本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本發(fā)明涉及腫瘤抑制蛋白變體。

背景技術(shù)：

KIAA0157定位于10q26.13(NM_032182.)，mRNA全長(zhǎng)3008bp，cDNA1248bp，編碼416個(gè)氨基酸(序列2)，分子量為47KD的蛋白質(zhì)。小鼠、大鼠與人的KIAA0157同源性高達(dá)90％以上，說(shuō)明它在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，可能發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。利用生物信息學(xué)分析顯示，KIAA0157蛋白內(nèi)部215-266位氨基酸處存在著一個(gè)coiled coil結(jié)構(gòu)域，此結(jié)構(gòu)域通常存在于單體蛋白質(zhì)中，且高度保守，通常介導(dǎo)蛋白與蛋白之間的相互作用。在對(duì)抗凋亡蛋白BPE(BRCA復(fù)合體亞基4)的相互作用蛋白篩選過(guò)程中，KIAA0157被篩選到。該基因及蛋白為全細(xì)胞分布，并在多種腫瘤組織中明顯下調(diào)表達(dá)。高表達(dá)KIAA0157可抑制包括肝癌細(xì)胞\肺癌細(xì)胞\神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，并導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯。

在現(xiàn)有技術(shù)中，為了提高蛋白的活性，針對(duì)蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規(guī)的做法。為了進(jìn)一步提高該蛋白的生物活性，申請(qǐng)人通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)，針對(duì)KIAA0157氨基酸序列中特定的位點(diǎn)進(jìn)行了點(diǎn)突變，從而獲得了比KIAA0157蛋白本身具有更高抑制活性的變體。

發(fā)明詳述

本發(fā)明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置I40H、H57Q、K85P、W94Q、Q110S、H113G、H141Y、N151A、S159P、L160P、K190I、Y213I、V220F、A222Y、R232P、V241Q、R260P、S267T、D276E、S286L、D298S、D303L、Y308K、P313K、Q316S、T319H、H322S、S328A、M331Q、R333R、G338A、P359I、G366F、S372I和P383L的位置包含修飾。具體而言，本發(fā)明的變體具有改善的抑制活性。

優(yōu)選地，應(yīng)用于本發(fā)明的方法、呈現(xiàn)改善的熱穩(wěn)定性和抑制活性的蛋白變體包含至少2種任一下述修飾：I40H/A222Y、H57Q/V220F、K85P/H322S、W94Q/S328A、Q110S/H113G、H141Y/P383L、N151A/G366F、L160P/P383L、K190I/D298S、K85P/R232P、V241Q/S286L、H57Q/R260P、S286L/P383L、W94Q/D298S、Y213I/D303L、Q316S/S372I、Q110S/G338A。

本發(fā)明還涉及產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白變體的方法，包括(a)培養(yǎng)宿主細(xì)胞；和(b)回收所述蛋白變體。

在本發(fā)明的產(chǎn)生方法中，使用本領(lǐng)域熟知的方法在適合于產(chǎn)生所述多肽的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞。例如，可以通過(guò)在合適培養(yǎng)基中和允許表達(dá)和/或分離所述多肽的條件下進(jìn)行的搖瓶培養(yǎng)，和實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā)酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。使用本領(lǐng)域已知的方法在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，所述營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基包含碳源和氮源和無(wú)機(jī)鹽。合適的培養(yǎng)基能夠從商業(yè)供應(yīng)商獲得或可以根據(jù)公開(kāi)的組成制備(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，該多肽能夠從所述培養(yǎng)基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細(xì)胞裂解物(lysate)回收。

所得多肽可以使用本領(lǐng)域已知的方法回收。例如，多肽可以通過(guò)常規(guī)方法從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收，所述常規(guī)方法包括但不限于離心、過(guò)濾、提取、噴霧干燥、蒸發(fā)或沉淀。

本發(fā)明的多肽可以通過(guò)多種本領(lǐng)域已知的方法純化，所述方法包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，制備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、SDS-PAGE或提取(參見(jiàn)，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden編,VCH Publishers,New York,1989)。

本發(fā)明的多肽用于制備相應(yīng)的藥物，用于治療癌癥，優(yōu)選的，治療肝癌。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1：KIAA0157基因的獲得

提出人骨髓細(xì)胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。取1μg定量后的RNA，加水補(bǔ)至10.5μl，70℃、10min，加入2μl的10×buffer、2μl的MgCl2、2μl的dNTP、1μl的oligo dT、1μl的rRNasin、1.5μl的AMV(15U)，反應(yīng)體系共20μl；42℃、1h；94℃、5min；4℃、5min。RNA即反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以5’-CGGAATTCAATGTCCTACAG AGAGCAGGTT-3’；5’-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGG TCTGAGTG-3’為引物PCR擴(kuò)增目的片段。PCR條件為：

Cycle 1(1x)

94℃5min

Cycle 2(30x)

94℃1min

55℃30s

72℃1min

Cycle 3(1x)

72℃10min

PCR產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果產(chǎn)生特異的DNA條帶，將該DNA片段與PMD-18-T載體(TAKARA生物公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli JM109，菌落PCR鑒定為陽(yáng)性克隆后，再經(jīng)酶切鑒定后測(cè)序。測(cè)序后的序列為序列1所示。

實(shí)施例2：相應(yīng)突變后的KIAA0157的獲得方法

1.突變點(diǎn)的引入

(1)根據(jù)相應(yīng)的突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)相應(yīng)的誘變引物，采用PCR定點(diǎn)突變法在KIAA0157基因上把野生型對(duì)應(yīng)的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變；

(2)上述PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，與經(jīng)過(guò)相同酶切的質(zhì)粒pPIC9k片段連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；

2.鑒定重組質(zhì)粒：用酶切、PCR方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并測(cè)序檢驗(yàn)，由此得到突變后的核苷酸序列。

實(shí)施例3、KIAA0157變體過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞集落形成

為了研究KIAA0157變體對(duì)細(xì)胞增殖有影響，我們構(gòu)建了KIAA0157變體-myc/hisB+真核表達(dá)載體，并采用集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了KIAA0157變體在HepG2細(xì)胞中過(guò)表達(dá)后其增殖的變化情況。結(jié)果如下：

表1KIAA0157變體過(guò)表達(dá)抑制細(xì)胞集落形成情況

實(shí)施例4KIAA0157變體表達(dá)引起HepG2細(xì)胞G0/G1期阻滯

為了解KIAA0157變體對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響，我們?cè)贖epG2細(xì)胞轉(zhuǎn)染了帶GFP標(biāo)簽的KIAA0157的真核表達(dá)載體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期各時(shí)相的分布。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與轉(zhuǎn)染KIAA0157原始蛋白相比，轉(zhuǎn)染KIAA0157變體的真核表達(dá)載體后HepG2細(xì)胞出現(xiàn)G0/G1期阻滯的變化，結(jié)果如下：

表2KIAA0157變體針對(duì)HepG2細(xì)胞G0/G1期阻滯的影響水平

序列表

<110>朱育盼

〈120〉一種人腫瘤抑制蛋白變體及其應(yīng)用

〈160〉1

〈210〉1

〈211〉416

〈212〉PRT

〈213〉人種(Homo Sapiens.)

〈400〉1

Met Ala Ala Ser Ile Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Val Cys Phe His 16

Ser Ala Asn Ser Asn Ala Asp His Glu Gly Phe Leu Leu Gly Glu Val 32

Arg Gln Glu Glu Thr Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gln Ile Ser Asn Thr 48

Glu Phe Leu Gln Val Ile Glu Ile His Asn His Gln Pro Cys Ser Lys 64

Leu Phe Ser Phe Tyr Asp Tyr Ala Ser Lys Val Asn Glu Glu Ser Leu 80

Asp Arg Ile Leu Lys Asp Arg Arg Lys Lys Val Ile Gly Trp Tyr Arg 96

Phe Arg Arg Asn Thr Gln Gln Gln Met Ser Tyr Arg Glu Gln Val Leu 112

His Lys Gln Leu Thr Arg Ile Leu Gly Val Pro Asp Leu Val Phe Leu 128

Leu Phe Ser Phe Ile Ser Thr Ala Asn Asn Ser Thr His Ala Leu Glu 144

Tyr Val Leu Phe Arg Pro Asn Arg Arg Tyr Asn Gln Arg Ile Ser Leu 160

Ala Ile Pro Asn Leu Gly Asn Thr Ser Gln Gln Glu Tyr Lys Val Ser 176

Ser Val Pro Asn Thr Ser Gln Ser Tyr Ala Lys Val Ile Lys Glu His 192

Gly Thr Asp Phe Phe Asp Lys Asp Gly Val Met Lys Asp Ile Arg Ala 208

Ile Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Leu Gln Glu Lys Val Gln Ala Val Cys 224

Ala Asp Val Glu Lys Ser Glu Arg Val Val Glu Ser Cys Gln Ala Glu 240

Val Asn Lys Leu Arg Arg Gln Ile Thr Gln Arg Lys Asn Glu Lys Glu 256

Gln Glu Arg Arg Leu Gln Gln Ala Val Leu Ser Arg Gln Met Pro Ser 272

Glu Ser Leu Asp Pro Ala Phe Ser Pro Arg Met Pro Ser Ser Gly Phe 288

Ala Ala Glu Gly Arg Ser Thr Leu Gly Asp Ala Glu Ala Ser Asp Pro 304

Pro Pro Pro Tyr Ser Asp Phe His Pro Asn Asn Gln Glu Ser Thr Leu 320

Ser His Ser Arg Met Glu Arg Ser Val Phe Met Pro Arg Pro Gln Ala 336

Val Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Ser Ala Gly Leu Lys Tyr Pro 352

Gly Ser Gly Ala Asp Leu Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Gly Asp Ser 368

Gly Glu Asp Ser Asp Asp Ser Asp Tyr Glu Asn Leu Ile Asp Pro Thr 384

Glu Pro Ser Asn Ser Glu Tyr Ser His Ser Lys Asp Ser Arg Pro Met 400

Ala His Pro Asp Glu Asp Pro Arg Asn Thr Gln Thr Ser Gln Ile 415