專利名稱：核酸,多肽,以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞凋亡-特異性真核生物起始因子-5A (elF-5A)和 脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽，以及使用 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡屬于基因程序性細(xì)胞事件，其特征在于通過(guò)明確的形態(tài)學(xué) 特征，如細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)凝聚，核斷裂，以及膜起泡。Kerr等(1972) 5八/. Ca/7cer， 26， 239-257; Wyllie等(1980) /"L ， 68， 251-306。它在正常組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面起著重要的作用， 細(xì)胞凋亡程序的缺損被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致從神經(jīng)變性及自身免疫性疾病到腫 瘤的多種人類疾病。Thompson (1995) i^/e/jce， 267， 1456-1462; Mullauer等(2001) M/"L Aes， 488， 211-231。雖然已經(jīng)詳細(xì)描 述過(guò)凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征，但卻剛剛開始闡述調(diào)節(jié)這一過(guò)程的分子 途徑。被認(rèn)為在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用的其中一類蛋白是半胱氨酸蛋 白酶家族，其也被稱作天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)， 它似乎是絕大多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑所需的。Creagh & Martin (2001) "/oc力e邁.rra/ ;y， 29， 696-701 ; Dales等 (2001) Z7邁/7力0巡a， 41， 247-253。天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶引發(fā)細(xì) 胞凋亡來(lái)應(yīng)答由于剪切各種細(xì)胞蛋白所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡刺激物，從而 導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的典型表現(xiàn)形式，包括細(xì)胞皺縮，膜起泡和DNA斷裂。 Chang & Yang (2000)析cr^/o人勘人A/o人， 64， 821-846。促細(xì)胞凋亡蛋白，如Bax或Bak也可釋放天門冬氨酸特異性半胱 氨酸蛋白酶活化分子，如線粒體細(xì)胞色素c，由此通過(guò)細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì) 胞死亡而在細(xì)胞凋亡途徑中發(fā)揮重要作用。Martinou & Green (2001) iVa夂Ce"., 2， 63-67; Zou等(1997) Ce/7， 90， 405-413?？?細(xì)胞凋亡蛋白，如Bcl-2，通過(guò)拮抗促細(xì)胞凋亡蛋白Bax 和Bak的活性而促進(jìn)細(xì)胞存活。Tsujimoto (1998) Ce/2es Ce"s， 3， 697-707; Kroemer (1997) ， 3， 614-620。 Bax:Bcl-2的比例被認(rèn)為是決定細(xì)胞命運(yùn)的其中一種方式；Bax過(guò)量會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋 亡，而Bcl-2過(guò)量則促進(jìn)細(xì)胞存活。Salomons等(1997) /"L /.71, 959-965; Wallace-Brodeur & Lowe (1999) Ce" Z/尸e Sc/. ， 55， 64-75。涉及細(xì)胞凋亡的其它重要蛋白是由腫瘤抑制基因p53編碼的。這種蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)受損且遺傳學(xué)上不穩(wěn)定的細(xì)胞的凋亡的 轉(zhuǎn)錄因子，據(jù)推測(cè)這大概是通過(guò)上調(diào)Bax而達(dá)到的。Bold等(1997) 5W^7c" 0/zco/ow， 6， 133-142; Ronen等，1996; Schuler & Green (2001) 5/oc力e邁.So" 7"ra跌，29， 684-688.， Ryan等(2001) Cwrr.//7. 6W/ A/o入，13， 332-337; Z6rnig等(2 001) A/0c力e瓜A/o/ 力". J"a， 1551， F1-F37。描述正在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞的不同形態(tài)學(xué)特征可產(chǎn)生很多用于確定 細(xì)胞凋亡開始和發(fā)展的方法。可用于其檢測(cè)的凋亡細(xì)胞的其中一個(gè)這 類特征是外轉(zhuǎn)酶的活化，它可導(dǎo)致磷脂酰絲氨酸，即一種通常位于質(zhì) 膜內(nèi)小葉的磷脂的外在化。Fadok等(1992) /. /邁邁i/;^人，l49， 4029-4035。具有外在化磷脂酰絲氨酸的凋亡細(xì)胞可通過(guò)使用與熒光染 料偶聯(lián)的磷脂酰絲氨酸-結(jié)合蛋白，即膜聯(lián)蛋白V染色而檢測(cè)。在細(xì)胞 凋亡過(guò)程中發(fā)生的特征性DNA斷裂可通過(guò)使用熒光素-標(biāo)記的脫氧核苷 酸標(biāo)記DNA片段的暴露3，-0H末端而檢測(cè)。與核酸結(jié)合的熒光染料， 如Hoescht 33258，可用于檢測(cè)凋亡細(xì)胞中的染色質(zhì)凝聚以及核斷裂。 細(xì)胞群中細(xì)胞凋亡的程度還可根據(jù)細(xì)胞提取物中天門冬氨酸特異性半 胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性程度推斷。作為一種遺傳學(xué)確定的過(guò)程，細(xì)胞凋亡像任何其它發(fā)展程序一樣， 也可被突變破壞。據(jù)信細(xì)胞凋亡途徑的改變?cè)诤芏嗉膊∵^(guò)程，包括癌 癥中發(fā)揮著重要的作用。Wyllie等(1980) //zf. C/fo/. ， 68，251-306 ; Thompson (1995) 5We"ce ， 267 ， 1456-1462 ; Sen & D,Incalci (1992)卿"e〃e"， 307， 122-127;McDonnel 1等(1995) 5^邁/z7ars //2 (7s/ cer a/ d A/o/ogy， 6， 53—60。對(duì)癌癥發(fā)生和進(jìn)展的 調(diào)查研究常常集中在細(xì)胞增殖。然而，目前細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生方面 發(fā)揮的重要作用已經(jīng)越來(lái)越明顯。事實(shí)上，自從以恒定改變的方式控 制肺瘤細(xì)胞凋亡后，現(xiàn)在很多有關(guān)細(xì)胞凋亡是什么的問(wèn)題已經(jīng)通過(guò)使用腫瘤模型有所了解。Bold等(1997) 0"co/o^r， 6，133-142。細(xì)胞凋亡可通過(guò)各種信號(hào)在肺瘤發(fā)展過(guò)程中引發(fā)。胞外信號(hào)包括生 長(zhǎng)或存活因子缺失，低氧和電離輻射?？梢l(fā)細(xì)胞凋亡的內(nèi)部信號(hào)包 括產(chǎn)生不適宜增殖信號(hào)的致癌突變，縮短端粒，和DNA損傷。Lowe & Lin (2000) (^rc/aoge/jes/^ 21， 485-495。用于治療惡性肺瘤的電離輻 射和幾乎所有的細(xì)胞毒性化療劑被認(rèn)為是通過(guò)引發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡機(jī) 理，諸導(dǎo)細(xì)胞死亡而發(fā)揮作用的。Rowan & Fisher (1997) Zewie邁/a， 11， 457-465; Kerr等(1994) Ca/ cer， 73, 2013-2026; Martin & Schwartz (1997) Aesearc力，9， l一5。有證據(jù)表明，在癌癥進(jìn)展的早期，腫瘤細(xì)胞對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的試劑 (如電離輻射或化療藥物)較為敏感。然而，由于腫瘤的進(jìn)展，細(xì)胞 會(huì)發(fā)展對(duì)細(xì)胞凋亡刺激物的抗性。Naik等 (1996) Ce/7es a/zd "ere/o/ 邁e/z" 10， 2105-2116。這就可解釋為什么早期癌癥對(duì)治療的 反應(yīng)比更晚期病變要好。晚期癌癥發(fā)生對(duì)化療和放療抗性的能力似乎 與細(xì)胞凋亡途徑的改變有關(guān)，它可限制腫瘤細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞凋亡刺激物 的能力。Reed等(1996) /ow77 a7 o/ (7e7/w7ar A/'o7og/， 60， 23— 32; Meyn等(1996) Ca/ cer We"e『s， 15， 119-131;Ha醒n (1997) "/ood， 89， 1845-1853; Reed (1995) rox/co/ow Ze"e"， 82-83， 155-158; Hickman (1996) ^ro拜/ /。wr/7"" Ca/ cer， 32A， 921-926。對(duì)化療的抗性分別與慢性淋巴細(xì)胞性白血病 和結(jié)腸癌中抗-細(xì)胞凋亡基因bcl-2的過(guò)量表達(dá)和促細(xì)胞凋亡bax基 因的缺失或突變有關(guān)。腫瘤細(xì)胞成功建立播散性轉(zhuǎn)移的能力似乎也與細(xì)胞凋亡途徑的改 變有關(guān)。Bold等(1997) i7/2^/ca/ O/zco/ogy, 6， 133-142。例如， 腫瘤抑制基因p53的突變被認(rèn)為會(huì)在7(^的腫瘤中發(fā)生。Evan等(1995) Ce//. 5io人，7， 825-834。滅活p53的突變可限制細(xì) 胞誘導(dǎo)凋亡、應(yīng)答DM損傷、使細(xì)胞易受進(jìn)一步突變的損害的能力。 Ko & Prives (1996) Ce/2es a/ d Z^e/o/ 邁e/^， 10， 1054-1072。
因此，細(xì)胞凋亡與腫瘤轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)移的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，通過(guò) 對(duì)細(xì)胞凋亡途徑的更好了解，可利用基因療法，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡途徑而產(chǎn)生癌癥治療的新的有效目標(biāo)。Bold等 (1997) 57//^/ca/ < /2C"o^y， 6， 133-142。已知脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸合酶(DHS)以及含有8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸的真核生物翻譯起始因子-5A(elF-5A)在很多細(xì) 胞過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和分化中起著重要的作用。8-羥-2，7，10-三氨 基癸酸， 一種獨(dú)特的氨基酸，可在所有檢驗(yàn)過(guò)的真核生物和古細(xì)菌中 發(fā)現(xiàn)，但在真細(xì)菌中卻沒有發(fā)現(xiàn)，elF-5A是唯一已知的、含有8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的蛋白。Park (1988) /. "/oA 67 e瓜，263， 7447-7449; Schiimann & Klink (1989) 柳厶紙ro6/o人，11， 103-107; Bartig等(1990)加fe邁.柳人， 13， 112-116; Gordon等(1987a) /. A/o人C力e邁.，262， 16585-16589。 活性elF-5A是以兩個(gè)翻譯后步驟形成的第一步是利用脫氧8-羥-2,7，10-三氨基癸酸合酶催化，通過(guò)使亞精胺的4-氨基丁基部分向前 體elF-5A的特異性賴氨酸的oc-氨基轉(zhuǎn)移而形成脫氧8-羥-2， 7, 10-三 氨基癸酸殘基；第二步包括利用脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸羥化酶 使4-氨基丁基部分羥化，形成8-羥-2， 7, 10-三氨基癸酸。物種之間的elF-5A的氨基酸序列較為保守，而且在elF-5A中的 8-羥-2, 7， 10-三氨基癸酸殘基周圍存在的氨基酸序列也是嚴(yán)格保守 的，表明這種修飾對(duì)于存活而言較為重要。Park等 (1993) "/'o尸acfo"， 4， 95-104。這種假設(shè)可進(jìn)一步由下列觀察結(jié)果支持， 即迄今為止，在酵母中發(fā)現(xiàn)的elF5A同種型的失活，或DHS基因(其 催化它們活化中的第一步)的失活，可阻斷細(xì)胞分裂。Schnier等 (1991)Ce/厶A/o人，11， 3105-3114; Sasaki等(1996) Ze〃. ， 384 ， 151-154; Park等 (1998) /. "/o入 C力e邁.，273 ， 1677-1683。然而，酵母中eIF-5A蛋白的缺失僅導(dǎo)致總蛋白合成的少 量降低，表明elF-5A是mRNA特定亞型的翻譯、而不是蛋白全面合成 所需的。Kang等(1993)，"起始因子elF-5A缺失對(duì)細(xì)胞增殖及蛋白 合成的著)響"，Tuite， M. (ed.)，戶rof e/fl a/ t/7^rgef// g//z reaW， NATO Series H。近來(lái)有關(guān)結(jié)合elF-5A的配體共有高度保 守基序的發(fā)現(xiàn)也可支持elF-5A的重要性。Xu&Chen (2001) /. "/o人C力e邁.，276， 2555-2561。此外，人們發(fā)現(xiàn)修飾的elF-5A的8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸殘基對(duì)于特異性結(jié)合RNA的序列較為重要，而且結(jié) 合不會(huì)為核糖核酸酶提供保護(hù)。elF-5A的第一個(gè)cDNA是由Smit McBride等于1989年從人克隆 的，從那以后，又從各種真核生物，包括酵母菌，大鼠，雞胚，苜蓿， 和番茄中克隆出elF-5A的cDNA或基因。SmitMcBride等(1989a) /. "/o厶C力e邁.，264， 1578-1583; Schnier等(1991)(酵母菌)；Sano， A. (1995) Imahori， M.等 (eds) ， /W7a邁i"es, "a"'c a"f/67// /ca/ ~ec"， VNU Science Press, The Netherlands, 81-88 (大鼠)； Rinaudo & Park (1992) F，A/. , 6， A453 (雞胚)；Pay等(1991) "/o厶，17， 927—929 (苜蓿)；Wang等(2001) /. "/o入 (7力e邁.，276， 17541-17549 (番茄)。此外，elF-5A的胞內(nèi)缺失導(dǎo)致特定mRNA在核中大量積聚，表明 eIF-5A可能涉及特定種類的mRNA從核到胞質(zhì)的穿梭。Liu & Tartakoff (1997) Supplement to #o/ecw/ar "/o/og/ o/" f力e 6W7， 8， 426a。摘要第2476， 37th American Society for Cell Biology Annual Meeting。 elF-5A在核孔相關(guān)核內(nèi)絲的積聚及其與通用核輸出 受體的相互作用進(jìn)一步表明，elF-5A是一種核質(zhì)穿梭蛋白，而不是多 核糖體的成分。Rosorius等(1999) / Ce// 5^/e"ce， 112， 2369-2380。elF-5A mRNA的表達(dá)已經(jīng)在各種人類組織和哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中研 究過(guò)。例如，在血清剝奪后，通過(guò)加入血清，已經(jīng)在人成纖維細(xì)胞中 觀察到eIF-5A表達(dá)水平的改變。Pang & Chen (1994) /. Ce〃 戶Am'o/. ， 160， 531-538。脫氧8-羥-2， 7, IO-三氨基癸酸合酶活性 與年齡有關(guān)的降低以及前體eIF-5A的充足已經(jīng)在衰老的成纖維細(xì)胞 中觀察到，盡管如此其反映同種型差異改變平均化的可能性并不確 定。Chen & Chen (1997b) /. Ce"戶力ys/0/. ， 170， 248-254。研究顯示elF-5A可能是病毒蛋白，如人免疫缺陷I型病毒Rev蛋 白和人T細(xì)胞白血病I型病毒Rex蛋白的細(xì)胞靶。Ruhl等(1993)/. 6W"/0人，123， 1309-1320; Katahira等(1995)/. f7ro入，69， 3125-3133。初步研究表明elF-5A可通過(guò)與其它RNA-結(jié)合蛋白，如 Rev相互作用而導(dǎo)向于RNA，表明這些病毒蛋白可募集用于病毒RNA加
工的elF-5A。 Liu等(1997) A/o人57^ ah， 6， 166-174。已知脫氧8-羥-2, 7， 10-三氨基癸酸合酶以及elF-5A在重要的細(xì) 胞過(guò)程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)和衰老中發(fā)揮著重要的作用。例如，在植物中 脫氧8-羥-2， 7, 10-三氨基癸酸合酶表達(dá)的反義降低使葉子和果實(shí)延遲 衰老，表明植物中存在誘導(dǎo)衰老的elF-5A同種型。見W0 01/02592; PCT/US01/44505;美國(guó)申請(qǐng)?zhí)栿?9/909， 796。酵母菌中脫氧8-羥-2， 7, 10-三氨基癸酸合酶或elF-5A基因的失活導(dǎo)致細(xì)胞分裂的抑制。 Schnier等(1991) M 厶Ce/人"/o人，11， 3105-3114; Sasaki等 (1996)卿"e〃. ， 384， 151-154; Park等(1998) /. Ao厶C力e邁.， 273， 1677-1683。亞精胺類似物已經(jīng)成功用于體外抑制脫氧8-羥-2， 7, 10-三氨基癸 酸合酶，并用于體內(nèi)抑制8-羥-2，7，10-三氨基癸酸的形成，還伴有蛋 白合成及細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制。Jakus等(1993) /. A/o/. C力e邁.，268， 13151-13159; Park等(1994) / J/o人C力亂，269， 27827—27832。 多胺自身，特別是腐胺和亞精胺，似乎也在細(xì)胞增殖和分化方面起著 重要的作用。Tabor & Tabor (1984) J/z肌A/ocAe邁.，53， 749-790; Pegg (1988) Ca/2cer We義，48， 759-774。例如，除非提 供外源性多胺，否則其中的多胺生物合成途徑已經(jīng)被阻斷的酵母菌突 變體就不能生長(zhǎng)。Cohn等(1980) /. ， 134， 208-213。多胺還顯示出可保護(hù)細(xì)胞使其不被誘導(dǎo)凋亡。例如，胸腺細(xì)胞凋亡 已經(jīng)通過(guò)與亞精胺和精胺接觸而被阻斷，其機(jī)理似乎是阻礙內(nèi)切核酸 酶活化。Desiderio等(1995) Ce// ^oW力Z 27Te八，6， 505-513; Brune等(1991) ^r/;. (7e" Ae義，195， 323-329。此外，外源性多 胺已經(jīng)顯示出可抑制B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及單細(xì)胞寄生物克魯氏 錐蟲的細(xì)胞凋亡。Nitta等(2001) Aw〃. (7e// We義，265， 174-183) Piacenza等 (2001)#a〃. ， USA， 98，7301-7 306。此外還觀察到低濃度的精胺和亞精胺可減少在新生大鼠正 常發(fā)育過(guò)程中損失的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)，并保護(hù)腦在腦局部缺血過(guò)程中免受 神經(jīng)元損害。Gilad等(1985) Ara/" Ae義，348， 363-366; Gilad& Gilad (1991) ^f77. ， 111， 349-355。多胺還可抑制植物組織的衰老，即一種程序性細(xì)胞死亡形式。亞精胺和腐胺已經(jīng)顯示出可 延遲采摘后的康乃馨花和脫落的小蘿卜葉的衰老。￥&1^& Baker (1980) #or"c/e/2ce， 15， 805-806 (康乃馨花)；Altman(1982)戶/^/o人 戶/a/^. ， 54， 189-193 (脫落的小蘿卜葉)。然而在其它研究中，細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)已經(jīng)在應(yīng)答外源性多胺時(shí)觀察 到。例如，人乳腺癌細(xì)胞系通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而應(yīng)答多胺類似物，且 過(guò)量腐胺已經(jīng)顯示出可誘導(dǎo)DH23A細(xì)胞的凋亡。McCloskey等(1995) (7a/2cer k. ， 55， 3233-3236; Tome等(1997) Ai'oc力e邁./， 328， 847-854。使用多胺進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果全都表明，elF-5A特異性同種型的 存在對(duì)于細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)起著重要的作用。具體而言，該數(shù)據(jù)與存在 由DHS活化的elF-5A的細(xì)胞凋亡特異性同種型的觀點(diǎn)一致。這種DHS 反應(yīng)需要亞精胺的事實(shí)與多胺引起天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白 酶，即一種細(xì)胞凋亡相關(guān)性蛋白水解的關(guān)鍵執(zhí)行者的活化的發(fā)現(xiàn)一 致。Stefanelli等(2000) A/oc力e邁./. ， 347， 875-880; Stefanelli 等(1999) Z^^yZe〃. ， 451， 95-98。在類似的血管中，多胺合成的 抑制劑可延遲細(xì)胞凋亡。Das等(1997) Oz co人， 9， 565-572; Monti等(1998) Z/尸e Jc/. ， 72， 799-806; Ray等(2000) j邁./. 戶力"/o人，278， C480-C489j Packham & Cleveland (1994) #0人 A/o厶，14， 5741-5747。外源性多胺既可抑制又可促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)可由下列事實(shí)解 釋，即根據(jù)所用水平的不同，它們或者抑制導(dǎo)致elF-5A活化的DHS反 應(yīng)，并因此阻礙細(xì)胞凋亡，或者由于毒性誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。低濃度外源 性多胺阻斷植物和動(dòng)物系統(tǒng)細(xì)胞凋亡的發(fā)現(xiàn)與低濃度多胺及其類似物 作為DHS反應(yīng)的竟?fàn)幮砸种苿┑氖聦?shí)一致。事實(shí)上，甚至是作為DHS 反應(yīng)底物的外源性亞精胺也會(huì)通過(guò)底物抑制而阻礙反應(yīng)。Jakus等 (1993) /. "/o厶(7力e/z . ， 268， 13153-13159。然而，所有多胺及其類似物在高濃度時(shí)都是有毒的，并且能夠誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡。盡管它們具有抑制elF-5A的推定細(xì)胞凋亡-特異性同種型 的能力，但該過(guò)程發(fā)生還有兩個(gè)原因。第一，活化elF-5A具有長(zhǎng)半衰 期。Torrelio等 (1987) A/oc力e邁，"/o/7力ys. Co邁邁z//7. ， 145，1335-13化Dou & Chen (1990) A/oc力/瓜A/。M^. ， 1036，128-137。因此，由于抑制脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶活性而 導(dǎo)致的活化的細(xì)胞凋亡特異性elF-5A的缺失可能不能及時(shí)發(fā)生，以阻
斷由亞精胺毒性作用引起的細(xì)胞凋亡。第二，多胺是脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸反應(yīng)的竟?fàn)幮砸种苿?，因此即使在毒性濃度下，也不能?全阻斷該反應(yīng)。本發(fā)明涉及elF-5A cDNA的克隆，其在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之前即時(shí)上 調(diào)。這種細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A很可能是干預(yù)引起疾病狀態(tài)的細(xì)胞 凋亡的適宜目標(biāo)，因?yàn)樗坪蹩梢詤⑴c細(xì)胞凋亡途徑的下游效應(yīng)子和 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)水平發(fā)揮作用。具體而言，細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A似乎可選擇性促進(jìn)編碼細(xì)胞凋亡的下游效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄因子的 mRNA從核易位到胞質(zhì)，它們隨后即被翻譯。引發(fā)細(xì)胞凋亡的最終決定似乎會(huì)阻止內(nèi)部和外部促-和抗-細(xì)胞凋亡信號(hào)之間復(fù)雜的相互作用。 Lowe & Lin (2 000) Csrc/zzoge/^es/s, 21， 485—495。通過(guò)其促進(jìn)下 游細(xì)胞凋亡效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄因子翻譯的能力，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的elF-5A 似乎會(huì)打破這些信號(hào)之間的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。正如前面所述，已經(jīng)確立了抗癌試劑可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而細(xì)胞凋亡 途徑的改變可減弱藥物-i秀導(dǎo)的細(xì)胞死亡。Schmitt & Lowe (1999) /. /^f力o/. ， 187， 127-137。例如，4艮多抗癌藥物都可上調(diào)p53，而且已 經(jīng)失去p53的腫瘤細(xì)胞會(huì)發(fā)生對(duì)這些藥物的抗性。然而，如果劑量充 足，幾乎所有化療劑都可誘導(dǎo)獨(dú)立于p53的細(xì)胞凋亡，表明即使在藥 物-抗性腫瘤中，細(xì)胞凋亡的途徑也未被完全阻斷。Wal lace-Brodeur & Lowe (1999) (7e〃 M 人Z/Z"e Sc/. ， 55， 64-75。這表明細(xì)胞凋亡 elF-5A的誘導(dǎo)，雖然它也許不能校正突變基因，但也許能避開p53-依賴性途徑，并通過(guò)促進(jìn)可替代途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。與細(xì)胞凋亡有關(guān)的elF-5A的誘導(dǎo)具有選擇性導(dǎo)向于癌細(xì)胞的能 力，同時(shí)對(duì)正常的相鄰細(xì)胞具有很小的作用或沒有作用。這種情況的 出現(xiàn)是因?yàn)樵谀[瘤細(xì)胞中表達(dá)的促有絲分裂致癌基因可提供正常細(xì)胞 中不存在的，特異性mRNA種類形式的細(xì)胞凋亡信號(hào)。Lowe等(1993) Ce"， 74， 954-967 ; Lowe & Lin (2000) "rc//70^oe"<y， 21， 485-495。例如，野生型p53在p53突變腫瘤細(xì)胞中的恢復(fù)可直接誘導(dǎo) 細(xì)胞調(diào)亡，并增加腫瘤細(xì)胞系和異種移植物中的藥物敏感性(Spitz 等，1996; Badie等，1998)。細(xì)胞凋亡-elF-5A的選擇性是由介導(dǎo)下游細(xì)胞凋亡效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄 因子從核向胞質(zhì)中易位，從而選擇性促進(jìn)它們的mRNA翻譯而產(chǎn)生的。
因此，為使細(xì)胞凋亡elF-5A具有作用，這些效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄因子的mRNA 必須被轉(zhuǎn)錄。因?yàn)檫@些mRNA在癌細(xì)胞，而不是相鄰的正常細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄， 因此預(yù)期細(xì)胞凋亡elF-5A可促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，但若有的話，對(duì)正常細(xì) 胞的作用極小。因此，具有與細(xì)胞凋亡有關(guān)的elF-5A的腫瘤細(xì)胞凋亡 潛能的恢復(fù)可由于肺瘤細(xì)胞的選擇性導(dǎo)向而降低癌癥患者經(jīng)受的毒性 和副作用。細(xì)胞凋亡elF-5A的誘導(dǎo)還具有加強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)抗癌藥物 反應(yīng)的能力，并由此提高這些試劑抗藥物-抗性腫瘤的有效性。如此可 減少達(dá)到功效所需的抗癌藥物的劑量，并降低對(duì)患者的毒性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供分離和/或純化的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS 的核酸及多肽，以及細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS的反義寡核苷酸 及表達(dá)載體。本發(fā)明還提供分離和/或純化的人elF-5A2 (此處也稱作 增殖elF-5A )。本發(fā)明還提供使用細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS調(diào) 節(jié)細(xì)胞凋亡的方法。


圖1描述大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A 3'末端的核苷酸序列及衍 生氨基酸序列。圖2描述大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDNA 5，末端的核苷酸序列 及衍生氨基酸序列。圖3描述大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A全長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列。圖4描述大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS cDM 3，末端的核苷酸序列及衍生氨基酸序列。圖5是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDNA的全長(zhǎng)核苷酸序列 與人elF-5A的核苷酸序列(登記號(hào)BC000751或NM_001970， SEQ ID NO: 3)的比對(duì)。圖6是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDM的全長(zhǎng)核苷酸序列 與人elF-5A的核苷酸序列(登記號(hào)NM_020390， SEQ ID N0M )的比 對(duì)。圖7是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDNA的全長(zhǎng)核苷酸序列
與小鼠elF-5A的核苷酸序列(登記號(hào)BC003889 )的比對(duì)。小鼠的核 苷酸序列(登記號(hào)BC003889 )為SEQ ID NO: 5。圖8是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的衍生全長(zhǎng)氨基酸序列 與人elF-5A的矛汙生氨基酸序列(登記號(hào)BC000751或NM-001970 )的 比對(duì)。圖9是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的衍生全長(zhǎng)氨基酸序列 與人elF-5A的衍生氨基酸序列(登記號(hào)NM—020390 )的比對(duì)。圖10是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的衍生全長(zhǎng)氨基酸序列 與小鼠elF-5A的衍生氨基酸序列(登記號(hào)BC003889 )的比對(duì)。圖ll是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性DHS cDNA的部分核苷酸序列與 人DHS的核苷酸序列(登記號(hào)BC000333, SEQ ID NO: 8 )的比對(duì)。圖12是大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDNA的限制性酶切圖。圖13是部分大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DNS cDNA的限制性酶切圖。 圖14是使用大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A cDNA的32P-dCTP-標(biāo)記的3'-末端探測(cè)的總RNA的RNA印跡(上圖)和溴化乙錠染色的凝膠(下圖)。圖15是使用大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性DHS cDM的"P-dCTP-標(biāo) 記的3，-末端探測(cè)的總RNA的RNA印跡(上圖)和溴化乙錠染色的凝膠 (下圖)。圖16描述DNA分梯(laddering)實(shí)驗(yàn)，其中超數(shù)排卵的大鼠黃 體的細(xì)胞凋亡程度是在注射PGF-2 oc后檢測(cè)的。圖17是從細(xì)胞凋亡大鼠黃體中分離的基因組DNA的瓊脂糖凝膠， 它表示用PGF F-2oc處理大鼠后的DNA分梯。圖18描述DNA分梯實(shí)驗(yàn)，其中超數(shù)排卵的大鼠黃體的分散細(xì)胞凋 亡程度是與前列腺素F-2ct (PG F-2ct )接觸之前，在使用亞精胺處 理過(guò)的大鼠中檢測(cè)的。圖19描述DNA分梯實(shí)驗(yàn)，其中超數(shù)排卵的大鼠黃體的細(xì)胞凋亡程 度是在使用亞精胺和/或PGF-2 a處理過(guò)的大鼠中檢測(cè)的。圖20是使用"P-dCTP-標(biāo)記的部分大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A cDNA探測(cè)的大鼠基因組DNA的DNA印跡。圖21描述pHM6， 一種哺乳動(dòng)物表位標(biāo)記表達(dá)載體(RocheMolecular Biochemicals)。圖22是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，使用大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性DHS cDNA的32P-dCTP-標(biāo)記的3，-非翻譯區(qū)探測(cè)的從C0S-7細(xì)胞中分離的總RNA的RNA印跡(上圖)和溴化乙錠染色的凝膠(下圖)，其中細(xì)胞凋亡是通過(guò)血清剝奪誘導(dǎo)的。圖23是說(shuō)明瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞過(guò)程的流程圖。圖24是用pHM6轉(zhuǎn)染后，C0S-7細(xì)胞中外源蛋白瞬時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡。圖25說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性eIF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，天門冬 氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。圖26說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，DNA斷 裂的增加反映的。圖27說(shuō)明細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，核斷裂 的增加反映的。圖28說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，核斷裂 的增加反映的。圖29說(shuō)明細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞時(shí)，磷脂酰 絲氨酸暴露的增加反映的。圖30說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，磷脂酰 絲氨酸暴露的增加反映的。圖31說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，核斷裂 的增加反映的。圖32說(shuō)明使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的pHM6，按 有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)凋亡的增加。圖33說(shuō)明使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的pHM6，按 有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)Bel-2的下調(diào)。上圖是考馬斯-藍(lán)染色 的蛋白質(zhì)印跡；下圖是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。圖34是將Bel-2用作探針，使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A的pHM6，按反義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的考馬斯藍(lán)染色的 蛋白質(zhì)印跡(上圖)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡(下圖)。圖35是將c-Myc用作探針，使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞的考馬斯藍(lán)染色的 蛋白質(zhì)印跡(上圖)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡(下圖)。圖36是將p53用作探針，使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞的考馬斯藍(lán)染色的 蛋白質(zhì)印跡(上圖)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡(下圖)。圖37是使用抗-[HA]-過(guò)氧化物酶探針時(shí)，pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋 亡-特異性elF-5A在C0S-7細(xì)胞中表達(dá)的考馬斯藍(lán)染色的蛋白質(zhì)印跡 和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡，以及使用p53探針時(shí)，pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -特異性6^-5人在(:03-7細(xì)胞中表達(dá)的考馬斯藍(lán)染色的蛋白質(zhì)印跡(上 圖)和相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡(下圖)。圖38是從RK0細(xì)胞中分離的人elF5A2的序列與人elF5A2的序列 (Genbank登記號(hào)XM—113401)的比對(duì)。圖39是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO和RKO-E6中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的 圖。RKO和RK0-E6細(xì)胞是用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的。 用放線菌素D處理并用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的RKO細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染但沒用放線菌素D處理的細(xì)胞增加了 240%。用放線菌 素D處理并用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的RK0-E6細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染但沒用放線菌素D處理的細(xì)胞增加了 105 % 。圖40是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的圖。 RKO細(xì)胞是用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， p腿-elF5A2，或pHM6-截 短的elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的。用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞增加了 25%。但是這種增加對(duì)于用 pHM6-elF5A2或pHM6-截短的elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并不明顯。圖41是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的圖。 RKO細(xì)胞或者未被轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。 校正轉(zhuǎn)染效率后，用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有60%凋亡。
圖42提供瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RK0細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果。RK0 細(xì)胞或者未被轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， pHM6-elF5A2， 或pHM6-截短的elF5Al轉(zhuǎn)染。該表描述了經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞百分比，它 是以每個(gè)峰下的面積為基礎(chǔ)計(jì)算的。校正未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的背景凋亡和轉(zhuǎn) 染效率之后，有80%用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞顯示凋亡。用pHM6-LacZ， pHM6-elF5A2或pHM6-截短的elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞僅顯示背景水 平的凋亡。圖43提供蛋白的蛋白質(zhì)印跡，所述蛋白是從用0. 25[ig/ml放線菌 素D處理O， 3， 7， 24，和48小時(shí)的RKO細(xì)胞中分離出來(lái)的。上圖描 述使用抗-p53作為第一抗體的蛋白質(zhì)印跡。中圖描述使用抗-elF5Al 作為第一抗體的蛋白質(zhì)印跡。下圖描述用于抗-elT5Al印跡的薄膜， 所述印跡是在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)以證實(shí)等量加樣后，用考馬斯藍(lán)染色的。 p53和elF5Al都是通過(guò)用放線菌素D處理而上調(diào)的。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明部分是以下列發(fā)現(xiàn)和特性描述為基礎(chǔ)的，即從大鼠黃體中分 離出來(lái)的、編碼elF-5A的全長(zhǎng)cDNA涉及細(xì)胞凋亡(細(xì)胞凋亡-特異 性)。因此，在其中一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種分離的核酸，它 含有編碼大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽的核苷酸序列。本發(fā)明還 提供一種純化的多肽，它含有大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽的氨 基酸序列。大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽是指對(duì)大鼠特異的任何 多肽，它在凋亡細(xì)胞中差異表達(dá)，而且是由脫氧8-羥-2，7，10-三氨基 癸酸殘基的形成而產(chǎn)生，所述殘基的形成是利用脫氧8-羥-2， 7， IO-三 氨基癸酸合酶催化，使亞精胺的4-氨基丁基部分向前體elF-5A的特 異性保守賴氨酸的oc-氨基轉(zhuǎn)移，并利用脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸 酸羥化酶使4-氨基丁基部分輕化形成8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸，由此 活化elF-5A。此外，使用這里提供的指導(dǎo)和本領(lǐng)域那些技術(shù)人員熟知的技術(shù)，本 發(fā)明的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的核酸及多肽序列可用于從其它 細(xì)胞、組織、器官或動(dòng)物分離細(xì)胞凋亡-特異性核酸及多肽。本發(fā)明還 提供適宜作為引物或雜交探針的核酸分子，從而檢測(cè)編碼本發(fā)明大鼠 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽的核酸。
本發(fā)明的核酸可以是DNA， RNA， DNA/RNA雙鏈體，蛋白-核酸 (PNA)，或其衍生物。這里所用的核酸或多肽，當(dāng)基本上沒有細(xì)胞物質(zhì) 或沒有化學(xué)前體或其它化學(xué)品時(shí)是"分離的"或"純化的，，。應(yīng)認(rèn)識(shí) 到術(shù)語(yǔ)分離的或純化的不指含有許多其它序列片段的文庫(kù)型制品。本 發(fā)明的核酸或多肽可被純化至均一或其它程度的純度。純化水平是以 預(yù)期用途為基礎(chǔ)的。重要的特征是，即使有大量其它成分存在，制品 也能達(dá)到核酸或多肽的預(yù)期功能。分離多肽可從天然表達(dá)它的細(xì)胞純化，從已被改變從而表達(dá)它的細(xì) 胞(重組體)純化，或使用已知的蛋白合成方法合成。例如，蛋白的 重組產(chǎn)生包括將編碼誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的elF-5A或DHS的核酸分子克隆到 表達(dá)載體中。將表達(dá)載體引入到宿主細(xì)胞中，并使蛋白在宿主細(xì)胞中 表達(dá)。然后使用標(biāo)準(zhǔn)蛋白純化技術(shù)，通過(guò)任何適宜的純化方案將蛋白 從細(xì)胞中分離出來(lái)。優(yōu)選，編碼本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF5A多肽的分離的核酸 具有SEQ ID N0: 1的核普酸序列，本發(fā)明的純化的多肽具有SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列。本發(fā)明的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A的核酸及多肽 還包括分別與SEQ ID NO: l和SEQ ID NO: 2基本相同或同源的序列， 及其功能衍生物和變體。這里所用的術(shù)語(yǔ)"序列基本同一"或"基本同源"用于說(shuō)明一個(gè)序 列與另外一個(gè)序列顯示出基本相同的結(jié)構(gòu)或功能?；就?一或基本同 源的序列之間的任何結(jié)構(gòu)或功能差異都是極小的(de巡// /邊")；也 就是說(shuō)，它們不會(huì)影響序列在預(yù)期應(yīng)用中發(fā)揮作用的能力。差異可能 是由于不同物種之間密碼子使用的固有差異，例如，如果兩個(gè)或多個(gè) 不同序列之間存在大量的序列重疊或類似，或如果不同序列即使長(zhǎng)度 或結(jié)構(gòu)不同，也仍然顯示相似的物理特性，那么結(jié)構(gòu)差異被認(rèn)為是極 小的。這種特性包括，例如，在規(guī)定條件下雜交的能力，或蛋白的免 疫交叉反應(yīng)性，類似的酶活性等。技術(shù)人員可利用本領(lǐng)域已知的方法 很容易地確定各種特性。此外，如果兩個(gè)核苷酸序列之間具有至少約70%或更高，更優(yōu)選 80%或更高，甚至更優(yōu)選約90%或更高，最優(yōu)選約95%或更高的序列 相似性，那么它們"基本互補(bǔ)"。如果兩個(gè)氨基酸序列在多肽的活性 或功能相關(guān)部分之間具有至少50%,優(yōu)選至少70%，更優(yōu)選至少80%,
甚至更優(yōu)選至少90%，最優(yōu)選至少95%的相似性，那么它們基本同源。 為了測(cè)定兩個(gè)序列的同 一性百分比，將序列進(jìn)行用于最佳比較目的 的比對(duì)(例如，將空位引入到第 一和第二個(gè)氨基酸或核酸序列的其中一 個(gè)或兩個(gè)中進(jìn)行最佳比對(duì)，且為了進(jìn)行比較，可忽略非-同源性序列)。 在優(yōu)選實(shí)施方案中，將至少30%, 40%, 50%， 60%， 70%， 80%,或90% 或更長(zhǎng)的參考序列進(jìn)行比對(duì)。然后比較相應(yīng)氨基酸位置或核苷酸位置 的氨基酸殘基或核苷酸。當(dāng)?shù)谝粋€(gè)序列中的位置被與第二個(gè)序列中的 相應(yīng)位置相同的氨基酸殘基或核苷酸占據(jù)時(shí)，那么所述分子在該位置 是相同的(這里所用的氨基酸或核酸"同一性"與氨基酸或核酸"同源 性，，等價(jià))。兩個(gè)序列之間的同一性百分比是序列共有的相同位置數(shù)的 函數(shù)，考慮到空位數(shù)和每個(gè)空位的長(zhǎng)度，需要引入它們進(jìn)行兩個(gè)序列 的最佳比對(duì)。兩個(gè)序列之間的比較和同一性及相似性百分比的確定可使用數(shù)學(xué) 算法完成。(Computational Molecular Biology， Lesk， A. M. ， ed.， Oxford University Press ， New York ， 1988 ) Biocomputing:Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.， ed. ， Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1， Griffin, A, M. ， and Griffin， IL G.， eds. ， Humana Press, New Jersey, 1994j Sequence Analysis in Molecular Biology, vonHeinje， G. ， Academic Press， 1987j and Sequence Analysis Primer, Gribskov， M. and Devereux， J. ， eds.， M Stockton Press, New York, 1991)。本發(fā)明的核酸及蛋白序列可進(jìn)一步被用作"查詢序列"，在序列數(shù) 據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，從而鑒定其它家族成員或相關(guān)序列。這種檢索可使 用Altschul，等(1990) /. "/o入215: 403-10的NBLAST和XBLAST程序(2. 0版)進(jìn)行。BLAST核苷酸檢索可使用NBLAST程序進(jìn) 行。BLAST蛋白檢索可使用XBLAST程序進(jìn)行，從而獲得與本發(fā)明蛋白 同源的氨基酸序列。為了比較目的而獲得有空位的比對(duì)，可按照 Altschul等(1997) ^/"eic Jc/" 25 (17): 3389-3402中所述，使用有空位的BLAST。當(dāng)利用BLAST和有空位的BLAST程序時(shí)， 可使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST )的缺省參數(shù)。術(shù)語(yǔ)核酸的"功能衍生物"在這里是指基因或核苷酸序列的同源物
或類似物。功能衍生物可保留已知基因的至少一部分功能，用于本發(fā)明中。這里所述細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽的"功能衍生物"是細(xì) 胞凋亡-特異性elF-5A的片段，變體，類似物，或化學(xué)衍生物，它們 可保留細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的至少一部分活性或與對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A特異的抗體的免疫交叉反應(yīng)性。細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A多肽的片段是指分子的任何亞型。功能變體還可包括類似氨基酸的取代，但功能不會(huì)發(fā)生改變或發(fā)生 無(wú)關(guān)緊要的改變。對(duì)于功能而言較為重要的氨基酸可通過(guò)本領(lǐng)域已知 的方法鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變(Cunningham等(1989) 5c/e/7ce 244:1081-1085)。后一個(gè)過(guò)程可將單丙氨酸突變引入到分子 中的每個(gè)殘基上。然后測(cè)試所得突變分子的生物活性，如激酶活性或 體外增殖活性。對(duì)于結(jié)合配偶體/底物結(jié)合較為重要的位點(diǎn)還可通過(guò)結(jié) 構(gòu)分析，如結(jié)晶，核磁共振或光親和標(biāo)記測(cè)定(Smith等(1992) /. "/o厶224: 899-904; de Vos等(1992) ^c/e/2ce 255: 306-312)。 "變體"是指與完整基因或其片段基本相似的分子，如具有一個(gè)或多個(gè)取代核苷酸的核苷酸取代變體，但它仍然維持與特定基因雜交或 編碼與天然DNA雜交的mRNA轉(zhuǎn)錄物的能力。"同源物"是指來(lái)源于不同動(dòng)物屬或種的片段或變體序列。"類似物"是指與整個(gè)分子，其變 體，或片段基本相似或有相關(guān)功能的非天然分子。變體肽包括天然存在的變體以及利用本領(lǐng)域熟知的方法制造的那 些。這種變體可使用分子技術(shù)以及這里公開的序列信息很容易地鑒定/ 制造。此外，可以本發(fā)明elF-5A或DHS蛋白的序列和/或結(jié)構(gòu)同源性 為基礎(chǔ)，很容易地將這種變體與其它蛋白區(qū)別開來(lái)。同源性/同一性的 程度主要以蛋白是功能變體還是非功能變體，共生同源物家族的趨異 差異量，以及直向同源物間的進(jìn)化距離為基礎(chǔ)的。本發(fā)明的elF-5A或DHS蛋白的非天然存在變體可使用重組技術(shù)很 容易地產(chǎn)生。這種變體包括但不限制于蛋白氨基酸序列的缺失，添加 和取代。例如，其中一類取代是保守氨基酸取代。這種取代是用具有 相似特性的其它氨基酸取代蛋白中給定氨基酸的那些。通常所見的保 守取代是將脂族氨基酸Ala， Val， Leu，和lie中的一個(gè)替換為另一 個(gè)；羥基殘基Ser和Thr的互換；酸性殘基Asp和Glu的交換；酰胺 殘基Asn和Gln之間的取代；堿性殘基Lys和Arg的交換；以及芳族
殘基Phe和Tyr之間的替換。有關(guān)很可能是表型沉默的氨基酸改變的 指導(dǎo)，見Bowie等，Sc/e/7ce 247: 1306-1310 (1990)。可選擇性而且優(yōu)選地，編碼本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A 多肽的核酸在高度嚴(yán)格條件下，與SEQ ID N0:1的互補(bǔ)核苷酸序列雜 交。這里所用術(shù)語(yǔ)"雜交"是指核酸在適宜的嚴(yán)格條件下雜交，根據(jù) 探針序列和靶序列性質(zhì)的不同，所述條件對(duì)于本領(lǐng)域那些技術(shù)人員而 言是顯而易見的。雜交和洗滌條件是本領(lǐng)域熟知的，根據(jù)所需嚴(yán)格程 度的不同，通過(guò)改變溫育時(shí)間，溫度，和/或溶液的離子強(qiáng)度而對(duì)條件 進(jìn)行調(diào)節(jié)是很容易完成的。見，例如，Sambrook， J.等，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第 2版，Cold Spring Harbour Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989。條件的選擇取決于雜交序列的長(zhǎng)度，特別是探針序列的長(zhǎng)度，核酸 中的相對(duì)G-C含量以及所允許的錯(cuò)配數(shù)。當(dāng)需要在互補(bǔ)程度較低的鏈 之間進(jìn)行部分雜交時(shí)，優(yōu)選低度嚴(yán)格條件。當(dāng)需要完全或接近完全互 補(bǔ)時(shí)，優(yōu)選高度嚴(yán)格條件。對(duì)于典型的高度嚴(yán)格條件而言，雜交溶液 含有6X S.S.C. ， 0. 01M EDTA， IX Denhardt，s溶液和0-5%SDS。對(duì) 于克隆DNA的片段而言，雜交在約68"C時(shí)進(jìn)行約3-4小時(shí)，對(duì)于總真 核生物DNA而言，進(jìn)行約12-16小時(shí)。對(duì)于較低的嚴(yán)格程度而言，雜 交溫度降至約42"C，低于雙鏈體的解鏈溫度(Tm)。已知Tm是G-C 含量和雙鏈體長(zhǎng)度以及溶液離子強(qiáng)度的函數(shù)。這里所用術(shù)語(yǔ)與DNA或MA分子的"相應(yīng)部分雜交"是指雜交分 子，例如，寡核苷酸，多核苷酸，或任一核苷酸序列(按有義或反義 方向)識(shí)別并與其它核酸分子序列雜交，其中所述其它核酸分子序列 具有與該核苷酸序列近似相等的大小以及足夠的序列相似性，從而在適宜條件下進(jìn)行雜交。例如，ioo個(gè)核苷酸長(zhǎng)的有義分子可識(shí)別并與核苷酸序列中大約100個(gè)核苷酸的部分雜交，只要兩個(gè)序列之間有大約 70%或更高的序列相似性。應(yīng)當(dāng)了解，"相應(yīng)部分"的大小會(huì)造成雜 交中的一些錯(cuò)配，如此"相應(yīng)部分"可比與它雜交的分子更小或更大， 例如，大或小20-30%，優(yōu)選至多大或小約12-15%。此外，多肽的功能變體還可包括相似氨基酸的取代，但功能不會(huì)發(fā) 生改變或發(fā)生無(wú)關(guān)重要的改變。對(duì)于功能而言較為重要的氨基酸可通 過(guò)本領(lǐng)域已知的方法鑒定，如定點(diǎn)誘變或丙氨酸-掃描誘變 (Cunningham等，^c/e"ce 244: 1081-1085)。后一個(gè)過(guò)程可將單丙氨 酸突變引入到分子中的每個(gè)殘基上。然后測(cè)試所得突變分子的生物活 性。例如，細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的類似物是指與整個(gè)蛋白或其片 段基本相似的肽模擬物或非天然蛋白。細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的化 學(xué)衍生物含有通常不是肽或肽片段一部分的其它化學(xué)部分。另外，還 可通過(guò)使肽的目標(biāo)氨基酸殘基與有機(jī)衍生劑反應(yīng)而將修飾引入到肽或 其片段中，其中所述有機(jī)衍生劑能夠與所選擇的側(cè)鏈或末端殘基反 應(yīng)。從大鼠黃體中分離的、編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的全長(zhǎng)cDNA 的最初發(fā)現(xiàn)和表征導(dǎo)致編碼DHS的部分cDNA克隆的發(fā)現(xiàn)和表征，它也 是從大鼠黃體中分離的，并涉及細(xì)胞凋亡。因此，在另一實(shí)施方案中， 本發(fā)明提供一種分離的核酸，它含有編碼大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS多 肽的核苷酸序列。本發(fā)明還提供一種純化的多肽，它含有大鼠細(xì)胞凋 亡-特異性DHS多肽的氨基酸序列。大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS多肽是 指對(duì)大鼠特異的任何適宜多肽，它在凋亡細(xì)胞中差異表達(dá)，并且通過(guò) 使亞精胺的4-氨基丁基部分向失活elF-5A的特定保守賴氨酸的oc-氨 基轉(zhuǎn)移，形成脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸，由此活化elF-5A而催 化脫氧8-鞋-2， 7, 10-三氨基癸酸殘基的形成。優(yōu)選，編碼本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS多肽的分離的核酸具 有SEQ ID NO: 22的核苷酸序列，本發(fā)明的純化的多肽具有SEQ ID NO: 23 的氨基酸序列。本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS的核酸及多肽還包括 分別與SEQ ID NO: 22和SEQ ID NO: 23基本同一或同源的序列，和功 能衍生物及其變體，前面已經(jīng)對(duì)它們進(jìn)行過(guò)描述?？蛇x擇性而且優(yōu)選 地，本發(fā)明的分離的核酸具有在高度嚴(yán)格條件下，與SEQ ID NO: 22的 互補(bǔ)序列雜交的核苷酸序列，這也已經(jīng)在前面描述過(guò)。就這里所述大鼠細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A序列的核酸及多肽而 言，本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特異性DHS序列的核酸及多肽可用于從其它 動(dòng)物，包括人類分離細(xì)胞凋亡-特異性DHS的核酸及多肽。DHS序列從 動(dòng)物和人類的這種分離可以物種之間至少80 %的序列相似性為基礎(chǔ)， 使用本領(lǐng)域已知的方法和這里提供的指導(dǎo)進(jìn)行。本發(fā)明還提供適于作 為引物或雜交探針的核酸分子，用來(lái)檢測(cè)編碼本發(fā)明大鼠細(xì)胞凋亡-特 異性DHS多肽的核酸。細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，包括作為疾病 過(guò)程基礎(chǔ)的細(xì)胞凋亡的適宜靶，這是因?yàn)樗芸赡軐?duì)涉及細(xì)胞凋亡途 徑的下游效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。因此，本發(fā)明還 提供通過(guò)給予細(xì)胞一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和/或DHS功能的 試劑而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，所述試劑 可以是僅調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡-特異性elF5A功能的試劑，僅調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡-特異性DHS功能的試劑，或同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS 功能的試劑。細(xì)胞凋亡可通過(guò)細(xì)胞中凋亡-特異性elF-5A和/或DHS功能的正常 水平的任何適宜改變而調(diào)節(jié)。正如這里預(yù)期的，修飾或改變可以是完 全或部分的，且包括轉(zhuǎn)錄或翻譯控制的改變或改變細(xì)胞中凋亡-特異性 elF-5A和/或DHS功能的其它改變。細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A或DHS 的功能是指與脫氧8-鞋-2, 7， 10-三氨基癸酸殘基的形成有關(guān)的任何活 性，所述殘基的形成是利用DHS催化，使亞精胺的4-氨基丁基部分向 前體elF-5A的特異性保守賴氨酸的oc-氨基轉(zhuǎn)移，并利用脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸羥化酶使4-氨基丁基部分羥化形成8-羥-2， 7, 10-三氨基癸酸，由此活化elF-5A。在本發(fā)明其中 一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑可抑制細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A和/或DHS的功能，由此抑制細(xì)胞凋亡。抑制細(xì)胞凋亡是指強(qiáng) 度和/或數(shù)量的任何降低，和/或細(xì)胞凋亡的任一或所有明確的形態(tài)學(xué) 特性，如細(xì)胞鈹，染色質(zhì)凝聚，核斷裂，以及薄膜起泡開始的延遲。能夠抑制細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和/或DHS功能的其中一種試劑 是反義寡核苷酸。優(yōu)選，所述反義寡核苷酸具有編碼細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A多肽和/或細(xì)胞凋亡-特異性DHS多肽的一部分的核苷酸序列。 很多編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽和/或DHS多肽的適宜核酸序列 都是本領(lǐng)域已知的。例如，SEQ ID N0S:1， 3， 4， 5， 11， 15， 19， 20，和21(細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的核酸序列)，SEQ ID N0S: 6和 8 (細(xì)胞凋亡-特異性DHS的核酸序列)，SEQ ID N0S: 12和16 eIF-5A (細(xì) 胞凋亡-特異性多肽的序列)，和SEQ ID NO: 7(細(xì)胞凋亡-特異性DHS 多肽的序列)，或其一部分，都可提供適宜的序列。其它適宜的序列可 使用已知序列作為探針，按照這里描述的方法找到。
因此，本發(fā)明還提供編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽和/或細(xì)胞 凋亡-特異性DHS多肽的一部分的反義寡核苷酸，及其互補(bǔ)序列。本發(fā) 明的反義寡核苷酸可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因組DNA，或合 成RNA或DNA的形式。DNA可以是雙鏈或單鏈的，且如果是單鏈，可 以是編碼鏈或非編碼鏈。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交會(huì)妨礙 核酸的正常功能，通常被稱作"反義的"。受到妨礙的DNA功能包括 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。受到妨礙的RNA功能包括所有功能，例如RNA向蛋白翻 譯位點(diǎn)的易位，蛋白從RNA的翻譯，產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)mRNA種類的RM 剪接，和涉及或由RNA促進(jìn)的催化活性。這種反義寡核苷酸的全部作 用是抑制細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和/或DHS的表達(dá)和/或減少所產(chǎn)生 的活化細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的量?？蛇x擇性地，細(xì)胞凋亡特異性DHS對(duì)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的 活化可通過(guò)給予抑制DHS酶反應(yīng)的化學(xué)劑抑制。例如，在通過(guò)注射 PGF-2a誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后，當(dāng)使用亞精胺， 一種DHS反應(yīng)的抑制劑處理 動(dòng)物時(shí)，大鼠黃體中反映細(xì)胞凋亡的DNA分梯的開始延遲了(圖18-19)。 Jakus等，(1993) /. A/o人268: 13151-13159。細(xì)胞凋亡還通過(guò)加入4吏細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的DNA， RNA，或 蛋白降解，或使細(xì)胞凋亡-特異性DHS的DNA， RNA，或蛋白降解，由 此防止細(xì)胞凋亡-特異性DHS將細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A活化的試劑而 被抑制或大大降低。在本發(fā)明另一實(shí)施方案中，內(nèi)源性哺乳動(dòng)物細(xì)胞 凋亡-特異性DHS，細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A，或兩者表達(dá)的抑制是通 過(guò)使用核酶進(jìn)行的。適宜藥物的例子包括抑制細(xì)胞凋亡-特異性DHS將 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A活化的那些，抑制脫氧8-羥-2, 7， 10-三氨基 癸酸羥化酶將細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A活化的那些，抑制細(xì)胞凋亡-特異性DHS的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的那些，抑制細(xì)胞凋亡-特異性脫氧8-羥-2， 7， 10-三氨基癸酸羥化酶的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的那些，以及抑制細(xì)胞 凋亡特異性elF-5A的轉(zhuǎn)錄或翻譯的那些。抑制細(xì)胞凋亡-特異性DHS 將elF-5A活化的藥物的例子是亞精胺，1，3-二氨基-丙烷，1，4-二氨 基-丁烷(腐胺)，1，7-二氨基-庚烷，或l，8-二氨基-辛烷。還可通過(guò)使細(xì)胞中編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的基因失活而抑 制細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A。這種失活可通過(guò)使細(xì)胞中的基因缺失， 或向基因中引入缺失或突變而發(fā)生，由此使基因失活而發(fā)生。此外， 還可通過(guò)將其它DNA片段插入到基因中而使基因失活，如此，內(nèi)源性 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A蛋白的表達(dá)就不會(huì)發(fā)生。同樣，可通過(guò)使細(xì) 胞中編碼細(xì)胞凋亡-特異性DHS的基因失活而抑制細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A的活化。將突變，如缺失和插入引入到真核細(xì)胞基因中的方法 是本領(lǐng)域已知的，例如，美國(guó)專利號(hào)第5, 464, 764。用于進(jìn)行細(xì)胞基 因突變的寡核苷酸及表達(dá)載體可按照本領(lǐng)域已知的方法和這里提供的 指導(dǎo)制造；例如，用于制造和表達(dá)反義寡核苷酸的方法可用于制造進(jìn) 行細(xì)胞基因突變的寡核苷酸及表達(dá)栽體。還可通過(guò)抑制細(xì)胞中編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的基因表達(dá)而 抑制細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的表達(dá)。這種失活可通過(guò)共抑制完成， 例如，將編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的核苷酸序列引入到細(xì)胞中， 如此進(jìn)行共抑制。同樣，它可經(jīng)由共抑制，通過(guò)抑制細(xì)胞中編碼細(xì)胞 凋亡特異性DHS的基因表達(dá)而抑制細(xì)胞凋亡特異性elF-5A活化。用于 進(jìn)行共抑制的寡核苷酸及表達(dá)載體可按照本領(lǐng)域已知的方法和這里提 供的指導(dǎo)制造；例如，用于制造和表達(dá)反義寡核苷酸的方法可用于制 造進(jìn)行共抑制的寡核苷酸及表達(dá)載體。進(jìn)行共抑制的方法是本領(lǐng)域已 知的，例如，美國(guó)專利號(hào)第5， 686， 649。(通過(guò)，例如，反義，突變，或共抑制)抑制的其中一個(gè)結(jié)果是內(nèi) 源性可翻譯的、編碼細(xì)胞凋亡特異性elF-5A或DHS的mRNA量降低。 因此，所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡-特異性DHS蛋白的量降低，由此減少活化 elF-5A的量，從而降低細(xì)胞凋亡-特異性蛋白的翻譯。因此，細(xì)胞凋 亡被抑制或延遲，這是因?yàn)榈鞍字匦潞铣墒羌?xì)胞凋亡開始所需的。在本發(fā)明另 一實(shí)施方案中，所述試劑可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A或DHS的功能，由此誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是指強(qiáng)度或 數(shù)量的增加，或細(xì)胞凋亡的任一或所有明確的形態(tài)學(xué)特征，例如，細(xì) 胞皺縮，染色質(zhì)凝聚，核斷裂，以及膜起泡開始的加速。可使用任何誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和/或DHS功能的適宜試 劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可認(rèn)識(shí)到，可給予細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的失 活及活性形式。如果給予失活形式，或8-羥-2，7，10-三氨基癸酸-未 修飾形式，那么天然的細(xì)胞凋亡-特異性DHS可活化elF-5A。很多編 碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽和/或DHS多肽的適宜核酸序列都是本 領(lǐng)域已知的。例如，SEQ ID N0S:1， 3， 4， 5， 11， 15， 19， 20，和 21 (細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的核酸序列)，SEQ ID N0S: 6和8 (細(xì)胞 凋亡-特異性DHS的核酸序列)，SEQ ID N0S:12和16 elF-5A(細(xì)胞凋 亡-特異性多肽的序列)，和SEQ ID N0:7(細(xì)胞凋亡-特異性DHS多肽 的序列)，或其一部分，可提供適宜的序列。其它適宜的序列可使用已 知序列作為探針，按照這里所述的方法找到。例如，可將棵露核酸(棵露DNA載體，如寡核苷酸或質(zhì)粒)，或多 肽，包括重組產(chǎn)生的多肽給予細(xì)胞。重組產(chǎn)生的多肽是指將編碼eIF-5A或DHS蛋白的DNA序列放入適宜的表達(dá)載體中，這將在下面詳細(xì)描 述。宿主是用表達(dá)載體轉(zhuǎn)染的，隨后產(chǎn)生所需的多肽。然后從宿主細(xì) 胞中分離多肽。誘導(dǎo)重組細(xì)胞凋亡的elF-5A蛋白可在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢 (CHO )細(xì)胞中制造，并由本領(lǐng)域那些技術(shù)人員使用重組DHS活化。Wang 等(2001) /. A/oA (7力e邁.，276， 17541-17549; Eriksson等，(2001) Se邁//7. ^e邁a"/， 38， 24-31。所述多肽還可以是利用已知蛋白合成 方法合成的。多肽攝取可使用配體促進(jìn)，例如，來(lái)源于炭疽的配體，它可介導(dǎo)在 各種細(xì)胞中的攝取。Liu等(2001) /. A/o人，276， 46326-46332。此外，還可利用脂質(zhì)體將重組蛋白給予哺乳動(dòng)物的靶細(xì)胞，組 織，和器官。含蛋白的脂質(zhì)體是靜脈內(nèi)給予的。可通過(guò)將特異性細(xì)胞 受體的配體摻入到脂質(zhì)體中而實(shí)現(xiàn)導(dǎo)向。見，例如，Kaneda， y^r"rz^ Z e//P^ry M 43: 197-205 (2000)?？烧T導(dǎo)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A或DHS功能的其中一種優(yōu)選試劑 是表達(dá)栽體。因此，本發(fā)明提供表達(dá)載體，它們具有與編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多肽和/或DHS多肽的核酸可操縱連接的啟動(dòng)子。本發(fā) 明的表達(dá)載體可以是RNA或DNA，例如，cDNA，基因組DNA，或合成 RNA或DNA的形式。DNA可以是雙鏈或單鏈的，如果是單鏈，可以是編 碼鏈或非-編碼鏈?？?吏用任何適宜的表達(dá)載體(見，例如，Pouwels 等 ， Cloning Vectors:A Laboratory Manual (Elsevior ， N.Y.: 1985))。優(yōu)選，表達(dá)載體具有與編碼細(xì)胞凋亡-特異性(相關(guān)) elF-5A多肽和/或細(xì)胞凋亡-特異性(相關(guān))DHS多肽的核苷酸序列可 操縱連接的啟動(dòng)子序列。在表達(dá)載體內(nèi)，所需核酸與啟動(dòng)子是可操縱連接的，如此啟動(dòng)子才 能驅(qū)動(dòng)核酸的表達(dá)。可使用任何適宜的啟動(dòng)子，只要核酸被表達(dá)。這
種適宜啟動(dòng)子的例子包括各種病毒啟動(dòng)子，真核啟動(dòng)子，和組成型活 化的啟動(dòng)子。只要維持這種可操縱連接，表達(dá)載體就可含有不止一種核酸(例如，編碼細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和/或DHS的核酸)。表達(dá)栽 體可任選含有其它元件，如聚腺苷酸化序列，核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)元件(例如，增強(qiáng)子，沉默子等)，用于提高載體或轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定 性或提高細(xì)胞內(nèi)所需轉(zhuǎn)錄物的翻譯或加工的其它序列(例如，分泌信 號(hào)，前導(dǎo)序列，等)，或任何其它適宜的元件。表達(dá)載體可來(lái)源于病毒，如腺病毒，腺伴隨病毒，皰療病毒，逆轉(zhuǎn) 錄病毒或慢病毒。還可將本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中，所述 宿主細(xì)胞包括但不限制于，細(xì)菌，哺乳動(dòng)物或昆蟲的宿主細(xì)胞系統(tǒng)， 包括桿狀病毒系統(tǒng)(見，例如，Luckow等，"/o/7"ec力/7o/of ， 6， 47 (1988))，和已經(jīng)確立的細(xì)胞系，如293， C0S-7， C127， 3T3， CH0， HeU， BHK等。優(yōu)選腺病毒載體，這是因?yàn)楹唾|(zhì)粒及其它病毒載體(例如，單純性 皰療病毒)不同，腺病毒載體可同時(shí)在分裂細(xì)胞和未分裂細(xì)胞中獲得基 因轉(zhuǎn)移，以及蛋白在心血管相關(guān)位點(diǎn)，如心肌，血管內(nèi)皮和骨骼肌中的高水平表達(dá)。此外，腺病毒載體可將基因轉(zhuǎn)移到染色體外位置，并 因此很少會(huì)出現(xiàn)將轉(zhuǎn)移基因不適當(dāng)插入到宿主基因組關(guān)鍵位點(diǎn)中的危 險(xiǎn)。而且希望腺病毒載體在病毒復(fù)制所需的至少一個(gè)基因功能方面有 缺陷。優(yōu)選，腺病毒載體在腺病毒基因組El, E2，和/或E4區(qū)的至少 一個(gè)重要基因功能方面有缺陷。更優(yōu)選，載體在腺病毒基因組E3區(qū)的 至少一個(gè)部分有額外缺陷(例如，E3區(qū)的Xbal缺失)。通過(guò)簡(jiǎn)單地向培養(yǎng)基中加入病毒可將重組腺病毒遞送給所培養(yǎng)的 細(xì)胞。宿主動(dòng)物/人的感染可通過(guò)將病毒顆粒直接注射到血流或預(yù)定組 織中獲得。病毒在血清中的半衰期可通過(guò)使病毒與脂質(zhì)體(例如 Lipofectin， Life Technologies)或聚乙二醇復(fù)合而延長(zhǎng)。腺病毒載 體常常通過(guò)病毒纖維蛋白隆突結(jié)構(gòu)域和柯薩奇病毒及腺病毒受體CAR 之間的相互作用而進(jìn)入細(xì)胞。病毒載體可通過(guò)對(duì)病毒進(jìn)行基因工程改 造，使其表達(dá)對(duì)特定細(xì)胞受體特異的配體，來(lái)針對(duì)特定的細(xì)胞或不表 達(dá)CAR的細(xì)胞。在可選擇性的實(shí)施方案中，細(xì)胞凋亡可通過(guò)使用化學(xué)品對(duì)內(nèi)源性細(xì) 胞凋亡-特異性elF-5A，或細(xì)胞凋亡-特異性DHS，或兩者的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行 化學(xué)上調(diào)，或通過(guò)化學(xué)提高細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的活化而引發(fā)或 提高。在其中一個(gè)實(shí)施方案中，將PGF-2a給予動(dòng)物/人的癌細(xì)胞或腫 瘤，從而上調(diào)DHS和elF-5A的轉(zhuǎn)錄。細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，包括作為疾病過(guò)程基 礎(chǔ)的細(xì)胞凋亡的適宜目標(biāo)，這是因?yàn)樗锌赡茉谏婕凹?xì)胞凋亡途徑的 下游效應(yīng)子和轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)方面發(fā)揮作用。單獨(dú)或結(jié)合進(jìn)行 的、本發(fā)明調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和細(xì)胞凋亡-特異性DHS的方 法可在動(dòng)物細(xì)胞中完成，誘導(dǎo)或提高細(xì)胞凋亡，并產(chǎn)生治療和預(yù)防疾 病的新方法及組合物，所述疾病的病因與細(xì)胞沒有能力經(jīng)歷凋亡有 關(guān)。很多重要的人類疾病都是由細(xì)胞凋亡控制中的異常而引起。這些異 ?？蓪?dǎo)致細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)數(shù)的病理性增加或細(xì)胞損耗(例如， 變性疾病)。作為非限制性的實(shí)例，本發(fā)明的方法和組合物可用于預(yù) 防或治療下列與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病和病癥神經(jīng)病/神經(jīng)變性疾病 (例如，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，亨廷頓氏舞蹈病，肌萎縮性側(cè) 索硬化(Lou Gehrig氏病)，自身免疫性疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎， 系統(tǒng)性紅斑狼皰(SLE)，多發(fā)性硬化)，杜興氏肌性營(yíng)養(yǎng)不良(DMD),運(yùn) 動(dòng)神經(jīng)元病，局部缺血，慢性心力衰竭，中風(fēng)，嬰兒脊肌萎縮，心搏 停止，腎衰竭，變應(yīng)性皮炎，膿毒癥和膿毒性中風(fēng)，AIDS,肝炎，青 光眼，糖尿病(1型和2型)，孝喘，色素性視網(wǎng)膜炎，骨質(zhì)疏松癥，異 種移植排斥，和燒傷。本發(fā)明的方法可用于治療帶有癌細(xì)胞或患有腫瘤的動(dòng)物，所用的量 分別要足以殺死癌細(xì)胞或抑制腫瘤的進(jìn)展。足以實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)的量被定 義為治療有效的劑量。用于這種用途的有效量取決于疾病的嚴(yán)重程度 和動(dòng)物自身免疫系統(tǒng)的一般狀況。腫瘤生長(zhǎng)的抑制是指阻礙或降低腫瘤的進(jìn)展，例如，腫瘤的生長(zhǎng)， 侵入，轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)。本發(fā)明的方法可用于治療任何適宜的腫瘤，包 括，例如，乳腺，心臟，肺，小腸，結(jié)腸，脾，腎，膀胱，頭和頸， 卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪 丸，子宮頸或肝的腫瘤。動(dòng)物，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選人，可使用本 發(fā)明的組合物和方法治療。因此，本發(fā)明的方法可在體外，離體，或 體內(nèi)進(jìn)行。
給藥方案還可根據(jù)動(dòng)物的疾病狀況和狀態(tài)而改變，通常每天單次團(tuán)塊給藥一次或連續(xù)輸注或多次給藥(例如，每4-6小時(shí))，或根據(jù)治 療和動(dòng)物的情況而定。然而應(yīng)當(dāng)注意的是，本發(fā)明不限于任何特定的 劑量。在本發(fā)明中，可使用任何適宜的方法或途徑給藥，例如，口服，靜 脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌內(nèi)給藥。所給予拮抗劑的劑量取決于多種 因素，包括，例如，所給予分子的類型，所治療腫瘤的類型和嚴(yán)重程 度，以及給藥途徑。然而，應(yīng)當(dāng)強(qiáng)調(diào)的是，本發(fā)明不限于任何特定的 給藥方法或途徑。在其中一個(gè)可選擇性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可與一種或多種常規(guī)療法聯(lián)合使用。例如，可使用適宜的抗腫瘤劑，如化療劑或進(jìn)行 放療。在其它可選擇性的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可與一種或多種 適宜的佐劑聯(lián)合使用，例如，細(xì)胞因子(IL-10和IL-13)或其它免疫刺 激劑。在其它可選擇性的實(shí)施方案中，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病的診斷可使 用細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和增殖elF-5A進(jìn)行，其與利用不同啟動(dòng)子 從不同位置轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A不同；盡管兩者在結(jié)構(gòu)上 同源，但羧基末端有差異。本發(fā)明的診斷方法包括比較給定細(xì)胞中增 殖elF-5A的量和同一細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的量。在正常發(fā) 揮作用的過(guò)程中，細(xì)胞具有的增殖elF-5A (這里也稱作elF-5A2)的 量要高于細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A(這里也稱作elF-5Al )的量。然而， 在某些癌細(xì)胞中，由于正常的調(diào)節(jié)機(jī)理出錯(cuò)，使得細(xì)胞凋亡-特異性 elF5A的量相對(duì)于增殖elF-5A的量發(fā)生了改變。因此該方法可在細(xì)胞 發(fā)生任何表型改變之前，診斷細(xì)胞為癌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，增殖elF-5A與細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的比 值可用于篩選藥物。這種方法還包括比較給定細(xì)胞中增殖elF-5A的量 和同一細(xì)胞中細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的量。將增殖elF-5A與細(xì)胞凋 亡-特異性elF-5A的正常比值和細(xì)胞與候選藥物接觸之后，增殖 elF-5A與細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的比值進(jìn)行比較。接觸后，增殖 elF-5A與細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A比值的改變可用于鑒定那些具有細(xì) 胞凋亡-調(diào)節(jié)活性的候選藥物。具有細(xì)胞凋亡-調(diào)節(jié)活性的候選藥物可 通過(guò)抑制或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而用于治療與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病。此外， 增殖elF-5A與細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A比值的改變可用于調(diào)節(jié)細(xì)胞凋 亡，還可用于治療這里所述與異常細(xì)胞凋亡有關(guān)的任何狀況。使用該方法可有效篩選很多潛在的候選藥物，即候選藥物庫(kù)，從而 鑒定調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的庫(kù)成員。任何候選藥物或候選藥物庫(kù)都可使用該 方法篩選。例如，已經(jīng)被確定可以作為細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)劑的生物學(xué)反應(yīng) 修飾物，包括改變信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的單克隆抗體，細(xì)胞因子如TRAIL( Apo2 配體)，視黃酸/類固醇家族核受體的配體，以及結(jié)合并抑制蛋白激酶 的小分子化合物都可使用本發(fā)明方法來(lái)篩選明確的細(xì)胞凋亡-調(diào)節(jié)活 性。其中一種適宜的候選物是蛋白激酶C-a反義寡核苷酸，ISIS 3521 (ISIS Pharmaceuticals, Inc., Carlsbad, CA)，它具有抗肺 瘤活性。其它具體的特異性候選物包括天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋 白酶(IdunPharmaceuticals， San Diego, CA)， 已知它可在導(dǎo)致癌癥 和神經(jīng)變性疾病的各種類型細(xì)胞中引發(fā)并完成細(xì)胞凋亡的方面發(fā)揮重 要作用；GENASENSETM(Genta， Inc., Berkeley Heights, NJ)，它是 一種阻斷 Bcl-2 產(chǎn)生的反義藥物；INGN 241 (Introgen Therapeutics, Inc., Houston, TX)，它是針對(duì)p53的基因療法；利 妥希瑪(IDEC Corporation, Osaka, Japan),它是抗-CD20單克隆抗 體；和用于心血管疾病和癌癥的通用細(xì)胞凋亡驅(qū)動(dòng)療法(Egera Therapeuticslnc. ， Quebec, Canada)。應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明用于動(dòng)物預(yù)防或治療目的的核酸及多肽可以組合 物的形式給藥，所述組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體。適宜的藥學(xué) 上可接受的載體包括，例如， 一種或多種水，鹽水，磷酸鹽緩沖鹽水， 葡萄糖，甘油，乙醇等，及其組合。藥學(xué)上可接受的載體還可含有微 量的輔助物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑，防腐劑或緩沖劑，它們可提高結(jié) 合蛋白的保質(zhì)期或有效性。正如本領(lǐng)域熟知的，還可配制成注射用組 合物，從而在給予哺乳動(dòng)物后，提供活性成分的快速，持續(xù)或延遲釋 放。本發(fā)明的組合物可以各種形式存在。這些包括，例如，固體，半固 體，和液體劑型，如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液，分散液或混懸液， 脂質(zhì)體，栓劑，可注射及可輸注的溶液。優(yōu)選形式取決于預(yù)定的給藥 方式和治療應(yīng)用。
這種組合物可按照藥物領(lǐng)域熟知的方式制備。在制備組合物時(shí)，通 常將活性成分與載體混合，或用載體稀釋，和/或包封在載體中，它可 以是膠嚢，小藥嚢，紙或其它容器的形式。當(dāng)載體起稀釋劑的作用時(shí)， 它可以是固體，半-固體，或液體物質(zhì)，充當(dāng)活性成分的媒介物，賦形 劑或介質(zhì)。因此，所述組合物可以是片劑，錠劑，小藥嚢，扁嚢劑，酏劑，混懸液，氣溶膠(固體或存在于液體介質(zhì)中)，含有10重量％活性化合物的軟膏劑，軟和硬的明膠膠嚢，栓劑，注射液，混懸液，無(wú) 菌包裝的粉劑和局部貼劑。參考為了進(jìn)行舉例說(shuō)明而提供的下列實(shí)施例，可更容易理解本發(fā)明 的一般性描述。提出實(shí)施例的目的在于理解本發(fā)明，但不是，也不應(yīng) 被解釋為是以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例不包括常規(guī)方法的 詳細(xì)描述。這種方法是本領(lǐng)域那些普通技術(shù)人員熟知的，并且已經(jīng)在 很多公開出版物中描述過(guò)。常規(guī)方法，如構(gòu)造載體和質(zhì)粒，將編碼多 肽的核酸插入到這種栽體和質(zhì)粒中，將質(zhì)粒引入到宿主細(xì)胞中，以及 表達(dá)并測(cè)定其基因和基因產(chǎn)物時(shí)所用那些方法的詳細(xì)描述可從很多公開出版物獲得，包括Sambrook， J.等，(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press。這里提到的所有參考文獻(xiàn)都整體引入。實(shí)施例實(shí)施例1本實(shí)施例可證實(shí)編碼大鼠elF-5A核酸的全長(zhǎng)cDNA的分離和表 征，所述核酸具有細(xì)胞凋亡-特異性表達(dá)。超炎#伊及義扃## 一勿應(yīng)源亡W謬, 給未成熟的(21-30日齡)雌性大鼠皮下注射50 IU的PMSG(孕母馬 血清促性腺激素)，60-65小時(shí)后，注射50 IU的HCG(人絨毛膜促性腺 激素)，使它超數(shù)排卵。用HCG處理7天后，皮下注射500mg的PGF-2a，誘導(dǎo)黃體細(xì)胞凋亡。用PGF-2a處理后，在不同時(shí)間(例如，1, 8， 和24小時(shí))處死大鼠，切除黃體，放在液氮中。對(duì)照組的黃體組織是 在進(jìn)行PGF-2a處理之前，立即處死大鼠獲得的。義處#沐勿應(yīng)^#教超數(shù)排卵后6-9天，給大鼠多位點(diǎn)皮下注射500mg PGF-2a。 15-30分鐘后，切除超數(shù)排卯大鼠的卵巢，放在水上的EBSS (Gibco)中， 吸干并稱重。剔除結(jié)締組織，用刮刀將卵巢精細(xì)切碎，并用BBSS 2X 清洗兩次。膠原酶溶液是通過(guò)將6.5mg膠原酶(Sigma， Catologue 并C5138)在5ml EBSS中渦旋而制備的。將來(lái)源于8個(gè)卵巢的切碎的組 織加入到50ml Erlenmeyer燒瓶中的5ml膠原酶EBSS溶液中，并通 過(guò)在Diamed移液管中抽取若干次而輕輕攪拌。然后在95%空氣，5%C02溫育箱上的位置45)。 ' '、 工溫育之后，把燒瓶放在水上，用塑料移液管將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到裝 配有Swiss Nitex尼龍單絲(75m)的Nitex過(guò)濾器上。把濾液收集在 15ml Falcon試管中。將膠原酶溶液(6. 5mg膠原酶/5ml EBSS)的第二 份等分試樣(2. 5ml)加入到50ml Erlenmeyer燒瓶的剩余切碎的組織 中，使用移液管輕輕攪拌，溫育10分鐘，并按照上述過(guò)濾。將兩份濾 液混合，室溫在臨床離心機(jī)(約200g)中離心5分鐘。用移液管吸出 約2ml上清液并棄去，將沉淀的細(xì)胞在剩余的2ml上清液中重懸浮。按照上面所述，通過(guò)加入5mlMEM，離心并重懸浮而將細(xì)胞清洗2 次。把清洗過(guò)的細(xì)胞重懸浮在50ml Erl函eyer燒瓶的30ml含10mm 谷氨酰胺的MEM中，95%空氣，5%CO" 37匸時(shí)，在沒有振搖的情況 下溫育1小時(shí)。如上所述，通過(guò)離心使細(xì)胞沉淀，并將細(xì)胞重懸浮在 含1 OmM谷氨酰胺的MEM中。分散細(xì)胞的濃度是使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定的，存活力是利用臺(tái)盼藍(lán) 染色確定的。將2-5乂105個(gè)細(xì)胞的等分試樣放在12x75mm的試管中， 371C， 95%空氣，5。/。C02時(shí)，在沒有振搖的情況下溫育2-5小時(shí)。在 此期間，細(xì)胞凋亡的進(jìn)展是通過(guò)測(cè)定DNA分梯的程度而監(jiān)測(cè)的。神_^ #脊麂,義扃##尹^勿^敏游亡 細(xì)胞凋亡的程度是利用DNA分梯測(cè)定的?；蚪MDNA是按照制造 商的指導(dǎo)，使用QIAamp DNA血液試劑盒(Qiagen)，從分散的黃體細(xì) 胞或切除的黃體組織中分離的。黃體組織是在用PGF-2a處理誘導(dǎo)細(xì)胞 凋亡之前，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后1和24小時(shí)切除的。分離的DNA是通過(guò)用0.2jiCi [a-32P]dCTP， lmM Tris， 0. 5mM EDTA， 3個(gè)單位的克列諾酶， 和分別為0. 2 pM的dATP， dGTP，和dTTP室溫溫育500ng DNA30分鐘 而末端標(biāo)^己的。按照Sambrook等,斤述，^吏樣品通過(guò)lml Sepadex G-50柱而除去未摻入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸鹽-EDTA(l. 8%)凝 膠電泳分離樣品。室溫真空干燥凝膠30分鐘，-801C時(shí)，暴露于X-射 線膠片24小時(shí)。在其中一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，超數(shù)排卵大鼠黃體中細(xì)胞凋亡的程度是在注射 PGF-2a后0， 1， 24小時(shí)檢測(cè)的。在O小時(shí)的對(duì)照組中，切除沒有注 射PGF-2a的卵巢?？煞从撑c細(xì)胞凋亡有關(guān)的核酸酶活性的低分子量 DNA片段的分梯在對(duì)照組黃體組織中并不明顯，該對(duì)照組黃體組織是在 用PGF-2a處理前切除的，但在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的1小時(shí)內(nèi)就可看出， 并在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡24小時(shí)后更顯著，如圖16所示。在該圖中，上面 是用大鼠黃體細(xì)胞凋亡特異性DHS cDNA的32P-dCTP-標(biāo)記的3'-未翻 譯區(qū)探測(cè)的RNA印跡的放射自顯影照片。下面是總RNA的溴化乙錠染 色的凝膠。每道含有l(wèi)Ojig RM。該數(shù)據(jù)表明，血清剝奪后，存在著elF-5A 轉(zhuǎn)錄物的下調(diào)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，用鹽水代替PGF-2a處理相應(yīng)的對(duì)照組動(dòng)物。用 鹽水或PGF-2a處理15分鐘后，切除動(dòng)物的黃體。在切除動(dòng)物組織3 和6小時(shí)后，從黃體中分離基因組DNA。 DNA分梯和基因組DNA末端標(biāo) 記的增加在從用PGF-2a處理過(guò)的動(dòng)物中切除黃體組織6小時(shí)后變得較 為明顯，但在切除組織3小時(shí)后并不明顯。見圖17。當(dāng)用PGF-2a處 理15分鐘后切除黃體，并在體外條件下的EBSS (Gibco)中維持6小時(shí) 的時(shí)候，反映細(xì)胞凋亡的DNA分梯也很顯著。從基因組DNA更廣泛的 末端標(biāo)記可以看出，與細(xì)胞凋亡有關(guān)的核酸酶活性也很顯著。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，皮下注射500figPGF-2a誘導(dǎo)超數(shù)排卵。對(duì)照組 大鼠是用相等體積的鹽水溶液處理的。15-30分鐘后，切除卵巢，并用 膠原酶切碎。將使用PGF-2a處理過(guò)的大鼠的分散細(xì)胞在10mm谷氨酰 胺+10fflm亞精胺中溫育1小時(shí)，然后在沒有亞精胺的10mm谷氨酰胺(第 2道)中再溫育5小時(shí)或在10mm谷氨酰胺+10mm亞精胺中溫育1小時(shí)， 然后在10mm谷氨酰胺+lmm亞精胺中再溫育5小時(shí)(笫3道)。用鹽 水處理過(guò)的大鼠的對(duì)照細(xì)胞是用膠原酶分散的，并溫育1小時(shí)，然后 僅在谷氨酰胺中再溫育5小時(shí)(笫1道)。利用克列諾酶，使用[a-
"P]-dCTP標(biāo)記各樣品的500納克DNA，在1. 8%瓊脂糖凝膠上分離，并 暴露于膠片24小時(shí)。結(jié)果在圖18中給出。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，給超數(shù)排卵的大鼠皮下注射lmg/100g體重的亞 精胺，并以0. 333mg/100g體重的三次相等劑量，在皮下注射500jig PGF-2a之前的24， 12和2小時(shí)給藥。將對(duì)照組大鼠分成3組沒有 注射，注射3次亞精胺，但沒注射PGF-2a;以及在進(jìn)行PGF-2a處理 之前，注射3次相等體積的鹽水。在進(jìn)行前列腺素處理后1小時(shí)35分 鐘或3小時(shí)45分鐘，切除大鼠卵巢，用于分離DNA。利用克列諾酶， 使用[a-"P]-dCTP標(biāo)記各樣品的500納克DNA，在1. 8%瓊脂糖凝膠上 分離，并暴露于膠片24小時(shí)第1道，沒有注射(在與第3-5道相同 的時(shí)間處死動(dòng)物)；第2道，注射3次亞精胺(在與第3-5道相同的時(shí) 間處死動(dòng)物)；第3道，注射3次鹽水，然后注射PGF-2a(用PGF-2a 處理1小時(shí)35分鐘后，處死動(dòng)物)；第4道，注射3次亞精胺，然后 注射PGF-2a(用PGF-2a處理后1小時(shí)35分鐘，處死動(dòng)物)；第5道， 注射3次亞精胺，然后注射PGF-2a(用PGF-2a處理后1小時(shí)35分鐘， 處死動(dòng)物)；第6道，注射3次亞精胺，然后注射PGF-2a(用PGF-2a 處理3小時(shí)45分鐘后，處死動(dòng)物)；笫7道，注射3次亞精胺，然后 注射PGF-2a(用PGF-2a處理后3小時(shí)45分鐘，處死動(dòng)物)。結(jié)果在圖 19中給出。及W為、席總RNA是在用PGF-2a誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的不同時(shí)間，從大鼠切除的 黃體組織中分離的。簡(jiǎn)言之，將所述組織(5g)在液氮中磨碎。將磨碎 的粉末與30ml胍緩沖液(4M異硫氰酸胍，2. 5mM Na0Ac pH 8. 5， 0.8% (3-巰基乙醇)混合。通過(guò)4層Miracloth將混合物過(guò)濾，并于4TC時(shí)， 10， 000g離心30分鐘。然后使上清液經(jīng)過(guò)11， 200g的氯化銫密度梯度 離心達(dá)20個(gè)小時(shí)。用75%乙醇清洗成顆粒狀的RNA，將其重懸浮在 600ml EDPC-處理過(guò)的水中，然后在-70"C時(shí)，使用1. 5ml 9M乙醇和 60ml 3M NaOAc沉淀RNA。差順^時(shí)為、岸和為、脊 基因組DNA是根據(jù)制造商的指導(dǎo)，使用QIAamp DNA血液試劑盒(Qiagen)從提取的黃體組織或分散的黃體細(xì)胞中分離的。DNA是通 過(guò)用0.2jiCi [a-32p]dCTP， lmM Tris， 0. 5mM EDTA， 3個(gè)單位的克列 諾酶，和分另'J為0. 2 pM的dATP， dGTP，和dTTP室溫溫育500ng DNA 30分鐘而末端標(biāo)記的。按照Maniatis等所述的方法，使樣品通過(guò)lml Sepadex G-50柱而除去未摻入的核苷酸。然后利用Tris-醋酸鹽-EDTA(2W)凝膠電泳分離樣品。室溫真空干燥凝膠30分鐘，-80^時(shí)， 暴露于X-射線膠片24小時(shí)。#在扁"》、岸， Sambrook等所述的堿裂解法可用于分離質(zhì)粒DM。使用雙脫氧測(cè) 序法對(duì)全長(zhǎng)陽(yáng)性cDNA克隆進(jìn)行測(cè)序。Sanger等，Proc. Natl. Acad-Sci. USA, 74: 5463-5467?？勺x框是利用BLAST檢索(GenBank， Bethesda， MD)編輯并分才斤的，序列比對(duì)是利用BCM Search Launcher: MultipleSequence AlignmentsPat tern—Induced Multiple Alignment Method進(jìn)行的(見F. Corpet ， Nuc. Acids Res.， 16: 10881-10890， (1987)。序列和序列比對(duì)在圖5-11中給出。大鼠黃體RNA的RNA印跡雜交在細(xì)胞凋亡的不同階段，從大鼠黃體中分離的20毫克總RM是在 1%變性甲醛瓊脂糖凝膠上分離的，并固定在尼龍薄膜上。利用隨機(jī)引 物試劑盒(Boehringer) ， ^_用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-特 異性elF-5A cDNA(SEQ ID NO: 1)探測(cè)薄膜7xl07?？蛇x擇性地，利用 隨機(jī)引物試劑盒(Boehringer)，使用32P-dCTP標(biāo)記的全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋 亡一特異性DHS cDNA(SEQ ID NO: 6)探測(cè)薄膜(7x107cpm)。室溫用lx SSC， 0. 1%SDS清洗薄膜一次，65匸時(shí)用0. 2x SSC， 0. 1%SDS清洗3 次。干燥薄膜，并于-701C時(shí)，暴露于X-射線膠片過(guò)夜。從中看出，elF-5A和DHS在細(xì)胞凋亡黃體組織中都是上調(diào)的。在 用低濃度PGF-2a處理從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡后的0時(shí)間，細(xì)胞凋亡-特異 性elF-5A的表達(dá)顯著提高，在處理的1小時(shí)內(nèi)大大增加，在處理的8 小時(shí)內(nèi)仍然增加，在處理的24小時(shí)內(nèi)稍稍增加(圖14 ) 。 DHS的表達(dá) 在0時(shí)間時(shí)較低，在處理的1小時(shí)內(nèi)大大增加，在處理的8小時(shí)內(nèi)仍 然增加，在處理的24小時(shí)內(nèi)稍稍增加(圖15)。 炎^差f4 ,弄乂 e/F-i^ Wj Z勿應(yīng)游亡義處W a r-戶^ ,參與基因3，末端對(duì)應(yīng)的部分細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A序列(SEQ ID NO: ll)是使用從酵母菌，真菌和人elF-5A序列設(shè)計(jì)的寡核苷酸引物 對(duì)，利用RT-PCR，從細(xì)胞凋亡大鼠黃體RNA模板生產(chǎn)的。用于分離大 鼠elF-5A基因3，末端的上游引物是20個(gè)核苷酸的簡(jiǎn)并引物 5，TCSAARACHGGNAAGCAYGG3，(SEQ ID NO: 9)，其中S選自C和G; R選 自A和G; H選自A， T，和C; Y選自C和T; N是任意的核酸。用于分 離大鼠elF-5A基因3'末端的下游引物含有42個(gè)核苷酸 5'GCGAAGCTTCCATGG CTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3， (SEQ ID NO: 10)。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用5mg 下游引物合成cDNA的第一個(gè)鏈。然后將第一個(gè)鏈用作RT-PCR的模板， RT-PCR中同時(shí)使用上游和下游引物。在瓊脂糖凝膠上分離的RT-PCR產(chǎn)物揭示存在一個(gè)900bp的片段， 然后利用平端連接將其亞克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LaJolla， CA)中，并測(cè)序(SEQ ID NO:ll)。 3，末端的cDNA 序列是SEQ ID NO: 11， 3，末端的氨基酸序列是SEQ ID NO: 12。見圖 1-2。與基因5，末端對(duì)應(yīng)，并與3，末端重疊的部分細(xì)胞凋亡-特異性 elF-5A序列(SEQ ID NO: 15)是利用RT-PCR，從細(xì)胞凋亡大鼠黃體RNA 模板產(chǎn)生的。5，引物是具有序列5，CAGGTCTAGAGTTGGAATCGAAGC3，(SEQ IDN0: 13)的24聚體，它是從人eIF-5A序列設(shè)計(jì)的。3，引物是具有序 列5，ATATCTCGAGCCTT GATTGCAACAGCTGCC3，(SEQ ID NO:14)的30聚 體，它是根據(jù)3'末端的RT-PCR片段設(shè)計(jì)的。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反 應(yīng)(RT-PCR)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，使用5mg下游引物合成cDNA的第1個(gè)鏈。然 后將第1個(gè)鏈用作RT-PCR中的模板，RT-PCR中同時(shí)使用上游和下游 引物。在瓊脂糖凝膠上分離的RT-PCR產(chǎn)物揭示存在一個(gè)500bp的片段， 然后使用分別存在于上游和下游引物中的Xbal和Xhol克隆位點(diǎn)將其 亞克隆到pBluescript ( Stratagene Cloning 5'末端的氨基酸序列是SEQ ID NO: 16。見圖2。大鼠細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A的3，和5，末端序列(分別為SEQ ID NO: 11和SEQ ID N0:15)重疊，產(chǎn)生全長(zhǎng)cDNA序列(SEQ ID NO: 1)。 將該全長(zhǎng)序列與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)。見圖l-2。 cDNA 克隆編碼計(jì)算的分子量為16. 8KDa、具有154個(gè)氨基酸的多肽(SEQ ID NO: 2)。利用RT-PCR獲得的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性黃體elF-5A基因的 全長(zhǎng)cDNA的核苷酸序列SEQ ID NO: 1在圖3中描述，相應(yīng)的衍生氨基 酸序列是SEQ IDN0:9。將elF-5A的衍生全長(zhǎng)氨基酸序列與人和小鼠 elF-5A的序列進(jìn)行對(duì)比。見圖7-9。炎^差于乂 /^S淨(jìng)W辨j,勿應(yīng)游亡義薦#傳W W7W7(^與基因3，末端對(duì)應(yīng)的部分細(xì)胞凋亡-特異性DHS序列(SEQ ID NO: 6) 是使用從人DHS序列設(shè)計(jì)的一對(duì)寡核苷酸引物，通過(guò)RT-PCR從細(xì)胞凋 亡大鼠黃體RNA模板產(chǎn)生的。5，引物是具有序列 5，GTCTGTGTATTATTGGGCCC3,(SEQ ID N0:17)的20聚體；3'引物是具 有序列5'GCGAAGCTTCCATGGC TCGAGTTmmTTTTmmm3" (SEQ ID N0:18)的42聚體。進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。簡(jiǎn)單地 說(shuō)，使用5mg的下游引物合成cDNA的第1個(gè)鏈。然后將第1個(gè)鏈用作 RT-PCR的模板，RT-PCR同時(shí)使用上游和下游引物。在瓊脂糖凝膠上分離的RT-PCR產(chǎn)物揭示存在一個(gè)606bp的片段， 利用平端連接將其亞克隆到pBluescriptTM(Stratagene Cloning Systems, LsJolla， CA)中，并測(cè)序(SEQ ID NO: 6)。通過(guò)RT-PCR獲 得的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性黃體DHS基因的部分cDNA的核苷酸序列 (SEQ IDN0:6)在圖4中描述，對(duì)應(yīng)的衍生氨基酸序列是SEQ ID NO: 7。差茵逸#浙 進(jìn)行DNA印跡的基因組DNA是從切除的大鼠卵巢中分離出來(lái)的。 將大約lOOmg的卵巢組織分成小份，放在15ml試管中。使用1ml PBS， 通過(guò)輕輕振搖組織混懸液而將組織清洗兩次，然后使用移液管吸出 PBS。將組織重懸浮在2. 06ml的DNA-緩沖液(O. 2M Tris-HCl pH 8. 0 和0. ImM EDTA)中，加入240[il的10%SDS和lOOjil的蛋白酶 K(Boehringer Manheim; 10mg/ml)。將組織放在45X:的水浴中振搖
過(guò)夜。第2天，再加入lOOfil蛋白酶K(10mg/ml)，然后在451C的水 浴中溫育組織混懸液4小時(shí)。溫育后，用相等體積的苯酚氯仿異戊 醇(25:24:1)提取組織混懸液1次，然后用相等體積的氯仿異戊醇 (24:1)提取1次。提取后，加入1/10體積的3M醋酸鈉(pH5. 2)和2 個(gè)體積的乙醇。用本生燈將玻璃移液管密封，并彎成鉤狀，用于從溶 液中拉出DNA絲，并將DNA轉(zhuǎn)移到干凈的微量離心管中。將DNA在70 %乙醇中清洗1次，風(fēng)干10分鐘。將DNA顆粒狀物溶解在500^1的 10mM Tris-HCl (pH8. 0)中，加入1 Ojil RNA酶A (1 Omg/ml) ， 371C溫育 DNA1小時(shí)。用苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1)提取DNA—次，通過(guò)加入 1/10體積的3M醋酸鈉(pH5. 2)和2個(gè)體積的乙醇而使DNA沉淀。4"C 時(shí)，通過(guò)13, OOOxg離心IO分鐘而使DNA成顆粒狀物。將DNA顆粒狀 物在70%乙醇中清洗1次，然后通過(guò)4TC時(shí)，使DNA旋轉(zhuǎn)過(guò)夜而將其 溶解在200nl的10mM Tris-HCl (pH 8. 0)中。為了進(jìn)行DNA印跡分析，用各種限制酶消化從大鼠卵巢中分離的 基因組DNA，所述限制酶或者不在內(nèi)源性基因中切割，或者僅切割一 次。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，使10ng基因組DNA， 20fil IOX反應(yīng)緩沖液和 100U限制酶在總共200(il的反應(yīng)體積中反應(yīng)5-6小時(shí)。將消化的DNA 加樣到0. 7%瓊脂糖凝膠上，40伏電泳6小時(shí)或15伏電泳過(guò)夜。電泳 后，使凝膠在0. 2N HC1中脫嘌呤10分鐘，接著在變性溶液(O. 5M Na0H， 1.5MNaCl)中清洗兩次，每次15分鐘，然后在中和緩沖液(1. 5M NaCI， 0. 5M Tris-HCl pH7.4)中清洗兩次，每次15分鐘。將DNA轉(zhuǎn) 移到尼龍薄膜上，使薄膜在雜交溶液(40%甲酰胺，6X SSC， 5X Denhart's溶液(1X Denhart、溶液是0. 02%Ficol 1 ， 0. 02%PVP，和 0. 02%BSA)， 0. 5%SDS，和1. 5mg變性鮭魚精子DNA)中預(yù)雜交。利用隨 機(jī)引物，使用[a-32p]-dCTP標(biāo)記大鼠elF-5A cDNA 3，UTR的700bpPCR 片段(650bp的3，UTR和50bp的編碼)，然后以1 X 106cpm/ml加到薄 膜上。同樣，利用隨機(jī)引物，使用[a-32P]-dCTP標(biāo)記大鼠DHS cDNA的 606bp PCR片段(450bp的編碼和156bp的3，UTR)，然后以1 X 106cpm/ml加入到第2張相同的薄膜上。印跡在42t!雜交過(guò)夜，42TC 用2X SSC和0. 1%SDS清洗1次，然后421C用IX SSC和0. 1%SDS清洗 2次。然后使印跡暴露于膠片3-10天。36
按照?qǐng)D20所示，用限制酶切割大鼠黃體基因組DNA，并用32P-dCTP-標(biāo)記的全長(zhǎng)elF-5A cDNA探測(cè)。高度嚴(yán)格條件下的雜交揭示了全長(zhǎng) cDNA探針與每個(gè)限制酶消化的DNA樣品的若干限制片段雜交，表明若 干elF-5A同種型的存在。特別值得注意的是，當(dāng)使用EcoRV (它在細(xì) 胞凋亡-特異性elF-5A的可讀框內(nèi)具有一個(gè)限制位點(diǎn))消化大鼠基因 組DNA時(shí)，在DNA印跡中可檢測(cè)到elF-5A細(xì)胞凋亡-特異性同種型的2 個(gè)限制片段。這兩個(gè)片段在圖20中用雙箭頭表示。與elF-5A細(xì)胞凋 亡-特異性同種型對(duì)應(yīng)的限制片段在標(biāo)記了 EcoRI和BamHI的道中是用 單箭頭表示的，所述限制酶在可讀框內(nèi)沒有切割位點(diǎn)。這些結(jié)果表明， 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A在大鼠中是單拷貝基因。如圖5-13所示，物 種間的elF-5A基因高度保守，從而預(yù)期在任何物種的同種型間，存在 大量保守。圖21表示用32p-dCTP-標(biāo)記的部分大鼠黃體細(xì)胞凋亡-特異性DHS cDNA探測(cè)的DNA印跡?；蚪MDNA是用EcoRV， 一種不會(huì)切割被用作 探針的部分cDNA的限制酶切割的。其中有兩個(gè)限制片段非常明顯，表 明基因有兩個(gè)拷貝，或該基因含有帶EcoRV位點(diǎn)的內(nèi)含子。實(shí)施例2本實(shí)施例證實(shí)使用細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。C0S-7， 一種使用編碼野生型T抗原的SV40突變體轉(zhuǎn)化的非洲綠 猴腎成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞系，可用于所有以轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)。C0S-7 細(xì)胞是在Dulbecco，s修飾Eagle，s培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)的，每升培養(yǎng) 基含有0. 584克L-谷氨酰胺，4.5g葡萄糖，和O. 37%碳酸氫鈉。培養(yǎng) 基中還補(bǔ)充了 10。/。的胎牛血清(FBS)和100個(gè)單位的青霉素/鏈霉素。 細(xì)胞在37TC、 5。/。C02和95%空氣的濕潤(rùn)環(huán)境下生長(zhǎng)。每3-4天，通過(guò) 用0. 25%胰蛋白酶和lmM EDTA的溶液使粘著的細(xì)胞分離而再次培養(yǎng) 該細(xì)胞。將分離的細(xì)胞以1:10的比例分散在含有新鮮培養(yǎng)基的新的培 養(yǎng)皿中。用于分離RNA的C0S-7細(xì)胞是在150-mm組織培養(yǎng)亞(Corning)中
生長(zhǎng)的。通過(guò)用胰蛋白酶-EDTA溶液分離它們而采集細(xì)胞。將采集的細(xì) 胞收集在離心管中，通過(guò)3000rpm離心5分鐘而使細(xì)胞成顆粒狀物。 除去上清液，將細(xì)胞顆粒狀物在液氮中瞬間冷凍。按照制造商的建議， 使用GenE 1 ut e哺乳動(dòng)物總RNA微量制備試劑盒(S igma)分離冷凍細(xì)胞 的RNA。,逸^在辨種建希CM-7勿應(yīng)^脊染 攜帶有:5Ur向大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A的4^碼序列，攜帶^JC方向大鼠細(xì) 胞凋亡elF-5A的3，未解區(qū)(UTR)的重纟贈(zèng)粒是^^哺乳動(dòng)物表^j^e4Ji^ 體，pHM6 (Roche Molecular Biochemicals)構(gòu)建的，如圖21所示。所ii^體 含有下列CMV啟動(dòng)子-人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子；來(lái)源于流感血細(xì) 艦集素的HA-ym^^敏BGH pA-牛生錄素絲苷酸條號(hào)；f lori-f 1 起泉；SV40ori-SV40早期啟動(dòng)子械泉；新霉素-新霉素私性(G418)基因；SV40 pA-SV40l^^苷酸^fl"號(hào)；Col El-Col El起泉；氨爺西林-氨節(jié)西綠錄因。 大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A的4^M^碼序列和大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A的3，UTR是通過(guò) PCR，從pBluescript中的原始大鼠elF-5A的RT-PCR片段擴(kuò)增的(SEQ ID NO: 1)。為了擴(kuò)增全長(zhǎng)elF-5A ， 所用引物如下正向5 ， GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTT GG3， (Hind3) ( SEQ ID NO: 22 )和反向5， CTGAATTCCAGT TATTTTGCCATGG3， (EcoRl) (SEQ ID NO: 23)。為了擴(kuò)增3，UTR 大鼠elF-5A，所用引物如下正向5， AATGAATTCCGCCATGACAGAGGAGGC3， (EcoRl) ( SEQ ID NO: 24 ) 和 反 向 5 ， GCGAAGCTTCCATGGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT3， (Hind3) (SEQ ID NO: 10)。 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后分離的全長(zhǎng)大鼠elF-5A PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為 430bp，而3'UTR大鼠elF-5A PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為697bp。將兩個(gè)PCR 產(chǎn)物亞克隆到pHM6的Hind3和EcoRl位點(diǎn)中，從而制備pHM6-全長(zhǎng) elF-5A和pHM6-反義3'UTR eIF-5A。用來(lái)源于多克隆位點(diǎn)上游的流感 血細(xì)胞凝集素(HA)的九肽表位標(biāo)記將全長(zhǎng)大鼠eIF-5APCR產(chǎn)物亞克 隆到讀框中，從而使用抗-[HA]-過(guò)氧化物酶抗體檢測(cè)重組蛋白。表達(dá) 是由人巨細(xì)胞病毒立即早期啟動(dòng)子/增強(qiáng)子驅(qū)動(dòng)的，從而確保在哺乳動(dòng) 物細(xì)胞系中高水平表達(dá)。所述質(zhì)粒還可提供用于選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子的新 霉素抗性(G418)基因，以及在表達(dá)SV40大型T抗原的細(xì)胞，如C0S-7 細(xì)胞中進(jìn)行附加型復(fù)制的SV40早期啟動(dòng)子和起點(diǎn)。
轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中使用的COS-7細(xì)胞或者在24孔細(xì)胞培養(yǎng)平板 (Corning)中培養(yǎng)，用于提取細(xì)胞的蛋白，或者在4室培養(yǎng)載玻片 (Falcon)中培養(yǎng)，用于將細(xì)胞染色。細(xì)胞在補(bǔ)充了 10%FBS，但沒 有青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至50-70%融合。24-孔平板的 其中一個(gè)孔或培養(yǎng)載玻片所需的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基是通過(guò)將0. 32jig質(zhì)粒DNA 在42. 5fil無(wú)血清的DMEM中稀釋，并在室溫溫育混合物15分鐘而制備 的。將1.6ji1的轉(zhuǎn)染試劑，脂轉(zhuǎn)染胺(Gibco， BRL)在42. 5fil無(wú)血清 的DMEM中稀釋，室溫溫育5分鐘。5分鐘后，將脂轉(zhuǎn)染胺混合物加入 到DNA混合物中，室溫共同溫育30-60分鐘。在覆蓋轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基之前， 用無(wú)血清的DMEM清洗待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞1次，然后將細(xì)胞放回到生長(zhǎng)室中 溫育4小時(shí)。溫育后，向細(xì)胞中加入0. 17ml的DMEM + 20%FBS。在先于染色進(jìn) 行的、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡之前，或采集進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析之前，將細(xì)胞 再培養(yǎng)40小時(shí)。作為對(duì)照，還要進(jìn)行模擬轉(zhuǎn)染，其中的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中 沒有質(zhì)粒DNA。蛋冷炎承 一蛋伊遂 進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡的蛋白是通過(guò)在PBS(8g/L NaCl， 0. 2g/L KC1， 1.44g/L Na2HP(K，和0. 24g/L KILPOO中將細(xì)胞清洗2次，然后加入 150jil熱的SDS凝膠-加樣緩沖液(50mM Tris-HC1 pH6. 8， lOOmM 二 硫蘇糖醇，2%SDS， 0. 1%溴酚藍(lán)，和10%甘油)而從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離出 來(lái)的。將細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物收集在微量離心管中，951C加熱10分鐘，然 后13, 000 x g離心IO分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，-20 1C貯存?zhèn)溆?。為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離2.5或 5fig的總蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后將薄膜 在封閉溶液(5%脫脂乳粉末，0. 02%疊氮化鈉的PBS溶液)中溫育1小 時(shí)，并在PBS-T(PBS + 0. 05%吐溫-20)中清洗3次，每次15分鐘。將 薄膜在41C的PBS-T中貯存過(guò)夜。第2天溫?zé)嶂潦覝睾?，將薄膜?lHg/ml的聚乙烯醇中封閉30秒。將薄膜在去離子水中清洗5次，然 后在5%乳汁的PBS溶液中封閉30分鐘。在與薄膜溫育前，將第一抗 體在5%乳汁的PBS溶液中預(yù)溫育30分鐘。
可使用多種第一抗體。使用1: 5000稀釋的抗-[HA]-過(guò)氧化物酶抗 體(Roche Molecular Biochemicals)檢觀J重組蛋白的表達(dá)。因?yàn)檫@種 抗體與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，因此無(wú)需第二抗體，清洗印跡并利用化學(xué)發(fā) 光顯色?？墒褂玫钠渌室豢贵w是來(lái)源于Oncogene的單克隆抗體，它 可識(shí)另'J p53(Ab-6)， Bcl-2(Ab-l)，和c-Myc (Ab-2) 。 p53的單克隆 抗體是以0. ljig/ml的稀釋度使用的，Bcl-l和c-Myc的單克隆抗體 是以0. 83ng/ml的稀釋度使用的。用第一抗體溫育60-90分鐘后，將 薄膜在PBS-T中清洗3次，每次15分鐘。然后將第二抗體在1%乳汁 的PBS溶液中稀釋，與薄膜溫育60-90分鐘。當(dāng)使用p53(Ab-6)作為 第一抗體時(shí)，所用的第二抗體是1: 1000稀釋的、與堿性磷酸酶偶聯(lián)的 山羊抗-小鼠IgG (Rockland)。當(dāng)使用Bcl-2 (Ab-l)和c-Myc (Ab-2)作 為第一抗體時(shí)，使用1:5000稀釋的、與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗-小鼠 IgG(Sigma)。用第二抗體溫育后，將薄膜在PBS-T中清洗3次。比色法和化學(xué)發(fā)光法這兩種檢測(cè)方法用于使印跡顯色。僅當(dāng)使用 p53(Ab-6)作為笫一抗體，以及堿性磷酸酶-偶聯(lián)的第二抗體時(shí)，使用 比色法。結(jié)合抗體是通過(guò)在黑暗中，在0. 33mg/mL硝基藍(lán)四唑鋪， 0. 165mg/mL 5-溴-4-氯-3-丐l哚基磷酸鹽，100mM NaCl， 5mM MgCl" 和100mM Tris-HCl (pH 9. 5)的溶液中溫育而目測(cè);現(xiàn)察的。顯色反應(yīng)通 過(guò)在2mMEDTA的PBS溶液中溫育印跡而終止?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)法可用于 所有其它的第一抗體，包括抗-[HA]-過(guò)氧化物酶，Bel-2(Ab-1)，和 c-Myc (Ab-2) 。 ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢效，J試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于檢測(cè)過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的結(jié)合抗體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將薄膜輕 輕吸干，然后在黑暗中，與試劑A和試劑B的40: 1混合物溫育5分鐘。 將薄膜吸干，放在醋酸鹽層之間，暴露于X-射線膠片接觸IO秒-IO分 鐘。^tV^ 7勿應(yīng)吵謬,勿應(yīng)游亡 血清剝奪以及用放線菌素D，鏈霉菌(Calbiochem)處理這兩種方 法都可用于在轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。對(duì)于兩種處理方法 而言，轉(zhuǎn)染后40小時(shí)除去培養(yǎng)基。對(duì)于血清饑餓實(shí)驗(yàn)而言，用無(wú)血清 和抗生素的DMEM替換培養(yǎng)基。將在補(bǔ)充了 10 % FBS 、沒有抗生素的DMEM 中生長(zhǎng)的細(xì)胞用作對(duì)照。對(duì)于放線菌素D誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而言，用補(bǔ)
充了 10%FBS和ljig/ml放線菌素D的曱醇溶液、且沒有抗生素的DMEM 替換培養(yǎng)基。對(duì)照組細(xì)胞是在補(bǔ)充了 10%FBS和相等體積甲醇、且沒 有抗生素的DMEM中生長(zhǎng)的。對(duì)于兩種方法而言，凋亡細(xì)胞的百分比是 在用Hoescht或膜聯(lián)蛋白V-Cy3染色48小時(shí)后測(cè)定的。細(xì)胞凋亡的 誘導(dǎo)還可通過(guò)RNA印跡分析加以證實(shí)，如圖22所示。Aoe"力f染g核染料Hoescht用于標(biāo)記轉(zhuǎn)染的C0S-7細(xì)胞的核，從而鑒定以形 態(tài)學(xué)特征，如核斷裂及凝聚為基礎(chǔ)的凋亡細(xì)胞。使用前，即時(shí)制備固 定的，由無(wú)水曱醇和水醋酸的3:1混合物組成的固定劑。然后向在培 養(yǎng)載玻片上生長(zhǎng)的C0S-7細(xì)胞培養(yǎng)基中加入相等體積的固定劑，并溫 育2分鐘。除去細(xì)胞中的培養(yǎng)基/固定劑混合物，并棄去，向細(xì)胞中加 入lml的固定劑。5分鐘后，棄去固定劑，向細(xì)胞中加入lml新鮮的固 定劑，溫育5分鐘。棄去固定劑，在加入lml的Hoescht染色劑 (0. 5ng/ml Hoescht 33258的PBS溶液)前，將細(xì)胞風(fēng)干4分鐘。在 黑暗中溫育10分鐘后，棄去染色溶液，用去離子水清洗載玻片3次， 每次l分鐘。清洗后，向細(xì)胞中加入lml的McIlvaine，s緩沖液(O. 021M 檸檬酸，0. 058M NazHPO" 7IL0; pH5. 6)，并在黑暗中溫育20分鐘。 棄去緩沖液，將細(xì)胞在黑暗中風(fēng)干5分鐘，并除去分離培養(yǎng)載玻片各 孔的室。在載玻片上加幾滴熒光Vectashield封固劑(Vector Laboratories),并蓋上蓋玻片。在使用UV濾光器的熒光顯微鏡下可 觀察到染色的細(xì)胞，將鮮明染色或核斷裂的細(xì)胞記錄為細(xì)胞凋亡。篪炎f冷F-0^染^ 膜聯(lián)蛋白V-Cy3細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Sigma)用于熒光標(biāo)記凋亡 細(xì)胞上外在化的磷脂酰絲氨酸。按照制造商的方案使用該試劑盒，并 進(jìn)行下列改進(jìn)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，用PBS清洗在四室培養(yǎng)載玻片上生長(zhǎng)的轉(zhuǎn) 染的C0S-7細(xì)胞2次，用1X結(jié)合緩沖液清洗3次。加入150|il染色溶 液(溶解在1X結(jié)合緩沖液中的lng/ml AnnCy3)，在黑暗中溫育細(xì)胞 10分鐘。然后除去染色溶液，用1X結(jié)合緩沖液清洗細(xì)胞5次。除去培 養(yǎng)載玻片上的室壁，并將幾滴1X結(jié)合緩沖液放在細(xì)胞上，蓋上蓋玻片。 使用綠色濾光器，通過(guò)熒光顯微鏡檢查分析染色的細(xì)胞，從而觀察到
陽(yáng)性染色(凋亡)細(xì)胞的紅色熒光?？偧?xì)胞群是通過(guò)在可見光下計(jì)算 細(xì)胞數(shù)而測(cè)定的。實(shí)施例3本實(shí)施例證實(shí)使用細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。使用前面實(shí)施例描述的方法和一般過(guò)程，圖23是舉例說(shuō)明C0S-7 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的流程圖，其中將無(wú)血清培養(yǎng)基中的細(xì)胞在脂轉(zhuǎn)染胺的 質(zhì)粒DNA中溫育4小時(shí)，加入血清，將細(xì)胞再溫育40小時(shí)?；蛘咴谶M(jìn) 行分析之前，將細(xì)胞在含有血清的規(guī)則培養(yǎng)基中再培養(yǎng)48小時(shí)(即， 沒有進(jìn)一步的處理)，或者在進(jìn)行分析之前，使血清缺失48小時(shí)而誘 導(dǎo)細(xì)胞凋亡，或者在進(jìn)行分析之前，用放線菌素D處理48小時(shí)而誘導(dǎo) 細(xì)胞凋亡。圖22是舉例說(shuō)明使用pHM6轉(zhuǎn)染后，外源性蛋白在C0S-7細(xì)胞中 的瞬時(shí)表達(dá)。蛋白是在模擬轉(zhuǎn)染，或用pHM6-LacZ， pHM6-反義 3，rF5A(pHM6-反義3，UTR大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A)，或p畫6-有義 rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，從C0S-7細(xì)胞 中分離出來(lái)的。各樣品的5jig蛋白是通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離的，然后 轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜上，使用抗-[HA]-過(guò)氧化物酶進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。利用 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)合抗體，并使其暴露于X-射線膠片30秒。LacZ(笫2 道)和有義大鼠細(xì)胞凋亡elF-5A (第4道)的表達(dá)清晰可見。如上所述，或者模擬轉(zhuǎn)染或者用pHM6-有義rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠 elF-5A)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，通過(guò)剝奪血清48小時(shí)而誘 導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷凋亡。使用熒光同源性天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶 測(cè)定試劑盒(Roche Diagnostics)測(cè)量轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取物中的天門冬氨 酸特異性半胱氨酸蛋白酶的蛋白水解活性。還可使用FragELDNA斷裂 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Oncogene)測(cè)量DNA的斷裂，該試劑盒使用熒光 素-標(biāo)記的脫氧核苷酸標(biāo)記DNA片段的暴露3'0H末端。模擬轉(zhuǎn)染或用pHM6-有義rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠elF-5A)轉(zhuǎn)染其它 COS-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，使細(xì)胞在含血清的常規(guī)培養(yǎng)基中再生長(zhǎng) 48小時(shí)(沒有進(jìn)一步的處理)，通過(guò)剝奪血清48小時(shí)而誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷 凋亡，或通過(guò)用0. 5ng/ml放線菌素D處理48小時(shí)而誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷凋
亡?；蛘哂肏oescht 33258將細(xì)胞染色，它可描述伴隨細(xì)胞凋亡的核 斷裂，或者用膜聯(lián)蛋白V-Cy3將細(xì)胞染色，它可描述伴隨細(xì)胞凋亡的 磷脂酰絲氨酸暴露。此外，還可使用綠色濾光器，通過(guò)熒光顯微鏡檢 查觀察染色的細(xì)胞，并進(jìn)行計(jì)數(shù)，從而測(cè)定經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞百分比。 總細(xì)胞群是在可見光下計(jì)數(shù)的。圖25說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，天門冬 氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性的增加反映的。大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的 eIF-5A表達(dá)導(dǎo)致天門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶活性增加60%。圖26說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，DNA斷 裂的增加反映的。大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A表達(dá)導(dǎo)致DNA斷裂增 加273%。圖27說(shuō)明細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞 凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，核 斷裂的增加反映的。圖28說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全 長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7 細(xì)胞時(shí)，核斷裂的增加反映的。大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A表達(dá)分 別導(dǎo)致非-血清饑餓樣品和血清饑餓樣品對(duì)照組中的核斷裂增加27%和 63%。圖29說(shuō)明細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，磷脂酰 絲氨酸暴露的增加反映的。圖30說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用 含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞調(diào)亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 C0S-7細(xì)胞時(shí)，磷脂酰絲氨酸暴露的增加反映的。大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo) 的elF-5A表達(dá)分別導(dǎo)致非-血清饑餓樣品和血清饑餓樣品對(duì)照組中的 磷脂酰絲氨酸暴露增加140%和198%。圖31說(shuō)明細(xì)胞凋亡的增加，它是通過(guò)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡 -誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，核斷裂 的增加反映的。大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A表達(dá)分別導(dǎo)致未處理樣 品和處理樣品對(duì)照組中的核斷裂增加115%和62%。圖32說(shuō)明在使用含 有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的p固6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 COS-7細(xì)胞的條件下，細(xì)胞凋亡增加的對(duì)比，其中對(duì)C0S-7細(xì)胞沒有
進(jìn)行進(jìn)一步的處理或進(jìn)行了處理而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。實(shí)施例4本實(shí)施例證實(shí)給予細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A和DHS后，調(diào)節(jié)細(xì)胞 凋亡活性。此外，或者模擬轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-有 義rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠eIF-5A)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞，溫育40小時(shí)。各 樣品的5ng蛋白提取物樣品是通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離的，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF薄膜上，使用可識(shí)別Bcl-2的單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將與 過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗-小鼠IgG用作第二抗體，利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié) 合抗體，并使其暴露于X-射線膠片。結(jié)果如圖32所示。與使用 pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的那些相比，在使用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中僅 檢測(cè)到更少量的Bel-2;因此，Bcl-2是下調(diào)的?；蛘吣M轉(zhuǎn)染，用pHM6-反義3'rF5A(大鼠細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A的pHM6-反義3，UTR)轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-有義rF5A (pHM6-全長(zhǎng)大鼠 細(xì)胞凋亡特異性eIF-5A)轉(zhuǎn)染其它C0S-7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染40小時(shí)后，通過(guò) 剝奪血清48小時(shí)而誘導(dǎo)細(xì)胞經(jīng)歷凋亡。各樣品的5fig蛋白提取物樣品 是通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離的，然后轉(zhuǎn)移到PVDF薄膜上，使用可識(shí)別 Bel-2的單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗-小 鼠IgG用作第二抗體，利用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)結(jié)合抗體，并使其暴露于X-射線膠片。此外，或者模擬轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-有 義rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠elF-5A)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞，溫育40小時(shí)。各 樣品的5ng蛋白提取物樣品是通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離的，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF薄膜上，使用可識(shí)別p53的單克隆抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將與堿 性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG用作第二抗體，利用比色法檢測(cè)結(jié)合 抗體。最后，或者模擬轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-有 義rF5A(pHM6-全長(zhǎng)大鼠eIF-5A)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，溫育40小時(shí)。各 樣品的5jig蛋白提取物樣品是通過(guò)SDS-PAGE分級(jí)分離的，然后轉(zhuǎn)移到 PVDF薄膜上，使用可識(shí)別p53的單克隆抗體探作為探針進(jìn)行雜交。相 應(yīng)的蛋白印跡是用抗-[HA]-過(guò)氧化物酶探測(cè)的，從而測(cè)定大鼠細(xì)胞凋
亡-特異性elF-5A的表達(dá)水平。將與堿性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠 IgG用作笫二抗體，利用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)結(jié)合抗體。圖33說(shuō)明當(dāng)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6， 按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，Bcl-2的下調(diào)。上面是考馬斯藍(lán) 染色的蛋白印跡；下面是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。與使用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染 的那些相比，在使用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到更少量的 Bcl-2。圖34說(shuō)明當(dāng)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6， 按反義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，Bcl-2的上調(diào)。上面是考馬斯藍(lán) 染色的蛋白印跡；下面是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。與模擬轉(zhuǎn)染或使用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的那些相比，在使用pHM6-反義3'rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢 測(cè)到更多的Bcl-2。圖35說(shuō)明當(dāng)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的 pHM6，按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，c-Myc的上調(diào)。上面是考 馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡；下面是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。與使用pHM6-LacZ 或模擬對(duì)照組轉(zhuǎn)染的那些相比，在使用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中 檢測(cè)到更多的c-Myc。圖36說(shuō)明當(dāng)使用含有全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的elF-5A的pHM6， 按有義方向瞬時(shí)轉(zhuǎn)染C0S-7細(xì)胞時(shí)，p53的上調(diào)。上面是考馬斯藍(lán)染 色的蛋白印跡；下面是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。與使用pHM6-LacZ或模擬 對(duì)照組轉(zhuǎn)染的那些相比，在使用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到 更多的p53。圖37說(shuō)明p53上調(diào)依賴于pHM6-全長(zhǎng)大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo)的eIF-5A在C0S-7細(xì)胞中的表達(dá)。在使用抗-[HA]-過(guò)氧化物酶探測(cè)蛋白質(zhì)印 跡中，上面是考馬斯藍(lán)染色的蛋白質(zhì)印跡，下面是相應(yīng)的蛋白質(zhì)印跡。 與第2次轉(zhuǎn)染相比，在第1次轉(zhuǎn)染中檢測(cè)到更多的大鼠細(xì)胞凋亡-誘導(dǎo) 的eIF-SA。在使用抗-p53作為探測(cè)蛋白質(zhì)印跡中，A中上面是相應(yīng)的 考馬斯藍(lán)染色的蛋白印跡，下面是使用p53的蛋白質(zhì)印跡。對(duì)于笫1 次轉(zhuǎn)染而言，與使用pHM6-LacZ或模擬對(duì)照組轉(zhuǎn)染的那些相比，在使 用pHM6-有義rF5A轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中檢測(cè)到更多的p53。對(duì)于其中大鼠細(xì) 胞凋亡誘導(dǎo)的eIF-5A表達(dá)水平較低的笫2次轉(zhuǎn)染而言，在使用pHM6-有義rF5A， pHM6-LacZ或模擬對(duì)照組轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間，沒有檢測(cè)到p53 水平的差異。實(shí)施例5本實(shí)施例證實(shí)細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A可誘導(dǎo)具有活性p53的細(xì) 胞(RK0細(xì)胞)以及沒有活性p53的細(xì)胞(RK0-E6細(xì)胞)凋亡，表明 細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A可通過(guò)與p53不同的途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡。這 還可支持我們的觀點(diǎn)，即它在上游發(fā)揮作用，很可能殺死多種不同類 型的癌癥。本實(shí)施例還表明elF-5Al的活性位點(diǎn)是蛋白的羧基末端(即，見， 使用截短elF-5A進(jìn)行的實(shí)驗(yàn))，它很可能含有RNA結(jié)合域。此外，本實(shí)施例還可證實(shí)人elF-5A2最可能是增殖elF-5A，這是 因?yàn)樗荒苷T導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，據(jù)信人數(shù)據(jù)庫(kù)中的兩種eIF-5A基因， 細(xì)胞凋亡-特異性elf-5Al是細(xì)胞凋亡基因，elF-5A2是增殖基因。和<f勿應(yīng)"凝# RKO(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CRL-2577)， 一種表達(dá)野生型p53 的人結(jié)腸癌細(xì)胞系，和RK0-E6(美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心CRL-2578)， 一種來(lái)源于RKO的細(xì)胞系，其含有穩(wěn)定整合的人乳頭狀瘤病毒 E6致癌基因，可導(dǎo)致正常p53水平和功能的降低，上述這兩種細(xì)胞都 可用于以轉(zhuǎn)染為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)。RK0和RK0-E6細(xì)胞是在含有非必需氨基 酸，Earle，s鹽，和L-谷氨跣胺的極限必需培養(yǎng)基Eagle (MEM)中培養(yǎng) 的。培養(yǎng)基中還補(bǔ)充了 10%胎牛血清(FBS)和100個(gè)單位的青霉素/ 鏈霉素。細(xì)胞在371C、 5%0)2和95%空氣的濕潤(rùn)環(huán)境中生長(zhǎng)。每3-4天， 通過(guò)使用0. 25%胰蛋白酶和lmM EDTA的溶液分離粘著的細(xì)胞而將細(xì) 胞再次培養(yǎng)。將分離的細(xì)胞以1:10-1:12的比例分散在新培養(yǎng)皿中的 新鮮培養(yǎng)基中。乂 e/尸JJ2 W乂發(fā)使用根據(jù)從Genbank獲得的人elF-5A2序列設(shè)計(jì)的引物 (ACCESSION XM-113401),通過(guò)RT-PCR，從RKO細(xì)胞的RNA中分離人 elF5A2。圖38提供從RKO細(xì)胞中分離的人elF-5A的序列與人elF-5A2 的序列的對(duì)比。RNA是使用GenElute哺乳動(dòng)物總RNA微量制備試劑盒 (Sigma)從RK0細(xì)胞中分離的。用于擴(kuò)增elF5A2的正向引物具有序列 5，AAACTACCATCTCCCCTGCC3，， 反向引物具有序列 5'TGCCCTACACAGGCTGAAAG3'。將所得的936bp PCR產(chǎn)物亞克隆到 pGEM-T Easy栽體(Promega)中，并測(cè)序。然后將pGEM-T Easy-elF5A2構(gòu)建體用作模板，產(chǎn)生亞克隆到哺乳 動(dòng)物表達(dá)載體pHM6 (Roche)的讀框中的elF5A2 PCR片段。用于擴(kuò)增人 elF5A2的正向引物是5， ATCAAGCTTGCCCACCATGGCAGACG3，，反向引 物是5， AACGAATTCCATGCCTGATGTTTCCG3，。所得的505bpPCR產(chǎn)物是 用Hind3和EcoR 1消化的，并亞克隆到pHM6的Hind3和EcoRl位點(diǎn)中。e/,"J ^游建為了確定elF5Al的羧基末端是否對(duì)其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的活性很重 要，構(gòu)建羧基末端缺失的elF5Al。編碼氨基酸1-127的截短的elF5Al 是使用pBS-大鼠elF5Al作為模板，利用PCR產(chǎn)生的。正向PCR引物 是5 ， GCCAAGCTTAATGGCAGATGATTTGG3 ，， 反向引物是5 ， TCCGAATTCGTACTTCTGCTCAATC3，。所得的390bp PCR產(chǎn)物是用Hind 3 和EcoR l消化的，并被亞克隆到pHM6的Hind 3和EcoR l位點(diǎn)中。脊染轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中所用的RKO或RK0-E6細(xì)胞進(jìn)行Hoecht染色時(shí)，是在8 孔室培養(yǎng)栽玻片(Falcon)中培養(yǎng)的，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析時(shí)， 是在6孔平板中培養(yǎng)的。所述細(xì)胞在補(bǔ)充了 10%胎牛血清，但沒有青 霉素/鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至70-80%融合。8孔培養(yǎng)載玻片的 其中一個(gè)孔所需的轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基是通過(guò)將0. 425jig質(zhì)粒DNA稀釋在22nl 無(wú)血清的MEM中，室溫溫育混合物15分鐘而制備的。將0. 85jil的轉(zhuǎn) 染試劑，脂轉(zhuǎn)染胺(Gibco， BRL)稀釋在22jil無(wú)血清的MEM中，室溫 溫育5分鐘。5分鐘后，將脂轉(zhuǎn)染胺混合物加入到DNA混合物中，室溫 溫育30-60分鐘。在向轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入44nl MEM，并將它覆蓋在細(xì) 胞上之前，用無(wú)血清的MEM清洗細(xì)胞1次。將細(xì)胞放回到生長(zhǎng)室中達(dá)4 小時(shí)。溫育后，向細(xì)胞中加入88fil的MEM+20%FBS。然后將細(xì)胞再培 養(yǎng)44小時(shí)，并按照前面所述用Hoescht 33258染色。在另一組實(shí)驗(yàn)中，
在轉(zhuǎn)染并用Hoescht染色20小時(shí)后，用0. 25ng/ml的放線菌素D處 理8-孔培養(yǎng)載玻片中的RK0或RK0-E6細(xì)胞。在6-孔平板中進(jìn)行的轉(zhuǎn) 染是以相同方式完成的，區(qū)別在于所有試劑都增加了 4. 81倍。轉(zhuǎn)染48 小時(shí)后，采集在6孔平板中轉(zhuǎn)染的RK0細(xì)胞，并將其固定，從而按照 下面所述利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行分析。脊,放羊《承/;t轉(zhuǎn)染效率是用5-溴-4-氯-3-吲哚基-l5-D-吡喃半乳糖苷(X-GAL) 將pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色而測(cè)定的。染成藍(lán)色的細(xì)胞是表達(dá)LacZ 的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率是通過(guò)用染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)除以總細(xì)胞數(shù)而計(jì) 算的。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞染色。用PBS清洗細(xì)胞2次，然 后室溫時(shí)，在0. 5%gluteraldehyde/PBS中固定10分鐘。用lmM MgCL/PBS清洗細(xì)胞3次，然后用染色溶液[5mMK4Fe (CN)6.3H20， 5mM K3Fe(CN)6， lmM MgCL， 0. 1%X-GAL的PBS溶液]溫育，直到出現(xiàn)染成 藍(lán)色的細(xì)胞。#oe"/^染g核染料Hoescht用于標(biāo)記轉(zhuǎn)染RK0和RK0-E6細(xì)胞的核，從而根據(jù) 核斷裂及凝聚鑒定凋亡細(xì)胞。無(wú)水甲醇與水醋酸的3:1混合物組成的 固定劑是在使用前即時(shí)制備的。然后向在培養(yǎng)載玻片上生長(zhǎng)的細(xì)胞培 養(yǎng)基中加入相等體積的固定劑，溫育2分鐘。除去細(xì)胞中的培養(yǎng)基/固 定劑混合物，并棄去，向細(xì)胞中加入lml固定劑。5分鐘后，棄去固定 劑，向細(xì)胞中加入lml新鮮的固定劑，溫育5分鐘。棄去固定劑，在 加入lml的Hoescht染料(O. 5|ig/ml Hoescht 33258的PBS溶液)之 前，將細(xì)胞風(fēng)干4分鐘。在黑暗中溫育10分鐘后，棄去染色溶液，用 去離子水清洗栽玻片3次，每次1分鐘。清洗后，向細(xì)胞中加入lml 的Mcllvaine，s緩沖液(O. 021M檸檬酸，0. 058M Na2HP0" 7H20; pH5.6)，并在黑暗中溫育20分鐘。棄去緩沖液，將細(xì)胞在黑暗中風(fēng)干 5分鐘，并除去分隔培養(yǎng)載玻片的孔的室。在載玻片上加幾滴熒光 Vectashield封固劑(Vector Laboratories),并蓋上蓋玻片。在使 用UV濾光器的熒光顯微鏡下可觀察到染色的細(xì)胞。將鮮明染色或核斷 裂的細(xì)胞記錄為細(xì)胞凋亡。
利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)DNA斷裂利用熒光素-FragELTM DNA斷裂檢測(cè)試劑盒(Oncogene Research Products)，使用熒光素標(biāo)記的脫氧核苷酸標(biāo)記在細(xì)胞凋亡過(guò)程中產(chǎn)生 的DNA片段。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)胰蛋白酶消化采集用各種構(gòu)建體在 6孔培養(yǎng)平板中轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，然后按照制造商的指導(dǎo)將細(xì)胞固定并標(biāo) 記。簡(jiǎn)單地說(shuō)，4TC時(shí)，1000xg、 5分鐘，使細(xì)胞成顆粒狀物，在PBS (8g/L NaCl， 0.2g/L KC1， 1. 44g/L Na2HP04，和0. 24g/L KH2P(h)中清洗1 次。然后將細(xì)胞重懸浮在4。/。甲醛/PBS中，室溫溫育10分鐘。再次使 細(xì)胞成顆粒狀物，重懸浮在lml 80%乙醇中，4TC貯存。在進(jìn)行分析當(dāng) 天，將lml的固定細(xì)胞(lXl()6個(gè)細(xì)胞/ml)轉(zhuǎn)移到微量離心管中，通過(guò) 1000xg離心5分鐘而使細(xì)胞成顆粒狀物。將成顆粒狀物的細(xì)胞重懸浮 在200ji1的IX TBS(20mM Tris pH7.6， 140mM NaCI)中，室溫溫育 10-15分鐘。然后再次使細(xì)胞成顆粒狀物，重懸浮在lOOfil 20ng/ml 的蛋白激酶K中，室溫溫育5分鐘。使細(xì)胞成顆粒狀物，重懸浮在lOOfil 的1XTdT平衡緩沖液中，室溫溫育10-30分鐘。然后通過(guò)離心使細(xì)胞 成顆粒狀物，并重懸浮在60nl TdT標(biāo)記反應(yīng)混合物中，黑暗中溫育 1-1.5小時(shí)。溫育后，離心使細(xì)胞成顆粒狀物，在200nl IX TBS中 清洗2次。將細(xì)胞重懸浮在0. 5ml終體積的IX TBS中，并在裝配有 488nm氬離子激光源的流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。蛋冷炎承々蛋々#伊逐為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，通過(guò)在PBS中清洗細(xì)胞2次，然后加入15Ofil 的熱SDS凝膠-加樣緩沖液(50mM Tris-HCl pH 6.8， 100mM二硫蘇糖 醇，2%SDS， 0. 1%溴酚藍(lán)，和10%甘油)而從轉(zhuǎn)染細(xì)胞中分離蛋白。將 細(xì)胞的溶胞產(chǎn)物收集在微量離心管中，95TC加熱10分鐘，然后13， 000 x g離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)移到新的微量離心管中，-2010貯存?zhèn)?用。為了進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡，在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離5jig或 10fig的總蛋白。將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯薄膜上。然后將薄 膜在封閉溶液(5%脫脂乳粉末，0. 02%疊氮化鈉的PBS溶液)中溫育1 小時(shí)，并在PBS-T(PBS + 0. 05%吐溫-20)中清洗3次，每次15分鐘。
將薄膜在41C的PBS-T中貯存過(guò)夜。第2天溫?zé)嶂潦覝睾?，將薄膜?ljig/ml的聚乙烯醇中封閉30秒。在去離子水中清洗薄膜5次，然后 在5。/。乳汁的PBS溶液中封閉30分鐘。在與薄膜溫育前，將第一抗體 在5%乳汁的PBS溶液/O. 025%吐溫-20中預(yù)溫育30分鐘。使用可識(shí)別p53 (Ab-6)、來(lái)源于Oncogene的單克隆抗體，或針 對(duì)合成肽(氨基-CRLPEGDLGKEIEQKYD-羧基)的多克隆抗體在薄膜上 印跡，所述合成肽與在雞中含量較高的人elF5Al的C-末端同源。p53 的單克隆抗體是以0. ljig/ml的稀釋度使用的，elF5Al的抗體是以 1:1000的稀釋度使用的。用第一抗體溫育60-90分鐘后，將薄膜在 PBS-T中清洗3次，每次15分鐘。然后將第二抗體在1%乳汁的PBS 溶液/0. 025 %吐溫-20中稀釋，與薄膜溫育60-90分鐘。當(dāng)使用 p53(Ab-6)作為第一抗體時(shí)，所用的第二抗體是1: 1000稀釋的、與堿 性磷酸酶偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG (Rockland)。當(dāng)使用抗-elF5Al作為 第一抗體時(shí)，使用1:10000稀釋的、與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的兔抗-雞 IgY(Gallus Immunotech)。用第二抗體溫育后，將薄膜在PBS-T中清 洗3次 比色法和化學(xué)發(fā)光法這兩種檢測(cè)方法都可用于使印跡顯色。僅當(dāng)使 用p53(Ab-6)作為第一抗體，以及與堿性磷酸酶-偶聯(lián)的第二抗體時(shí)， 使用比色法。結(jié)合抗體是通過(guò)在黑暗中，在0. 33mg/mL硝基藍(lán)四唑鋪， 0. 165mg/mL 5-溴-4-氯-3-丐l哚基磷酸鹽，100mM NaCl， 5mM MgCL， 和100mM Tris-HCl (pH 9. 5)的溶液中溫育而目測(cè)，見察的。顯色反應(yīng)是 通過(guò)在2mMEDTA的PBS溶液中溫育印跡而終止的。化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法可 用于所有其它的第一抗體，包括抗-[HA]-過(guò)氧化物酶和抗-eIFSAl 。 ECL Plus蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech)用于檢測(cè)與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的結(jié)合抗體。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將薄膜輕輕吸干，然后 在黑暗中，與試劑A和試劑B的40:1混合物溫育5分鐘。將薄膜吸干， 放在醋酸鹽層之間，暴露于X-射線膠片IO秒-IO分鐘。圖39是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO和RKO-E6中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的 圖。RKO和RK0-E6細(xì)胞是使用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 的。24小時(shí)后，用0. 25ng/ml的放線菌素D或相等體積的甲醇(對(duì)照 組)處理細(xì)胞。用Hoescht 20將細(xì)胞染色20小時(shí)后，使用UV濾光器 在熒光顯微鏡下觀察。將由于染色質(zhì)凝聚而鮮明染色的細(xì)胞記錄為細(xì)
胞凋亡。上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染、并用放線菌素D處理 的RK0細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染、但沒用放線菌素D處理 的細(xì)胞增加了 240%。用放線菌素D處理、并用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的 RK0-E6細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染、但沒用放線菌素D處理 的細(xì)胞增加了 105%。圖40是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的圖。 RKO細(xì)胞是用pHM6-LacZ， pHM6-elF5Al， pHM6-elF5A2，或pHM6-截 短的elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的。44小時(shí)后用Hoescht將細(xì)胞染色后，使用 UV濾光器在熒光顯微鏡下觀察。將由于染色質(zhì)凝聚而鮮明染色的細(xì)胞 記錄為細(xì)胞凋亡。用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的凋亡相對(duì)于用pHM6-LacZ轉(zhuǎn)染的對(duì)照組細(xì)胞增加了 25%。這種增加對(duì)于4吏用pHM6-elF5A2 或pHM6-截短的elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞似乎并不明顯。圖41是描述瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RKO細(xì)胞中發(fā)生細(xì)胞凋亡百分比的圖。 RKO細(xì)胞或者未被轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ或pHM6-elF5Al瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。 44小時(shí)后用Hoescht將細(xì)胞染色后，使用UV濾光器在熒光顯微鏡下 觀察。將由于染色質(zhì)凝聚而鮮明染色的細(xì)胞記錄為細(xì)胞凋亡。校正轉(zhuǎn) 染效率之后，用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞有60%凋亡。圖42提供瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，RK0細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞分析。RK0細(xì)胞 未被轉(zhuǎn)染，或者用pHM6-LacZ， p,-elF5Al， pHM6-elF5A2，或pHM6-截短的elF5Al轉(zhuǎn)染。48小時(shí)后，采集細(xì)胞并固定。反映細(xì)胞凋亡的 斷裂DNA是用與脫氧核苷酸偶聯(lián)的熒光素標(biāo)記的，并在裝配有488nm 的氬離子激光源的流式細(xì)胞器上進(jìn)行分析。E下出現(xiàn)的熒光來(lái)源于非-凋亡細(xì)胞，F(xiàn)下出現(xiàn)的熒光來(lái)源于正在經(jīng)歷凋亡的細(xì)胞。該表描述了經(jīng) 歷凋亡的細(xì)胞百分比，它是以各個(gè)峰下的面積為基礎(chǔ)計(jì)算的。校正未 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的背景細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)染效率后，有80%用pHM6-elF5Al轉(zhuǎn) 染的細(xì)胞顯示凋亡。用pHM6-LacZ， pHM6-elF5A2或pHM6-截短的 elF5Al轉(zhuǎn)染的細(xì)胞僅僅顯示背景水平的凋亡。圖43提供蛋白的蛋白質(zhì)印跡，所述蛋白是從用0. 25ng/ml放線菌 素D處理O， 3， 7， 24，和48小時(shí)的RK0細(xì)胞中分離的。在12。/。SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離5fig (抗-elF5Al)或10ng (抗-p53)的總蛋 白，并轉(zhuǎn)移到聚偏二氯乙烯薄膜上。上面描述使用抗-p53作為第一抗 體的蛋白質(zhì)印跡。中間描述使用抗-elF5Al作為笫一抗體的蛋白質(zhì)印51
跡。下面描述用于抗-elT5Al印跡的薄膜，該印跡是在化學(xué)發(fā)光檢測(cè) 以證實(shí)等量加樣后，用考馬斯藍(lán)染色的。p53和elF5Al都是通過(guò)用放 線菌素D處理而上調(diào)的。 序列表<110〉 SENESCO, INC.<120>核酸，多肽，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法<130〉 10799/40<140> PCT/US02/23254 <141> 2002-07-23<150> 10/200， 148 <151> 2002-07-23<150> 10/141,647 <151〉 2002-07-05<150> 09/909, 796 <151> 2001-07-23<160〉 30<170> Patentln Ver. 2. 1<210〉 1 〈211> 1139 <212> DNA〈213〉大鼠(Rattus sp.)<220〉<221> CDS<222> (33).. (494)<400〉 1caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5gag aca gga gat gca ggg gcc tea gcc acc ttc cca atg cag tgc tea 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35ate gtc gag atg tct act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat 293 lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 85gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag 341 Asp Phe Gin Leu lie Gly lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin 90 95 100gac agt ggg gag gta cga gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt 389 Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu 105 110 115ggc aag gag att gag cag aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate 437 Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie 120 125 130 135aca gtg ctg tec gec atg aca gag gag gca get gtt gca ate aag gec 485 Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 140 145 150atg gca aaa taactggctt ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc 534 Met Ala Lysatgagectae agaggcccct cccccagctc tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca 594 atttatttga cgttttattt tggttt.tcct caccccttca aactgtcggg gagaccctgc 654 ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga gggagccatg gccttggtga agctacctgc 714 ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc 774 cctctccctt tttcttttta attcaatttg gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg 834 gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca tctggtcccc tgttctccat agtccttcac 894 ccccaagcac cactgacaga ctggggacca gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa 954 acccctctat aggggtgaca agaagaggag ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc 1014 atctgggaag gccttgcccc catgggcttt accctttcct gtgggctttc tccctgacac 1074 atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaa肌1134
aasaa 1139<210> 2 <211> 154 <212> PRT <213>大鼠<400> 2Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu 1 5Thr Gly Asp Ala 10Gly Ala Ser Ala 15Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val 20 25 30Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr35 4045Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe50 5560Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp65 707580Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie, Gly lie Gin Asp 85 90 95Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu 100 105 110Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr Asp115 120125Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 145 150<210> 3 <211> 462 <212〉 DNA<213>人(Homo sapiens) <400> 3
atggcagatg acttggactt cgagacagga cagtgctcag cattacgtaa gaatggcttt gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag attgacatct ttactgggaa gaaatatgaa gtccccaaca tcaaaaggaa tgacttccag ctgctccagg acagcgggga ggtacgagag aaggagattg agcagaagta cgactgtgga atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaaggatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 cacggccacg ccaaggtcca tctggttggt 180 gatatctgcc cgtcaactca taatatggat 240 ctgattggca tccaggatgg gtacctatca 300 gaccttcgtc tccctgaggg agaccttggc 360 gaagagatcc tgatcacggt gctgtctgcc 420 gccatggcaa aa 462〈210〉 4<211〉 462<212〉 DNA <213>人<220〉〈221〉修飾的堿基 <222> (455).. (456) <223> a, t, c或g〈400〉 4atggcagacg aaattgattt cactactgga cagtgctcgg ccttgcgcaa aaacggcttc gtggagatgt caacttccaa aactggaaag attgatattt tcacgggcaa aaaatatgaa gttccaaata ttaaga^gaaa^ tgattatcaa ctgctgacag aaactggtga agttcgtgag aaagaaatag agggaaaata caatgcaggt atgagtgaag aatatgctgt agcca/taaaagatgccgggg cttccagcac ttaccctatg 60 gtggtgctca aaggacgacc atgcaaaata 120 catggtcatg ccaaggttca ccttgttgga 180 gatatttgtc cttctactca caacatggat 240 ctgatatgca ttcaagatgg ttacctttcc 300 gatcttaaac tgccagaagg tgaactaggc 360 gaagatgtac aggtgtctgt catgtgtgca 420 ccctrmgcaa at 462〈210〉 5<211〉 462〈212〉 DNA 〈213〉大鼠<400〉 5atggcagatg atttggactt cgagacagga cagtgctcag cattacgtaa gaatggtttt gtcgagatgt ctacttcgaa gactggcaag attgacattt ttactggg肌gaaatatgaa gtccccaaca tcaaacggaa tgacttccag ctgctccagg acagtgggga ggtacgagag aaggagattg agcagaagta tgactgtgga atgacagagg aggcagctgt tgcaatcaaggatgcagggg cctcagccac cttcccaatg 60 gtggtgctca aaggccggcc atgtaagatc 120 catggccatg ccaaggtcca tctggttggc 180 gatatctgcc cgtcgactca taatatggat 240 ctgattggca tccaggatgg gtacctatcc 300 gaccttcgtc tgcctgaagg agaccttggc 360 gaagagatcc tgatcacagt gctgtctgcc 420 gccatggcaa 462〈210〉 6
<211> 606 <212> ■ <213>大鼠<220> <221〉 CDS <222> (1)..(453)<400> 6get gtg tat tat tgg gcc cat aag aac cac ata cct gtg ctg agt cct 48 Ala Val Tyr Tyr Trp Ala His Lys Asn His lie Pro Val Leu Ser Pro 15 10 15gca etc aca gac ggc tea ctg ggt gac atg ate ttt ttc cat tec tat % Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30aaa aac cca ggc ttg gtc ctg gac ate gtt gaa gac ctg egg etc ate 144 Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45aac atg cag gcc att ttc gcc aag cgc act ggg atg ate ate ctg ggt 192 Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60gga ggc gtg gtc aa.g cac cac ate gcc aat get aac etc atg egg aat 240 Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn 65 70 75 80gga get gac tac get gtt tat ate aac aca gcc cag gag ttt gat ggc 288 Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 85 90 95tea gac tea gga gcc egg cca gat gag get gtc tec tgg ggc aag ate 336 Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110egg atg gat gca cag cca gta aag gtc tat get gat gca tct ctg gtt 384 Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125ttc ccc ttg ctg gtg get gag aca ttc gcc caa aag gca gat gcc ttc 432 Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140鄰a get gag aag aat gag gac tgagcagatg ggtaaagacg gaggcttctg 483 Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150ccacaccttt atttattatt tgcataccaa cccctcctgg gccctctcct tggtcagcag 543 catcttgaga ataaatggcc tttttgttgg tttctgtaaa aaaaggactt taaaaaaaaa 603 aaa 606<210〉 <211> <212> <213><400>7151 PRT 大鼠7Ala Val Tyr Tyr Trp Ala 1 5His Lys Asn His 10lie Pro Val LeuSer Pro 15Ala Leu Thr Asp Gly Ser Leu Gly Asp Met lie Phe Phe His Ser Tyr 20 25 30Lys Asn Pro Gly Leu Val Leu Asp lie Val Glu Asp Leu Arg Leu lie 35 40 45Asn Met Gin Ala lie Phe Ala Lys Arg Thr Gly Met lie lie Leu Gly 50 55 60Gly Gly Val Val Lys His His lie Ala Asn Ala Asn Leu Met Arg Asn65 707580Gly Ala Asp Tyr Ala Val Tyr lie Asn Thr Ala Gin Glu Phe Asp Gly 85 90 95Ser Asp Ser Gly Ala Arg Pro Asp Glu Ala Val Ser Trp Gly Lys lie 100 105 110Arg Met Asp Ala Gin Pro Val Lys Val Tyr Ala Asp Ala Ser Leu Val 115 120 125Phe Pro Leu Leu Val Ala Glu Thr Phe Ala Gin Lys Ala Asp Ala Phe 130 135 140Arg Ala Glu Lys Asn Glu Asp 145 150<210> 8 <211> 453 <212> DNA <213>人〈400〉 8tccgtgtatt actgggccca gaagaaccac atccctgtgt ttagtcccgc acttacagac 60 ggctcgctgg gcgacatgat cttcttccat tcctacaaga acccgggcct ggtcctggac 120 atcgttgagg acctgaggct catcaacaca caggccatct ttgccaagtg cactgggatg 180 atcattctgg gcgggggcgt ggtcaagcac cacattgcca atgccaacct catgcggaac 240 ggggccgact acgctgttta catcaacaca gcccaggagt ttgatggctc tgactcaggt 300 gcccgaccag acgaggctgt ctcctggggc aagatccggg tggatgcaca gcccgtcaag 360 gtctatgctg acgcctccct ggtcttcccc ctgcttgtgg ctgaaacctt tgcccagaag 420 atggatgcct tcatgcatga gaagaacgag gac 453<210> 9 <211> 20 <212> DNA 〈213〉人工序列<220><223>人工序列說(shuō)明引物 〈220〉<221>修飾的堿基<222> (12)<223> a， t， c或g<400〉 9tcsaarachg gnaagcaygg 20<210> 10〈211〉 42<212> DNA <213〉人工序列<220〉<223>人工序列說(shuō)明引物<400> 10gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt<210〉<211>972 DNA<212〉 <213>大鼠 <220><221〉 CDS<222〉 (1)..(327)<400> 11tcg aag acc ggt aag cac ggc cat gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att 48 Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 10 15gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat ate tgc ccg tcg act cat % Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His 20 25 30aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat gat ttc cag ctg att ggc 144 Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly 35 40 45ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag gac agt ggg gag gta cga 192 lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60gag gac ctt cgt ctg cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag 240 Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin 65 70 75 80aag tat gac tgt gga gaa gag ate ctg ate aca gtg ctg tec gcc atg 288 Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met 85 90 95aca gag gag gca get gtt gca ate aag gcc atg gca aaa taactggctt 337 Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105ccagggtggc ggtggtggca gcagtgatcc atgagectae agaggcccct cccccagctc 397tggctgggcc cttggctgga ctcctatcca atttatttga cgttttattt tggttttcct 457caccccttca aactgtcggg gagaccctgc ccttcaccta gctcccttgg ccaggcatga 517gggagccatg gccttggtga agctacctgc ctcttctctc gcagccctga tgggggaaag 577ggagtgggta ctgcctgtgg tttaggttcc cctctccctt tttcttttta attcaatttg 637gaatcagaaa gctgtggatt ctggcaaatg gtcttgtgtc ctttatccca ctcaaaccca 697tctggtcccc tgttctccat agtccttcac ccccaagcac cactgacaga ctggggacca 757gcccccttcc ctgcctgtgt ctcttcccaa acccctctat aggggtgaca agaagaggag 817ggggggaggg gacacgatcc ctcctcaggc atctgggaag gccttgcccc catgggcttt 877 accctttcct gtgggctttc tccctgacac atttgttaaa aatcaaacct gaataaaact 937 acaagtttaa tatgaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 972<210> 12 <211> 109 <212> PRT <213〉大鼠<400> 12Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly lie 15 10 15Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp lie Cys Pro Ser Thr His2025 30Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn Asp Phe Gin Leu lie Gly3540 45lie Gin Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gin Asp Ser Gly Glu Val Arg 50 55 60Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin657075 80Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met8590 95Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala lie Lys Ala Met Ala Lys 100 105<210> <211> <212> <213>13 24 DNA人工序列<220〉<223>人工序列說(shuō)明引物 <400> 13caggtctaga gttggaatcg aagc 24〈210〉 <211> <212〉 <213>
14 30 DNA
人工序列
<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物
<400> 14
atatctcgag ccttgattgc aacagctgcc
<210〉 15 <211> 489 <212> DNA 〈213〉大鼠
<220>
<221〉 CDS
<222〉 (33).. (485)
<400〉 15
caggtctaga gttggaatcg aagcctctta aa atg gca gat gat ttg gac ttc 53
Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe 1 5
gag aca gga gat gca ggg gcc tea gec acc ttc cca atg cag tgc tea 101 Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gin Cys Ser 10 15 20
gca tta cgt aag aat ggt ttt gtg gtg etc aag ggc egg cca tgt aag 149 Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys 25 30 35
ate gtc gag atg tct act teg aag act ggc aag cat ggc cat gcc aag 197 lie Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala Lys 40 45 50 55
gtc cat ctg gtt ggt att gat att ttt act ggg aag aaa tat gaa gat 245 Val His Leu Val Gly lie Asp lie Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp 60 65 70
ate tgc ccg teg act cat aac atg gat gtc ccc aac ate aaa agg aat 293 lie Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn lie Lys Arg Asn 75 80 85
gat ttc cag ctg att ggc ate cag gat ggg tac eta tec ctg etc cag 341<formula>formula see original document page 63</formula>Cys Gly Glu Glu lie Leu lie Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu 130 135 140
Ala Ala Val Ala lie Lys Ala 145 150
<210〉 <211〉 <212> <213〉
17 20 腿
人工序列
<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物 <400〉 17
gtctgtgtat tattgggccc 20
<210> <211> <212> <213>
18
42 腿
人工序列
<220〉
<223>人工序列說(shuō)明引物 <400> 18
gcgaagcttc catggctcga gttttttttt tttttttttt tt 42
<210> <211> <212> 〈213〉
19 18
DNA
人工序列
<220>
〈223>人工序列說(shuō)明引物 <400> 19
ttgaaggggt gaggaaaa 18
<210> 20 <211> 15 <212> DNA <213>人工序列
<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物 <400〉 20
ttgagtggga taaag 15
<210> 21 <211> 18 <212〉腿 <213〉人工序列
<220>
<223>人工序列說(shuō)明引物 <400〉 21
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<223>人工序列說(shuō)明合成肽 〈400> 30
Cys Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu lie Glu Gin Lys Tyr 15 10 15
Asp
權(quán)利要求
1.一種表達(dá)載體在制備用于增加細(xì)胞凋亡的藥物中的用途，其中所述表達(dá)載體含有選自下組的編碼人細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A多肽的分離的核苷酸序列由SEQ ID NO3組成的核苷酸序列；和與SEQ ID NO3的互補(bǔ)序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
2. —種表達(dá)載體在制備用于增加癌癥細(xì)胞凋亡的藥物中的用途， 其中所述表達(dá)載體含有選自下組的編碼人細(xì)胞凋亡-特異性elF-5A多 肽的分離的核苷酸序列由SEQ ID NO: 3組成的核苷酸序列；和與SEQ ID NO: 3的互補(bǔ)序列在高度嚴(yán)格條件下雜交的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了核酸，多肽，以及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法。具體地，本發(fā)明涉及分離和/或純化的大鼠細(xì)胞凋亡-特異性真核生物起始因子-5A(eIF-5A)和脫氧8-羥-2，7，10-三氨基癸酸合酶(DHS)的核酸及多肽。本發(fā)明還涉及使用細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A和DHS調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的方法，以及用于這種方法中的細(xì)胞凋亡-特異性eIF-5A和DHS的反義寡核苷酸及表達(dá)載體。
文檔編號(hào)H01S5/024GK101164624SQ20071018017
公開日2008年4月23日 申請(qǐng)日期2002年7月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月23日
發(fā)明者C·泰勒, D·克利歇, J·C·卡爾森, J·E·湯普森, L·佩特羅夫, M·考普, R·納拉延辛, T·-W·王 申請(qǐng)人:森尼斯科公司