本發(fā)明屬于基因的功能與應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及一種G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子6(Regulator of G protein signaling 6，RGS6)作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著老齡人口的增加，都市化的生活以及生活方式的改變，肥胖、非酒精性脂肪肝病、代謝綜合征和糖尿病等代謝異常人群劇增，現(xiàn)已經(jīng)成為全球性的公眾健康的重要危害。

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染和精神因素等多種因素引發(fā)的機(jī)體胰島功能減退、胰島素抵抗，最終導(dǎo)致糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球糖尿病患者已超過(guò)3億人，其中Ⅱ型糖尿病(type 2diabetes mellitus,T2DM)占90％以上，到2030年，患病人數(shù)將超過(guò)4億，這意味著在全球20-79歲成年人中將會(huì)有7.7％是糖尿病患者。隨著發(fā)病人群的擴(kuò)大，防治難度將會(huì)不斷增加。糖尿病慢性并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病患者致死致殘的主要原因，不僅累及心腦血管、腎臟、視網(wǎng)膜、神經(jīng)等重要臟器和組織，肝臟也是其重要的靶器官之一。

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損傷肝因素造成的以肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過(guò)度沉積為主要特征的臨床病例綜合征，對(duì)人群的健康造成巨大的威脅，成為西方國(guó)家最常見(jiàn)的肝臟疾病。亞洲國(guó)家中NAFLD的發(fā)病率也在逐年攀升，在城鎮(zhèn)地區(qū)的發(fā)生率甚至高達(dá)60％。非酒精性脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展成為非酒精性脂肪肝炎，約20％的非酒精性脂肪肝炎最終發(fā)展為肝硬化甚至肝臟衰竭^[1]。

現(xiàn)階段，T2DM合并NAFLD的患病率正逐年增加。研究結(jié)果顯示，在糖尿病人群中，NAFLD患病率可高達(dá)80％^[2]。在有些患者中肝臟脂肪沉積可能是影響其T2DM發(fā)展的主要因素^[3]。另一方面，如果T2DM控制不佳或充分發(fā)展，不僅促進(jìn)脂肪肝生成，而且使肝損傷加重，甚至形成非酒精性脂肪性肝炎、肝纖維變性、肝硬化及肝細(xì)胞癌。T2DM合并NAFLD將大大增加由于肝硬化、肝細(xì)胞癌和心血管并發(fā)癥導(dǎo)致的死亡風(fēng)險(xiǎn)^[4]。目前，雖然控制高脂血癥在T2DM伴NAFLD患者中的治療作用仍有待探究，但是NAFLD的治療主要包括針對(duì)糖尿病和心血管風(fēng)險(xiǎn)因子的積極控制。研究表明，在合并T2DM和NAFLD的患者中，只有噻唑烷二酮類(lèi)藥物吡格列酮顯示出肝臟組織學(xué)的明顯改善。因此未來(lái)我們應(yīng)該制定特異的篩選標(biāo)準(zhǔn)以及治療方案以期應(yīng)用于臨床T2DM和NAFLD患者，尤其是T2DM和NAFLD合并的患者。

RGS6(Regulator of G protein signaling 6)是一種調(diào)節(jié)G蛋白信號(hào)的蛋白，屬于RGS家族中的R7亞家族，能夠調(diào)控包括神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)及淋巴細(xì)胞活性在內(nèi)的多種信號(hào)通路^[5]，RGS6基因位于人的14號(hào)染色體上，RGS6蛋白具有GTP酶活性，能夠結(jié)合Gα亞單位抑制通過(guò)G蛋白偶聯(lián)受體依賴的信號(hào)通路^[6]。研究發(fā)現(xiàn)，RGS6蛋白能夠抑制細(xì)胞分化和增殖，使細(xì)胞從細(xì)胞分裂周期暫停，從而產(chǎn)生抑制癌癥的作用，RGS6與膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)^[5]，能夠抑制乳腺癌的發(fā)生及進(jìn)展^[7]，并與胰腺癌的預(yù)后相關(guān)^[8]。另外有研究發(fā)現(xiàn)RGS6能夠通過(guò)促進(jìn)Nox酶的活性增加活性氧的產(chǎn)生，加重酒精誘導(dǎo)的心臟病及酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展^[9]。

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技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種RGS6基因的表達(dá)與脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之間的相互關(guān)系，提供一種RGS6作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用，進(jìn)而提供一種RGS6的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)

本發(fā)明以野生型C57小鼠與RGS6基因敲除小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究RGS6基因的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型WT小鼠對(duì)比，RGS6基因敲除小鼠表現(xiàn)出體重減輕，其體重明顯低于同種飼料飼養(yǎng)的WT小鼠，并且RGS6基因敲除小鼠的空腹血糖水平低于對(duì)照組WT小鼠，RGS6基因敲除小鼠的肝功能明顯優(yōu)于WT小鼠。進(jìn)一步通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RGS6基因敲除小鼠對(duì)葡萄糖的耐受能力明顯改善。從小鼠肝臟大體外觀，肝臟重量及肝臟/體重比以及肝功能相關(guān)酶活性測(cè)定結(jié)果等均說(shuō)明HFD組(High fat diet，高脂飲食)RGS6-KO小鼠脂肪肝病變明顯減輕，脂質(zhì)蓄積顯著減少。這表明RGS6基因敲除會(huì)緩解脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生，RGS6基因能夠促進(jìn)脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的發(fā)生。

因此，RGS6基因可作為藥物靶點(diǎn)，構(gòu)建RGS6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物；RGS6基因也可作為基因治療中的靶基因，設(shè)計(jì)并制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物和/或生物學(xué)試劑，通過(guò)基因工程技術(shù)達(dá)到預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的目的。例如以RGS6為靶基因，設(shè)計(jì)可干擾RGS6表達(dá)的雙鏈siRNA，通過(guò)化學(xué)方法合成以后，注射入人體通過(guò)RNA干擾的方法使XX基因沉默來(lái)治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病；還可以設(shè)計(jì)并構(gòu)建RGS6的突變體，注射后進(jìn)入細(xì)胞，競(jìng)爭(zhēng)RGS6原形的作用底物，從而抑制RGS6的功能，起到治療目的；此外，還可以以RGS6為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)小分子化合物抑制劑，利用RGS6基因過(guò)表達(dá)的體外細(xì)胞模型或動(dòng)物模型，通過(guò)篩選，發(fā)現(xiàn)其中能夠特異性抑制RGS6的分子，從而為脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的治療提供新的治療性分子。

針對(duì)RGS6的上述功能，提供RGS6作為藥物靶標(biāo)在篩選保護(hù)肝臟及糖代謝的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)RGS6的上述功能，提供RGS6作為藥物靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

針對(duì)RGS6的上述功能，提供RGS6的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物中的應(yīng)用。

一種預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物，包含RGS6的抑制劑。

所述的RGS6的抑制劑優(yōu)選為RGS6基因的siRNA、RGS6基因的RNA干擾載體，RGS6的抗體及其他能夠抑制RGS6表達(dá)的抑制劑。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)RGS6的新功能，即RGS6具有惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病的作用。

(2)基于RGS6在惡化脂肪肝和Ⅱ型糖尿病疾病中的功能，其為研制預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物提供靶標(biāo)。

(3)RGS6的抑制劑可用于制備預(yù)防、緩解和/或治療脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的藥物。

附圖說(shuō)明

圖1是構(gòu)建RGS6條件性敲除小鼠的打靶策略圖。

圖2是WT和RGS6-KO小鼠的體重、空腹血糖結(jié)果圖；

A為小鼠體重結(jié)果圖，B為空腹血糖水平統(tǒng)計(jì)圖(*：p＜0.05vs WT NC組，**：p＜0.01vs WT NC組，#：p＜0.05vs WT HFD組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖3是WT和RGS6-KO小鼠通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量結(jié)果圖；

A為通過(guò)腹腔注射葡萄糖后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠血糖水平統(tǒng)計(jì)圖，B為各組小鼠糖耐量曲線下面積(area under the curve，AUC)比較圖(**：p＜0.01vs WT NC組，##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖4是RGS6-KO和WT小鼠的肝臟重量結(jié)果圖；

A為肝臟重量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，B為肝臟重量與小鼠本身體重比值統(tǒng)計(jì)柱狀圖(##：p＜0.01vs WT HFD組)。

圖5是WT和RGS6-KO小鼠的肝功測(cè)量結(jié)果圖；

分別采取AST、ALT和ALP對(duì)小鼠肝功進(jìn)行檢測(cè)。(##：p＜0.01vs WT HFD組)。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下詳細(xì)說(shuō)明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說(shuō)明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物及飼養(yǎng)：

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種屬，性別，周齡及來(lái)源：C57BL/6小鼠(WT)和RGS6肝臟特異性基因敲除(RGS6-KO)小鼠，雄性，8周齡。C57BL/6小鼠購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，RGS6肝臟特異性基因敲除小鼠(RGS6-KO)由RGS6-floxed小鼠與受蛋白啟動(dòng)子控制、肝細(xì)胞特異性表達(dá)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠Albumin-Cre(購(gòu)自The Jackson Laboratory，貨號(hào)003574)雜交得到。

肝臟特異性RGS6基因敲除小鼠的構(gòu)建：

根據(jù)基因信息，利用CRISPR Design(網(wǎng)址：http://crispr.mit.edu/)分別在內(nèi)含子4和5中各設(shè)計(jì)一個(gè)CRISPR的打靶位點(diǎn)。靶序列分別為：

RGS6-sRNA 1：GGTCACAGCATCATGCTGTAGGCGA TGG

RGS6-sRNA 2：ggAGTGGACACCACCCGTCTTACAA AGG

此外還設(shè)計(jì)了一個(gè)用于同源修復(fù)的供體質(zhì)粒(Donor Vector)，它包括兩側(cè)同源臂、中間的外顯子5、以及兩個(gè)同向的loxp序列，構(gòu)建策略見(jiàn)圖1。

①打靶載體的構(gòu)建：分別將sgRNA1和sgRNA2對(duì)應(yīng)的兩條引物融合成雙鏈DNA，然后用T4DNA連接酶連入經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶BsaI處理過(guò)的pUC57-sgRNA載體中。該載體上游有一個(gè)T7啟動(dòng)子，可以用于后續(xù)的體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。

②供體載體(Donor Vector)的構(gòu)建：根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)如下引物(表1)用于擴(kuò)增供體載體的左右同源臂(LA和RA)以及中間的外顯子部分(M)。擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)表1中所示限制性內(nèi)切酶酶切后得到3個(gè)片段，將其分別連入條件性敲除骨架載體pBluescript SK(+)-2loxp中，得到Donor Vector。

表1構(gòu)建供體載體所需引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)

③打靶載體的轉(zhuǎn)錄：對(duì)CRIPR/Cas9系統(tǒng)包含的兩個(gè)部分(負(fù)責(zé)切割作用的Cas9蛋白和引導(dǎo)Cas9蛋白定位到靶位點(diǎn)的gRNA)分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。對(duì)于Cas9蛋白，將其表達(dá)載體(pST1374-Cas9)用PmeI進(jìn)行酶切，以純化后回收線性化質(zhì)粒為轉(zhuǎn)錄模板，用T7mMESSAGE mMACHINE試劑盒(AM1345，Ambion)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，獲得加帽的mRNA產(chǎn)物。并用Poly(A)Tailing試劑盒(Ambion)對(duì)上述產(chǎn)物加尾，獲得成熟的mRNA產(chǎn)物；對(duì)于sgRNA，使用MEGAshortscript^TMKit(AM1354，Ambion公司)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。將轉(zhuǎn)錄得到的Cas9和sgRNA的mRNA使用miRNeasy Micro Kit(Qiagen，217084)進(jìn)行純化。

④RGS6-floxed條件性敲除小鼠的制作

將上述成熟的mRNA產(chǎn)物與供體質(zhì)粒一同注入小鼠受精卵中，移植到代孕母鼠體內(nèi)進(jìn)行培育。得到的小鼠進(jìn)行鑒定。取出生一周后的小鼠腳趾或尾部組織，提取基因組，并通過(guò)PCR方法篩選陽(yáng)性首建鼠。從確定發(fā)生同源重組的小鼠中隨機(jī)挑選一只作為F0代進(jìn)行后續(xù)的繁殖，最終獲得RGS6-floxed純合小鼠。

⑤肝臟特異性RGS6基因敲除小鼠的制作

將上述RGS6-floxed小鼠與肝臟特異性Albumin-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠交配，篩選得到RGS6^{floxed/floxed}/Albumin-Cre小鼠，待該小鼠長(zhǎng)至6周齡左右后，腹腔注射Tamoxifen，誘導(dǎo)Cre酶的表達(dá)，Cre酶特異性的識(shí)別兩個(gè)同向的loxp，并切除兩者之間的序列及其中的一個(gè)loxp，最后得到肝臟細(xì)胞特異性RGS6基因敲除小鼠。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料配方：高脂飼料(HFD)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12942)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，總的熱量質(zhì)量比:5.24kcal/g。低脂飼料(NC)(購(gòu)自北京華阜康生物科技有限公司，貨號(hào)D12450B)：熱量百分比：蛋白質(zhì):20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，總的熱量質(zhì)量比:3.85kcal/g。

飼養(yǎng)環(huán)境及條件：SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，室溫在22-24℃之間，濕度在40-70％之間，明暗交替照明時(shí)間為12h，自由飲水?dāng)z食。

【實(shí)施例1】小鼠脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)獲得

(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組：選用8周齡，雄性，WT小鼠和RGS6-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。

(2)模型通過(guò)高脂飼料誘導(dǎo)操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，進(jìn)行表型相關(guān)分析，明確RGS6基因?qū)χ靖?、Ⅱ型糖尿病發(fā)揮的作用。選用8周齡，雄性，WT小鼠和RGS6-KO小鼠，分別給與兩種特殊飼料D12942高脂飼料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂飼料(Normal chow，NC)飼養(yǎng)，即WT NC組，KO NC組，WT HFD組，KO HFD組共4個(gè)組別。每周均詳細(xì)記錄小鼠攝食量，小鼠空腹體重和空腹血糖每隔4周檢測(cè)1次。實(shí)驗(yàn)第14周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)葡萄糖耐受能力。第16周終末取材。

【實(shí)施例2】小鼠體重、血糖水平測(cè)定

(1)小鼠空腹體重，食量檢測(cè)

1)體重檢測(cè)。

①禁食：上午8:00將待實(shí)驗(yàn)小鼠禁食(不禁水)，下午2:00開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。

②稱(chēng)重：分別在第0周、4周、8周、12周稱(chēng)重，將一塑料小桶放在動(dòng)態(tài)電子天平上，抓起小鼠，放入稱(chēng)量小桶中，測(cè)量體重記錄數(shù)據(jù)。飼料量檢測(cè)：待稱(chēng)體重操作完成后，給小鼠加飼料，并在動(dòng)態(tài)電子天平上記錄小鼠的飼料量。

(2)空腹血糖水平檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

將所有待實(shí)驗(yàn)的小鼠從上午8:00至下午2:00間禁食(不禁水)，即禁食6小時(shí)后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。

①血糖儀準(zhǔn)備：檢查血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司，ONETOUCH)電池，按右側(cè)開(kāi)關(guān)，將試紙正確放入左側(cè)插槽，屏幕顯示與血糖試紙條相應(yīng)代碼的數(shù)字，隨后顯示滴血圖案，提示血糖儀進(jìn)入待測(cè)狀態(tài)。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一塊毛巾，將毛巾對(duì)折，用拇指和食指捏住毛巾對(duì)折處，將鼠頭部和身體包入手掌內(nèi)的毛巾，拇指和食指在將鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm處剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖檢測(cè)：將血糖儀試紙邊緣輕觸血滴，血液浸入試紙，血糖儀倒計(jì)時(shí)5秒顯示讀數(shù)。

Ⅱ型糖尿病損傷嚴(yán)重程度的評(píng)估指標(biāo)主要包括體重、血糖等水平，體重、血糖變化結(jié)果如圖1所示，給與RGS6-KO小鼠12周的HFD飼料和NC飼料飼養(yǎng)后，從第2周開(kāi)始HFD組的RGS6-KO小鼠體重明顯低于HFD組的WT小鼠體重，一直持續(xù)到第12周(見(jiàn)圖2A)；經(jīng)空腹血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在HFD組的小鼠從第4周的空腹血糖水平明顯較相應(yīng)NC對(duì)照組升高，HFD組的RGS6-KO小鼠空腹血糖水平也明顯低于WT組小鼠空腹血糖水平(見(jiàn)圖2B)。表明RGS6基因敲除后顯著影響了小鼠在HFD飼養(yǎng)狀態(tài)下的糖代謝穩(wěn)態(tài)，RGS6基因能顯著降低小鼠的糖代謝能力，表明RGS6基因在高脂誘導(dǎo)引起的Ⅱ型糖尿病中起到重要作用。

【實(shí)施例3】葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

實(shí)驗(yàn)第12周，進(jìn)行腹腔注射葡萄糖實(shí)驗(yàn)(IPGTT)，以評(píng)價(jià)小鼠機(jī)體對(duì)糖耐受能力。

(1)在測(cè)血糖之前，先測(cè)量小鼠的空腹體重，根據(jù)10μL/g計(jì)算葡萄糖的注射體積。

(2)先檢測(cè)葡糖糖注射前即0分鐘時(shí)空腹血糖，在檢測(cè)完畢后迅速經(jīng)腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和無(wú)名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的頸部，使小鼠的頭部向下，將小鼠腹部充分暴露。②進(jìn)針定位及注射：從腹部一側(cè)進(jìn)針右手持注射器，將尖端與小鼠腹部成45°的夾角，進(jìn)針，回抽，注射時(shí)針頭在腹部皮下穿行一小段距離，穿過(guò)腹中線后在腹部另一側(cè)進(jìn)入腹腔，注射完藥物后，緩緩拔出針頭，并輕微旋轉(zhuǎn)針頭，防止漏液。

(4)分別于腹腔注射后15分、30分、60分、120分鐘時(shí)間點(diǎn)剪尾測(cè)小鼠血糖值，并記錄血糖數(shù)值和檢測(cè)時(shí)間。

進(jìn)一步通過(guò)腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)來(lái)評(píng)估各組小鼠對(duì)葡萄糖的處理能力，在實(shí)驗(yàn)第12周，通過(guò)注射1.0g/kg體重的葡萄糖后，HFD組的WT小鼠和RGS6-KO小鼠血糖水平在15分鐘時(shí)間點(diǎn)劇增達(dá)到峰值，隨著時(shí)間推移至注射后30分鐘，KO組小鼠血糖水平稍微下降，60分鐘后WT組小鼠血糖水平開(kāi)始下降，但二者仍處于高于空腹血糖水平(0分鐘時(shí)血糖)，在2小時(shí)時(shí)恢復(fù)至空腹血糖水平，且RGS6-KO小鼠血糖水平從0分鐘至2小時(shí)一直處于低于WT小鼠的血糖水平(圖3A)。比較各組小鼠血糖曲線下面積(area under the curve，AUC)，發(fā)現(xiàn)WT小鼠HFD組的AUC顯著高于NC組，RGS6-KO HFD組的AUC顯著小于WT HFD組的AUC(圖3B)，表明RGS6對(duì)維持糖代謝穩(wěn)態(tài)具有強(qiáng)大的調(diào)控能力。

【實(shí)施例4】肝臟大體外觀及肝臟組織脂質(zhì)成分測(cè)定

(1)終末肝臟組織取材

1)小鼠稱(chēng)重后，迅速脫頸處死。仰臥固定小鼠，用蒸餾水將小鼠胸部，腹部毛發(fā)潤(rùn)濕。

2)用一鑷子鉗夾小鼠腹部正中皮膚，沿腹部正中向頭部剪開(kāi)皮膚至劍突下，向尾端剪開(kāi)皮膚，逐層暴露皮下筋膜，肌肉等，打開(kāi)腹腔，充分暴露各臟器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝臟，將取下的肝臟標(biāo)本置于滅菌紗布上，拭干肝臟表面上殘留血液，將肝臟置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，迅速拍照，稱(chēng)重。

(2)肝功能測(cè)定

1)開(kāi)啟電腦labman軟件，打印機(jī)，再開(kāi)啟生化分析儀；

2)選擇并清洗檢測(cè)探針、比色杯等，保證探針通暢、比色杯無(wú)雜質(zhì)附著，吸光值在設(shè)定的參考范圍；

3)將待檢測(cè)的血清標(biāo)本從-80℃冰箱中找出；將待檢測(cè)的血清在室溫下復(fù)融至液態(tài)，準(zhǔn)備檢測(cè)；

4)在labman軟件上檢查所需檢測(cè)指標(biāo)試劑是否足夠，設(shè)定檢測(cè)指標(biāo)和檢測(cè)順序等；

5)加入待檢血清樣品50μl，開(kāi)始檢測(cè)；

6)待檢測(cè)完畢后記錄檢測(cè)數(shù)值。

肝臟重量及肝臟重量與小鼠體重比值結(jié)果見(jiàn)圖4所示，在HFD組的RGS6-KO小鼠無(wú)論肝臟重量還是肝臟重量與小鼠本身體重比值均較HFD組的WT小鼠低(如圖4)。進(jìn)一步肝功能檢測(cè)表明，HFD組小鼠肝功明顯較NC組差，而RGS6-KO小鼠的三種肝酶(AST(谷草轉(zhuǎn)氨酶)、ASLT(谷丙轉(zhuǎn)氨酶)、ALP(堿性磷酸酶))均較HFD組的WT小鼠更低(如圖5)。這些結(jié)果說(shuō)明RGS6基因敲除小鼠的脂肪肝明顯好轉(zhuǎn)。

上述結(jié)果顯示RGS6-KO小鼠在HFD的誘導(dǎo)下發(fā)生的Ⅱ型糖尿病和脂肪肝病變顯著減輕。這些結(jié)果表明RGS6基因?qū)又丌蛐吞悄虿『椭靖尉哂酗@著的作用。本發(fā)明結(jié)果說(shuō)明RGS6基因在脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病模型中有著重要的促進(jìn)作用。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 武漢大學(xué)

<120> G蛋白信號(hào)調(diào)節(jié)因子6及其抑制劑在治療脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和應(yīng)用

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6-sRNA1

<400> 1

ggtcacagca tcatgctgta ggcgatgg 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6-sRNA2

<400> 2

ggagtggaca ccacccgtct tacaaagg 28

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> RGS6 LA-F

<400> 3

tcgagtgccc accatgagca gagggagtca tcatcggtgc catcggacgt 50

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> RGS6 LA-R

<400> 4

ccgatggcac cgatgatgac tccctctgct catggtgggc ac 42

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> RGS6 M-F

<400> 5

ccggaattcc ctacagcatg atgctgtgac 30

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> RGS6 M-R

<400> 6

cgggatccta agacgggtgg tgtccact 28

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> RGS6 RA-F

<400> 7

cgcgtcaaag gagagctggg gcactcagag aatggcctcg gctttgc 47

<210> 8

<211> 47

<212> DNA

<213> RGS6 RA-R

<400> 8

ggccgcaaag ccgaggccat tctctgagtg ccccagctct cctttga 47