)合物質(zhì)的生物傳感器陣列的一個(gè)或多個(gè)不同位置的反射光譜。第二次測(cè)量在將一種或多種結(jié)合配偶體施用于生物傳感器后測(cè)定反射光譜。這兩次測(cè)量之間的峰波長(zhǎng)差異是特異性地和生物傳感器或生物傳感器的一個(gè)或多個(gè)不同位置結(jié)合的結(jié)合配偶體的量的量度。這種照明方法可以控制生物傳感器表面中的小不均勻性，這些小不均勻性可以引起在峰共振波長(zhǎng)中具有輕微變化的區(qū)域。該方法也可控制生物傳感器上固定的特異性結(jié)合物質(zhì)的變化的濃度或分子量。一種用于照明生物傳感器表面和用于收集反射光的檢測(cè)系統(tǒng)是探針，它含有例如和光源連接的六條照明光學(xué)纖維，以及和光譜儀連接的單條收集光學(xué)纖維。纖維的數(shù)量不是關(guān)鍵的，照明或收集纖維的任何數(shù)量都是可能的。纖維排列成束，使得收集纖維位于束中心，且被六條照明纖維圍繞。纖維束的端部和準(zhǔn)直透鏡連接，準(zhǔn)直透鏡將照明聚焦在生物傳感器表面。在這個(gè)探針排列中，照明和收集纖維是肩并肩的。因此，當(dāng)正確地調(diào)節(jié)準(zhǔn)直透鏡以將光聚焦在生物傳感器表面上時(shí)，觀察到六個(gè)清楚界定的圓形照明區(qū)域，和中心暗區(qū)。因?yàn)樯飩鞲衅鞑簧⑸涔?，而是反射?zhǔn)直的光束，因此沒(méi)有光入射到收集纖維上，且觀測(cè)不到共振信號(hào)。只有使準(zhǔn)直透鏡散焦直到六個(gè)照明區(qū)域重疊進(jìn)入中心區(qū)域，才有任何光反射進(jìn)入收集纖維。因?yàn)橹挥猩⒔箷r(shí)，稍微非準(zhǔn)直的光才可以產(chǎn)生信號(hào)，生物傳感器不以單個(gè)入射角照明，而是以一定范圍的入射角照明。入射角的范圍引起共振波長(zhǎng)的混合。因此，測(cè)量到比另外可能的共振峰更寬的共振峰。因此，希望照明和收集纖維探針在空間上分享相同的光程。可使用幾種方法協(xié)同定位(co-locate)照明和收集光程。例如，在第一端和光源(它將光導(dǎo)向生物傳感器)連接的單條照明纖維，和在第一端和檢測(cè)器(它檢測(cè)從生物傳感器反射的光)連接的單條收集纖維，可以各自在它們的第二端連接第三纖維探針，第三纖維探針既可以充當(dāng)照明器也可以充當(dāng)收集器。第三纖維探針和生物傳感器成法向入射角取向并支持反傳播 (counter-propagating) M明并反射光/[言號(hào)另一個(gè)檢測(cè)方法包括使用光束分離器，它使單條照明纖維(其和光源連接)以和收集纖維(其和檢測(cè)器連接)成90度角取向。光通過(guò)照明纖維探針導(dǎo)入光束分離器，光束分離器將光導(dǎo)向生物傳感器。反射光導(dǎo)回到光束分離器，光束分離器將光導(dǎo)入收集纖維探針。光束分離器使照明光和反射光在光束分離器和生物傳感器之間共享共同的光程，所以不散焦也可以使用完美準(zhǔn)直的光。角掃描本發(fā)明的檢測(cè)系統(tǒng)基于生物傳感器表面的準(zhǔn)直白光照明和反射光束的共振峰的光學(xué)光譜學(xué)測(cè)量。生物傳感器表面上的分子結(jié)合通過(guò)峰波長(zhǎng)值的移動(dòng)而指示，同時(shí)波長(zhǎng)增大相當(dāng)于分子吸收增大。如理論模擬和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所示，共振峰波長(zhǎng)強(qiáng)烈依賴(lài)于檢測(cè)光束的入射角。由于共振峰波長(zhǎng)的角依賴(lài)性，入射的白光需要良好準(zhǔn)直。光束的角分散使共振峰變寬，并減小生物傳感器檢測(cè)靈敏度。另外，來(lái)自光譜測(cè)量的信號(hào)質(zhì)量取決于光源的功率和檢測(cè)器的靈敏度。 為了獲得高信噪比，對(duì)于每個(gè)檢測(cè)位置可能需要非常長(zhǎng)的積分時(shí)間，因此延長(zhǎng)生物傳感器板讀數(shù)的整個(gè)時(shí)間?？蓪⒖烧{(diào)激光源用于光柵共振的檢測(cè)，但是昂貴。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，這些劣勢(shì)通過(guò)使用用于生物傳感器照明的激光束， 和用于反射光束功率測(cè)量的光檢測(cè)器而克服。可以使用掃描鏡裝置改變激光束的入射角，并使用光學(xué)系統(tǒng)維持入射激光束的準(zhǔn)直。參見(jiàn)，例如，“Optical kanning(光學(xué)掃描)”(Gerald F. Marchall編，Marcel Dekker (1991)。任何類(lèi)型的激光掃描均可使用。例如，可以以約2線到約1，000線每秒的速率產(chǎn)生掃描線的掃描裝置可用于本發(fā)明。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，掃描裝置以約50線到約300線每秒掃描。在一個(gè)實(shí)施方案中，反射光束穿過(guò)激光掃描光學(xué)系統(tǒng)的一部分，并通過(guò)單個(gè)光檢測(cè)器測(cè)量。激光源可以是波長(zhǎng)為例如780nm、785nm、810nm或830nm的二極管激光器。諸如這些的激光二極管在最高150mW的功率水平下易于獲得，且它們的波長(zhǎng)相當(dāng)于Si光電二極管的高靈敏度。因此檢測(cè)器可以基于光電二極管生物傳感器。光源提供光給掃描器裝置， 它將光導(dǎo)入光學(xué)系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)將光導(dǎo)入生物傳感器。光從生物傳感器反射到光學(xué)系統(tǒng)， 然后它將光導(dǎo)入光信號(hào)檢測(cè)器。在一個(gè)實(shí)施方案中，隨著掃描鏡改變它的角位置，激光束在表面上的入射角在名義上以鏡角位移的兩倍變化。掃描鏡裝置可以是線性電流計(jì)，在約2Hz 到最高約120Hz的頻率下，和約10度到約20度的機(jī)械掃描角下工作。在該實(shí)例中，單次掃描可在約10毫秒內(nèi)完成。也可使用共振電流計(jì)或多邊形掃描器。用于角掃描的簡(jiǎn)單光學(xué)系統(tǒng)可以由一對(duì)透鏡組成，它們之間具有共同焦點(diǎn)。光學(xué)系統(tǒng)可以設(shè)計(jì)成，為了激光準(zhǔn)直和反射光束的收集而實(shí)現(xiàn)最佳性能。角分辨率取決于電流計(jì)規(guī)格和反射光采樣頻率。假設(shè)電流計(jì)機(jī)械分辨率為30弧秒，相應(yīng)的生物傳感器角掃描分辨率為60弧秒，即0. 017度。另外，假設(shè)采樣速率為100千樣品/秒，且在10毫秒內(nèi)掃描20度。結(jié)果，量化步長(zhǎng)(quantization step)為1000樣品 20 度，艮口每樣品 0. 02 度。在這個(gè)實(shí)例中，如 Peng 禾口 Morris (Experimental demonstration of resonant anomalies in diffraction from two-dimensional gratings ( ^^T^fllttT 射中的共振異常的實(shí)驗(yàn)演示)，Optics Lett. ,21 :549(1996))所示，0. 2度的共振峰寬度將被10個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)覆蓋，每一個(gè)相當(dāng)于檢測(cè)系統(tǒng)的分辨率。這樣的檢測(cè)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)包括通過(guò)激光束的優(yōu)良的入射光準(zhǔn)直、由激光二極管的高光束功率引起的高信噪比、由單元素光檢測(cè)器代替光譜儀引起的低成本和由角掃描引起的共振峰高分辨率。細(xì)胞粘著和細(xì)胞響應(yīng)試驗(yàn)
整合蛋白是和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相互作用的細(xì)胞表面受體并調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。整合蛋白對(duì)細(xì)胞支架組織、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)、細(xì)胞和整合蛋白親合力的調(diào)節(jié)、細(xì)胞和病毒的附著、細(xì)胞和其它細(xì)胞或ECM的附著負(fù)責(zé)。整合蛋白也對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)負(fù)責(zé)，轉(zhuǎn)導(dǎo)是細(xì)胞借此在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間將一種信號(hào)或刺激轉(zhuǎn)化成另一種的過(guò)程。整合蛋白可以轉(zhuǎn)導(dǎo)從 ECM到細(xì)胞的信息和從細(xì)胞到其它細(xì)胞(例如，通過(guò)其它細(xì)胞上的整合蛋白)或到ECM的信息。整合蛋白和它們的ECM配體的列表可見(jiàn)于Takada等人，Genome Biology 8 :215(2007), 如表1所示。表1
整合蛋白ECM配體αιβι層粘連蛋白、膠原蛋白α2βι層粘連蛋白、膠原蛋白、凝血酶敏感蛋白(thrombospondin)、E-鈣粘著蛋白、肌腱蛋白(tenascin)α3βι層粘連蛋白、凝血酶敏感蛋白、uPARθ4β 凝血_感蛋白、MadCAM-1、VCAM-I,纖連蛋白、 白、ADAM、 ICAM-4α5βι纖連蛋白、骨 白、肌原纖維蛋白、凝血_感蛋白、ADAM、COMP> Llα^βι層粘連蛋白、凝血酶敏感蛋白、ADAM、Cyr61α βι層粘連蛋白α8βι肌腱蛋白、纖連蛋白、骨 白、玻連蛋白、LAP-TGF-β、腎連蛋白 (nephronectin)α9βι肌腱蛋白、VCAM-1、骨M·白、uPAR、纖溶酶(plasmin)、血管抑素 (angiostatin)、ADAM、VEGF-C、VEGF-Dαιοβι層粘連蛋白、膠原蛋白απβι膠原蛋白ανβιLAP-TGF-β,纖連蛋白、骨 白、LlOtLp2ICAM、ICAM-4αΜβ2ICAM、iC3b、因子X(jué)、纖維蛋白原、ICAM-4、肝素αΧβ2ICAM、iC3b、纖維蛋白原、ICAM-4、肝素、膠原蛋白α β2ICAM、VCAM-I、纖維蛋白原、纖連蛋白、玻連蛋白、Cyr61、纖溶酶原aiibP3纖維蛋白原、凝血_感蛋白、纖連蛋白、玻連蛋白、vWF、Cyr權(quán)利要求
1.細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)方法，其包括(a)(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述細(xì)胞加入所述生物傳感器；或( )將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(b)將所述細(xì)胞暴露于刺激源；和(d)檢測(cè)所述細(xì)胞對(duì)所述刺激源的響應(yīng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述刺激源是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
3.權(quán)利要求1的方法，其中(a)的細(xì)胞處于無(wú)血清培養(yǎng)基中。
4.權(quán)利要求1的方法，其中和檢測(cè)方法中不包括一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的方法相比，細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)增大。
5.用于試驗(yàn)的細(xì)胞的制備方法，其包括(a)用缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞；(b)從所述細(xì)胞除去所述缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液；(c)將等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑加入所述細(xì)胞；(d)用緩沖鹽水溶液中和所述等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑；(e)用緩沖鹽水溶液洗滌所述細(xì)胞；(f)將所述細(xì)胞加到生物傳感器表面并使所述細(xì)胞附著于生物傳感器的表面。
6.權(quán)利要求5的方法，其中在粘著調(diào)節(jié)劑的存在下將所述細(xì)胞加入所述生物傳感器表
7.權(quán)利要求5的方法，其中所述生物傳感器表面具有固定于其的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體，或者，其中在將所述細(xì)胞加到生物傳感器表面前，將所述細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外配體混合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中檢測(cè)所述細(xì)胞和所述細(xì)胞外基質(zhì)配體的結(jié)合。
9.細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)方法，其包括(a)用緩沖鹽水溶液洗滌所述細(xì)胞；(b)(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述細(xì)胞加入所述生物傳感器；或( )將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(c)將所述細(xì)胞暴露于刺激源；和(d)檢測(cè)所述細(xì)胞對(duì)所述刺激源的響應(yīng)。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在步驟(a)之前，進(jìn)行下列步驟(i)用缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液洗滌細(xì)胞；(ii)從所述細(xì)胞除去所述缺乏鈣和鎂的緩沖鹽水溶液；(iii)將等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑加入所述細(xì)胞；(iv)用緩沖鹽水溶液中和所述等滲的乙二胺四乙酸鹽螯合劑。
11.權(quán)利要求9的方法，其中在粘著調(diào)節(jié)劑的存在下將所述細(xì)胞加入所述生物傳感器表面。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述刺激源是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
13.測(cè)定試驗(yàn)試劑是否影響細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的方法，其包括(a)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體固定于微量滴定板的孔底部，其中所述孔底部包括比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器，且其中所述孔具有微流體通道，所述微流體通道可將試驗(yàn)試劑遞送至該孔內(nèi)的一個(gè)位置；(b)將具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白配體特異性的細(xì)胞表面受體的細(xì)胞加入所述孔；(c)使用所述微流體通道將試驗(yàn)試劑遞送至所述孔；其中所述試驗(yàn)試劑是疑似趨化劑；(d)檢測(cè)所述細(xì)胞在所述孔中的運(yùn)動(dòng)，其中如果檢測(cè)到所述細(xì)胞在所述孔中的運(yùn)動(dòng)，則所述試驗(yàn)試劑影響所述細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述試驗(yàn)試劑是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、 β-抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
15.測(cè)定試驗(yàn)化合物是否影響細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)配體的特異性結(jié)合的方法，包括(a)將第一細(xì)胞加入第一比色共振反射生物傳感器表面或第一基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述生物傳感器表面包括固定的細(xì)胞外基質(zhì)配體，其中所述第一細(xì)胞具有對(duì)所述細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體，使所述第一細(xì)胞附著于所述第一生物傳感器的表面，和對(duì)所述第一細(xì)胞測(cè)定峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；(b)將第二細(xì)胞加入第二比色共振反射生物傳感器表面或第二基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述第二生物傳感器表面包括固定的細(xì)胞外基質(zhì)配體，其中所述第二細(xì)胞具有對(duì)所述細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體，將試驗(yàn)化合物加入所述生物傳感器表面，使所述第二細(xì)胞附著于所述生物傳感器的表面，和對(duì)所述第二細(xì)胞測(cè)定峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；和(c)比較對(duì)所述第一細(xì)胞獲得的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)和對(duì)所述第二細(xì)胞獲得的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；其中如果對(duì)所述第二細(xì)胞的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)基本上不同于對(duì)所述第一細(xì)胞的峰波長(zhǎng)值或信號(hào)，則所述試驗(yàn)化合物影響細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)配體的特異性結(jié)合。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述試驗(yàn)化合物是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、 β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
17.實(shí)時(shí)分析細(xì)胞變化的方法，其包括(a)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(b)將細(xì)胞加入所述生物傳感器，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；(c)將所述細(xì)胞暴露于刺激源；和(d)使用分辨率為約2到10微米的檢測(cè)裝置檢測(cè)所述細(xì)胞對(duì)所述刺激源的響應(yīng)。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述刺激源是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述細(xì)胞變化是細(xì)胞生長(zhǎng)模式、細(xì)胞死亡模式、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞尺寸或體積或者細(xì)胞粘著中的變化。
20.檢測(cè)細(xì)胞響應(yīng)變化的方法，其包括(a)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(b)在無(wú)血清培養(yǎng)基中將細(xì)胞加入所述生物傳感器，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；(c)將所述細(xì)胞暴露于刺激源而不洗去所述無(wú)血清培養(yǎng)基；和(d)檢測(cè)所述細(xì)胞對(duì)所述刺激源的響應(yīng)。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述刺激源是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、磷脂酶C、受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子、β -抑制蛋白路徑響應(yīng)、細(xì)胞支架重排、后生信號(hào)或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。
22.比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器表面，其中所述生物傳感器通過(guò)將卵清蛋白或胎牛血清和兩種或更多種細(xì)胞外基質(zhì)配體施用于所述生物傳感器的表面并將所述生物傳感器的表面干燥而制備。
23.影響細(xì)胞粘著的化合物的識(shí)別方法，其包括(a)(i)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述細(xì)胞加入所述生物傳感器；或( )將細(xì)胞和一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體混合，其中所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；和將所述帶有一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體的細(xì)胞加入比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(b)用試驗(yàn)化合物處理所述細(xì)胞；(c)檢測(cè)比色共振反射光學(xué)的第一PWV或信號(hào)，并將所述第一 PWV或信號(hào)和來(lái)自未用所述試驗(yàn)化合物處理的對(duì)照細(xì)胞的第二 PWV或信號(hào)比較，以測(cè)定所述試驗(yàn)化合物是否影響所述細(xì)胞的粘著。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述試驗(yàn)化合物是調(diào)節(jié)以下的活性的化合物G蛋白-偶合的受體、離子通道、P13激酶、瞬時(shí)受體電勢(shì)通道或磷脂酶C。
25.權(quán)利要求23的方法，其中在(b)后將粘著調(diào)節(jié)劑加入所述細(xì)胞，其中所述對(duì)照細(xì)胞也用所述粘著調(diào)節(jié)劑處理。
26.影響細(xì)胞粘著的經(jīng)修飾的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)配體的識(shí)別方法，包括(a)將細(xì)胞施用于比色共振反射光學(xué)生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中將經(jīng)修飾的ECM配體固定于所述生物傳感器的表面；(b)將粘著調(diào)節(jié)劑加入所述細(xì)胞；(c)對(duì)所述細(xì)胞檢測(cè)比色共振反射光學(xué)的第一PWV或信號(hào)，并將所述第一PWV或信號(hào)和來(lái)自對(duì)照細(xì)胞的第二 PWV或信號(hào)比較，所述對(duì)照細(xì)胞加到比色共振反射光學(xué)生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，其中將未經(jīng)修飾的ECM配體固定于所述生物傳感器的表面，以測(cè)定所述試驗(yàn)化合物是否影響細(xì)胞粘著。
27.測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞是否生產(chǎn)重組蛋白的方法，其包括(a)將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面；(b)將細(xì)胞加到所述生物傳感器的表面，所述細(xì)胞已用編碼重組蛋白的核酸分子轉(zhuǎn)染且具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體；(c)對(duì)所述細(xì)胞測(cè)定第一PWV或信號(hào)；(e)加入調(diào)節(jié)劑，和不表達(dá)所述重組蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，所述調(diào)節(jié)劑在表達(dá)所述重組蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞中引起差別響應(yīng)；(e)對(duì)所述細(xì)胞測(cè)定第二PWV或信號(hào)；(f)比較第一峰波長(zhǎng)值或信號(hào)和第二峰波長(zhǎng)值或信號(hào)；其中如果第二峰波長(zhǎng)值或信號(hào)基本上不同于第一峰波長(zhǎng)值或信號(hào)，則所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)所述重組蛋白。
全文摘要
提供了不使用檢測(cè)標(biāo)記物而檢測(cè)細(xì)胞中變化的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞對(duì)刺激源的響應(yīng)的檢測(cè)包括將一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體固定于比色共振反射生物傳感器或基于光柵的波導(dǎo)生物傳感器的表面，和將細(xì)胞加入所述生物傳感器，所述細(xì)胞具有對(duì)所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)配體特異性的細(xì)胞表面受體。在將刺激源引入該生物傳感器之前和之后，通過(guò)該生物傳感器檢測(cè)細(xì)胞中的變化。
文檔編號(hào)G01N33/543GK102317781SQ200980157219
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2009年12月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月15日
發(fā)明者B·T·坎寧安, L·萊恩, R·沃納, R·費(fèi)爾南德斯 申請(qǐng)人:Sru生物系統(tǒng)公司