蛋白酶體抑制劑在制備治療慢性低度炎癥性疾病藥物中的用途
【專利摘要】本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及蛋白酶體抑制劑的新用途。本發(fā)明提供了蛋白酶體抑制劑類化合物調(diào)控TM4的表達(dá)，產(chǎn)生抗炎與調(diào)節(jié)能量代謝的功能，應(yīng)用所述蛋白酶體抑制劑MG132、MG341、MG519等，可使TM4上調(diào)、過表達(dá)USP19或降低期降解亦能上調(diào)TM4，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)代謝的效應(yīng)；進(jìn)一步用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物的用途，所述的治療慢性低度炎癥性疾病的藥物可用于肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性代謝性炎癥的防治。本發(fā)明并從體內(nèi)、體外，基因剔除、過表達(dá)，動物、人群，等諸多方面驗證了高脂-TM4-炎癥-肥胖這一全新機(jī)制，具有較高的臨床價值。
【專利說明】
蛋白酶體抑制劑在制備治療慢性低度炎癥性疾病藥
物中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬生物【技術(shù)領(lǐng)域】,涉及蛋白酶體抑制劑(proteinsome inhibitor)的新用途；具體涉及蛋白酶體抑制劑及USP-19 (ubiquitin specific peptidase 19經(jīng)四次穿膜蛋白(TM4)途徑產(chǎn)生抗炎與調(diào)節(jié)能量代謝的功能，進(jìn)一步用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物。

【背景技術(shù)】
[0002]研究公開了，真核細(xì)胞中存在著多種蛋白降解途徑，其中最主要的途徑有兩種:(1)溶酶體途徑:主要是降解細(xì)胞吞入的胞外蛋白質(zhì)；(2)泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome Pathway, UPP):經(jīng)細(xì)胞顆粒中蛋白酶體降解泛素化的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中，泛素-蛋白酶體途徑為近期受到關(guān)注的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)降解與功能的重要系統(tǒng)。通常情況下，細(xì)胞內(nèi)膜相關(guān)蛋白和某些在應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)以及通過內(nèi)吞過程從胞外攝取的蛋白質(zhì)等主要經(jīng)溶酶體途徑降解，其中，泛素-蛋白酶體通路負(fù)責(zé)降解對體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡信號傳導(dǎo)的蛋白，如抑癌因子P53、p21、促凋亡蛋白Bax、細(xì)胞周期蛋白、核因子抑制蛋白I_KB、C-Jun氨基端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)等；而參與凋亡的重要蛋白酶caspase-3也受到所述UPS調(diào)節(jié)；因此，泛素-蛋白酶體通路在調(diào)控細(xì)胞周期和腫瘤生長中發(fā)揮極為重要的作用，漸成為腫瘤治療的新靶點。目前，經(jīng)美國食品藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)，蛋白酶體抑制劑PS-341已經(jīng)進(jìn)入II期臨床應(yīng)用于腫瘤的治療，并取得了比較理想的治療效果。此外，利用所述蛋白酶體抑制劑改變蛋白酶體的酶切位點活性正在免疫、炎癥等研究領(lǐng)域的關(guān)注點。
[0003]肥胖癥和糖尿病已經(jīng)成為全球性的流行病，其發(fā)病率仍在不斷地增加；據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，至2002年全球?qū)⒂?0億成人處于超重，其中3億達(dá)到肥胖標(biāo)準(zhǔn)；北美、英國、西歐、中東、太平洋群島及中國等地區(qū)1980年以來肥胖患者數(shù)量增加了 3倍，其中美國約1/3的人口是肥胖患者，我國肥胖和超重的發(fā)病率從1992至2002年由20%增加到29%。最為令人擔(dān)憂的是，肥胖可誘發(fā)和加重多種疾病，如2型糖尿病、心血管系統(tǒng)疾病(高血壓、動脈粥樣硬化)、高膽固醇血癥、高甘油三酯血癥、非酒精性脂肪肝、腎臟損害、關(guān)節(jié)炎、哮喘以及某些腫瘤。其中，由肥胖引發(fā)的直接和間接經(jīng)濟(jì)開支亦是驚人，例如，2000年美國由肥胖導(dǎo)致的開支達(dá)1170億美元。肥胖已經(jīng)成為危害人類健康和增加國家經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)的一個重要因素；因此，肥胖預(yù)防和治療已經(jīng)成為新時代醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的新的重大課題。
[0004]有研究指出，肥胖的發(fā)病機(jī)制就是機(jī)體能量代謝失衡，即能量攝入大于能量消耗，導(dǎo)致能量以脂肪的形式儲存在體內(nèi)；能量攝入過多，包括食欲增強(qiáng)或亢進(jìn)、胃腸消化吸收功能改變等；研究顯示，食欲的調(diào)控中樞位于下丘腦，下丘腦同時接受胃腸道、脂肪、胰腺等組織器官分泌激素的調(diào)控，進(jìn)一步分泌食欲調(diào)控激素調(diào)節(jié)機(jī)體攝食活動；下丘腦調(diào)控食欲的激素主要包括弓狀核分泌的促進(jìn)食欲的刺鼠相關(guān)肽(AgRP)、神經(jīng)肽Y(NPY)及室旁核分泌的抑制食欲的可卡因-苯丙胺調(diào)控轉(zhuǎn)錄物(CART)、阿黑皮素(POMC);胃腸道分泌的調(diào)控食欲的激素包括:Ghrelin、膽囊收縮素(CCK)、高血糖素樣肽I (GLP-1)、多肽YY (PYY)、胃泌酸調(diào)節(jié)素(Oxm)、胃泌素等，胰腺分泌胰島素、胰多肽、胰島淀粉樣多肽等，脂肪組織有瘦素(Leptin);當(dāng)上述激素的分泌出現(xiàn)紊亂或異常時，引起機(jī)體食欲的變化，影響機(jī)體食物的攝入量；有實驗顯示，當(dāng)小鼠剔除Leptin基因時，抑制攝食中樞活動的信號通路受阻，小鼠的食欲明亢進(jìn)，進(jìn)食量顯著增加，出現(xiàn)明顯的肥胖表型；呈現(xiàn)肥胖時，可引起I印tin抵抗，使得脂肪組織分泌Ieptin增加,但進(jìn)入下丘腦的Ieptin減少，削弱了 Ieptin對食欲的抑制作用；此外，下丘腦分泌的激素還受到記憶、環(huán)境因素、情緒、晝夜節(jié)律等的影響；而胃腸道能量代謝的調(diào)節(jié)首先通過分泌激素調(diào)控了機(jī)體攝食中樞的活性，其次，胃腸道內(nèi)各種菌群差異也是引起肥胖的一個重要因素，胃腸本身的大小長短亦影響機(jī)體對食物的儲留和營養(yǎng)的吸收。肥胖發(fā)病的第二個原因是，機(jī)體能量利用或消耗減少:(1)機(jī)體活動減少，對能量的需求和消耗均減少，導(dǎo)致能量攝入相對過多，如工作強(qiáng)度和生活習(xí)慣的改變；(2)機(jī)體參與能量代謝的激素、酶及其他相關(guān)蛋白的含量、活性發(fā)生改變，如甲狀腺激素、兒茶酚胺類、糖皮質(zhì)激素、胰島素、脂連素、抵抗素、UCP-1/2, GLUT-4、I印tin及其受體、PPAR-Y、白介素(IL)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )等含量或活性異常均能夠引起機(jī)體能量代謝異常；其中，所述白介素、腫瘤壞死因子等為炎癥因子，而所述因子受代謝性因素(糖、脂、糖基化產(chǎn)物等)的刺激，在巨噬細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的表達(dá)和分泌均顯著增加，可引起明顯的胰島素抵抗，因此慢性炎癥與肥胖的關(guān)系成為新的研究熱點。
[0005]研究表明，肥胖和2型糖尿病是一種慢性低度炎癥性疾病。臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，肥胖和2型糖尿病患者血中纖維蛋白原、TNF-a、IL-6、C反應(yīng)蛋白等均顯著升高，且TNF-a等可引起機(jī)體明顯的胰島素抵抗，表明肥胖的發(fā)生發(fā)展與炎癥的發(fā)生有著密不可分的聯(lián)系。有研究證實，高糖高脂等代謝性因素可通過多種途徑激活炎癥細(xì)胞，釋放炎癥介質(zhì)，引起機(jī)體胰島素抵抗等；如高糖提高細(xì)胞核內(nèi)NF-κΒ與DNA的結(jié)合，減少IkB的表達(dá)，增加IKKa、IKKi3激酶蛋白水平，增強(qiáng)該兩種激酶對I K Ba/β的磷酸化，促進(jìn)I κ Ba/β通過泛素途徑進(jìn)行降解；同時高糖增加促炎癥轉(zhuǎn)錄因子AP-1和Egr-1蛋白水平；而高脂則直接通過toll樣受體4活化PKC，誘導(dǎo)下游IKK和JNK兩條炎癥相關(guān)通路的激活，引起機(jī)體胰島素抵抗，破壞機(jī)體能量代謝平衡。研究還顯示，在脂肪組織中，脂肪細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加，導(dǎo)致脂肪細(xì)胞肥大，分泌多種炎癥因子，如TNF-a、白介素6 (IL-6)、單核細(xì)胞趨化因子-1 (MCP-1)、纖溶酶原激活物抑制物I等；其中MCP-1的增加進(jìn)一步促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞向脂肪組織侵潤、活化、吞噬脂質(zhì)并釋放炎癥因子，導(dǎo)致脂肪組織炎癥的加劇，改變脂肪組織各類炎癥因子及脂肪因子的分泌量，促使機(jī)體肥胖加重。有關(guān)研究還顯示，NF-kB信號通路的兩個重要調(diào)控分子IKKβ、IKK ε的基因剔除模型證實抑制炎癥信號通路可明顯改善機(jī)體胰島素抵抗及抑制高熱量飲食誘發(fā)的肥胖，但肥胖和炎癥的關(guān)系尚未完全闡明；目前主要認(rèn)為上述兩者通過以下途徑發(fā)揮相互作用:toll樣受體途徑、氧化應(yīng)激途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑等。本申請的發(fā)明人擬應(yīng)用蛋白酶體抑制劑MG132使TM4上調(diào)、過表達(dá)USP19上調(diào)TM4，提供該蛋白酶體抑制劑的抗炎、調(diào)節(jié)代謝的新用途，進(jìn)一步用于制備防治肥胖、糖尿病和動脈粥樣硬化等慢性代謝性炎癥的藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供蛋白酶體抑制劑(proteinsome inhibitor)的新用途；具體涉及蛋白酶體抑制劑及其相互作用蛋白經(jīng)四次穿膜蛋白(TM4)途徑產(chǎn)生抗炎與調(diào)節(jié)能量代謝的作用，進(jìn)一步用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物。
[0007]本發(fā)明運用表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)及cDNA芯片技術(shù)研究證實人下丘腦、脂肪等組織和高糖高脂糖尿病猴主動脈、胰腺等組織中的基因表達(dá)譜，克隆得到有關(guān)新基因與肥胖及2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，尤其是其中的表達(dá)的蛋白含有4個穿膜結(jié)構(gòu)袢的基因，本發(fā)明命名為4次穿膜(Transmembrane 4，TM4)蛋白，TM4為跨膜蛋白，存在于細(xì)胞膜及核膜，該基因在糖尿病猴組織中下調(diào)最為明顯。
[0008]本發(fā)明所述的蛋白酶體抑制劑包括MG 132、MG341、MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5 和 USP19。
[0009]本發(fā)明中，通過酵母雙雜交獲得TM4相互作用蛋白，包括Nur77、RNF-5 (ringfinger protein-5)、USP-19 (ubiquitin specific peptidase 19)等，并通過 pull down試驗證實TM4與Nu77相互作用；
本發(fā)明中，實驗證實了蛋白酶體抑制劑與相互作用蛋白USP 19能夠增加TM4的量； 本發(fā)明所述的USP19可增加TM4含量，USP19降解抑制劑可作為治療慢性炎癥。
[0010]本發(fā)明中，制備了 TM4基因剔除小鼠，并從基因組水平和蛋白水平鑒定模型構(gòu)建成功；通過TM4基因剔除小鼠模型，證實在高脂飲食誘導(dǎo)下TM4基因剔除小鼠呈現(xiàn)顯肥胖表型，肥胖鼠脂肪、體重比明顯增加，且攝食量顯著增加，糖耐量減退；TM4基因剔除的肥胖小鼠脂肪和肝臟micro-array結(jié)果顯示Nur77和NF κ B表達(dá)明顯增高,糖耐量減退；
本發(fā)明中，高脂誘導(dǎo)條件下，可以顯著下調(diào)ΤΜ4蛋白表達(dá)水平，通過構(gòu)建慢病毒干擾ΤΜ4后，可引起Nur77蛋白水平上調(diào)，且該調(diào)控作用不在轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)而導(dǎo)致IKK β和IKK ε的表達(dá)增強(qiáng)，從而調(diào)節(jié)NF-κ B炎癥通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使得各類炎癥因子分泌增加，其中，IKK ε還可抑制UCP-1表達(dá)，使得脂肪組織通過UCP表達(dá)減少，抑制脂肪的分解，誘發(fā)或加重肥胖；本發(fā)明的實際臨床標(biāo)本中，驗證ΤΜ4在糖尿病病人中顯著下調(diào)；
本發(fā)明中，經(jīng)試驗證實，Nur77的上調(diào)使得IKK-b表達(dá)增強(qiáng)；過表達(dá)TM4可引起Nur77蛋白水平下調(diào)，IKK-b表達(dá)降低；
本發(fā)明中，經(jīng)試驗證實TM4基因剔除小鼠模型血壓高于正常對照組小鼠，血管張力實驗證實基因剔除后小鼠舒張功能受限；.db/db小鼠過表達(dá)TM4基因后，肥胖、高血壓、高血糖得到明顯緩解；本發(fā)明的臨床實驗中，96個肥胖患者觀察到4例病人TM4外顯子雜合突變(L26F、S128P、P227S)，進(jìn)一步家系篩查發(fā)現(xiàn)這些突變和肥胖共分離。
[0011]本發(fā)明中，實驗顯示，在下丘腦-垂體軸中，Nur77調(diào)控食欲的關(guān)鍵激素a-MSH前體物POMC的表達(dá)，Nur77通過結(jié)合POMC上游抑制性調(diào)控元件抑制PMOC的轉(zhuǎn)錄，減少POMC的產(chǎn)生；機(jī)體能量過?？梢砸鹣虑鹉X內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)，導(dǎo)致IKKb-NF-kB通路的激活，繼而改變下丘腦內(nèi)AGRP神經(jīng)元活性，導(dǎo)攝食改變，并引起機(jī)體胰島素抵抗、I印tin抵抗和糖代謝紊舌L研究發(fā)現(xiàn)，乙?；梢哉{(diào)節(jié)糖脂代謝酶類的活性，從而改變能量代謝。
[0012]本發(fā)明的實驗結(jié)果顯示，蛋白酶體抑制劑不僅通過抑制蛋白酶體活性進(jìn)而干擾和影響細(xì)胞原有的功能，對腫瘤細(xì)胞生長有明顯的抑制作用；實驗結(jié)果表明，TM4在代謝性因素所致代謝性炎癥過程中尤其在肥胖和2型糖尿病發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵作用；所述的TM4可進(jìn)一步作為肥胖和2型糖尿病的預(yù)防和治療的治療靶點。
[0013]本發(fā)明提供了蛋白酶體抑制劑類化合物調(diào)控TM4的表達(dá)，產(chǎn)生抗炎與調(diào)節(jié)能量代謝的功能，應(yīng)用所述蛋白酶體抑制劑MG132可使TM4上調(diào)、過表達(dá)USP19或抑制其降解能上調(diào)TM4，從而發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)代謝的效應(yīng)；進(jìn)一步用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物的用途，所述的治療慢性低度炎癥性疾病的藥物可用于肥胖、2型糖尿病、動脈粥樣硬化等慢性代謝性炎癥的防治。本發(fā)明并從體內(nèi)、體外，基因剔除、過表達(dá)，動物、人群，等諸多方面驗證了高脂-TM4-炎癥-肥胖這一全新機(jī)制，具有較高的臨床價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1蛋白酶體抑制劑MG132上調(diào)TM4表達(dá)。
[0015]圖2a干擾USP 19后TM4下調(diào)，圖2b過表達(dá)USP 19后TM4上調(diào)。
[0016]圖3 TM4基因剔除小鼠模型及其鑒定(211、221為野生型，219、222為純合子)。
[0017]圖4左側(cè)為TM剔除小鼠、右側(cè)為野生型。
[0018]圖5左側(cè)為TM4剔除小鼠、右側(cè)為野生型。
[0019]圖6左側(cè)為TM4剔除小鼠、右側(cè)為野生型。
[0020]圖7小鼠體重比較。
[0021]圖8小鼠攝食量比較。
[0022]圖9 口服糖耐量實驗檢測小鼠血糖。
[0023]圖10酵母雙雜交篩選相互作用蛋白及部分測序結(jié)果。
[0024]圖11 Nur77蛋白表達(dá)純化。
[0025]圖12 pull down。
[0026]圖13 siRNA干擾序列的篩選。
[0027]圖14慢病毒干擾TM4表達(dá)及對下游靶蛋白的影響。
[0028]圖15干擾TM4對下游TM4的影響。
[0029]圖16 TM4 對 ΙΚΚ-b 的影響。
[0030]圖17 RT-PCR 檢測 ΙΚΚ-b。
[0031]圖18過表達(dá)TM4可以下調(diào)Nur77及下游的IKK_b、NF_kB。
[0032]圖19小鼠血壓，
WT:wild typeKO:knock out 。
[0033]圖20血管張力測定。
[0034]圖21 TM4過表達(dá)使db/db小鼠的肥胖緩解。
[0035]圖22 TM4過表達(dá)使db/db小鼠的高血壓緩解。
[0036]圖23 TM4過表達(dá)使db/db小鼠的高血糖緩解。
[0037]圖24 TM4過表達(dá)使db/db小鼠的糖耐量改善。
[0038]圖25 TM4的細(xì)胞定位。
[0039]圖26 TM4基因在糖尿病猴和糖尿病患者的主動脈中表達(dá)下調(diào)。
[0040]圖27高糖下調(diào)血管平滑肌細(xì)胞中TM4基因表達(dá)的劑量曲線。
[0041]圖28 TM4在胰島中主要表達(dá)于胰島α細(xì)胞。
[0042]圖29 ΤΜ4在a細(xì)胞(G9)高表達(dá)，在b細(xì)胞(INS-1)低表達(dá)。
[0043]圖30高糖下調(diào)TM4在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)。
[0044]圖31肥胖患者中篩查倒的L26F (c.76 C — T)雜合突變測序圖。
[0045]圖32肥胖患者中篩查倒的S128P (c.382 T — C)雜合突變測序圖。
[0046]圖33肥胖患者中篩查倒的P227S (c.679 C — T)雜合突變測序圖。
[0047]圖34是實施例1中的回收產(chǎn)物測序結(jié)果。

【具體實施方式】
[0048]實施例1克隆得到跨膜蛋白TM4基因
1.TM4基因的克隆
1)引物設(shè)計:
根據(jù) TM4 基因信息(人 NM_001144072.1，小鼠 NM_026861)以及 pcDNA_GFPLentivector (CD511A-1, System B1sciences)載體,使用 01igo6.6 引物設(shè)計軟件，設(shè)計引物如下:
TM4(人)-上游引物:5’ - G(保護(hù)堿基)GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACCGG -3’
TM4(人)-下游引物:5’ - CG(保護(hù)堿基)GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAG-3’TM4(小鼠)-上游引物:5’ -G(保護(hù)堿基)GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACC-3’
TM4 (小鼠)-下游引物:5 ’ - CG (保護(hù)堿基)GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAGGAA-3，
2)引物合成:
Page級純化，20D合成量；
2.PCR 擴(kuò)增 TM4 cDNA
1)反應(yīng)體系和條件
(1)PCR擴(kuò)增體系如下表所示:

【權(quán)利要求】
1.蛋白酶體抑制劑在制備用于治療慢性低度炎癥性疾病藥物中的用途。
2.按權(quán)利要求1的用途，其特征在于，所述的蛋白酶體抑制劑包括MG132、MG341MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5和USP19。
3.按權(quán)利要求1的用途，其特征在于，所述的慢性低度炎癥性疾病包括肥胖、2型糖尿病或動脈粥樣硬化。
4.按權(quán)利要求2的用途，其特征在于，所述的USP19降解抑制劑在用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物。
5.按權(quán)利要求2的用途，其特征在于，所述的蛋白酶體抑制劑及其相互作用蛋白USP-19降解的抑制劑經(jīng)四次穿膜蛋白(TM4)途徑產(chǎn)生抗炎與調(diào)節(jié)能量代謝作用后，用于制備治療慢性低度炎癥性疾病的藥物。
6.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白含有4個穿膜結(jié)構(gòu)袢的基因，命名為4次穿膜(TM4)蛋白，該TM4為跨膜蛋白，定位在細(xì)胞膜及核膜上。
7.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4與Nu77相互作用，干擾TM4引起Nur77蛋白水平上調(diào)，且該調(diào)控作用不在轉(zhuǎn)錄水平。
8.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的Nur77上調(diào)使IKK_b表達(dá)增強(qiáng)。
9.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4過表達(dá)引起Nur77蛋白水平下調(diào)，IKK-b表達(dá)降低。
10.按權(quán)利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白在制備篩查肥胖、高血壓、高血糖患者制劑中的用途。
【文檔編號】A61P3/04GK104174021SQ201310191848
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2013年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月22日
【發(fā)明者】胡仁明, 王宣春, 馮嘵鋮, 陳立立, 黃頴, 李群, 李連喜, 葉魏魏, 葉寬萍, 葉子, 李因濤, 何敏 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院