本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關(guān)蛋白GsHA16及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：土壤鹽堿化加劇是全世界面臨的重大問(wèn)題，并且嚴(yán)重制約植物正常生長(zhǎng)發(fā)育。世界上有23％的耕地面積是堿性土壤，以及37％的耕地面積是鹽性土壤。僅中國(guó)東北地區(qū)，堿化的牧場(chǎng)就已高達(dá)70％，并逐年增加。土壤中鹽成分的關(guān)鍵物質(zhì)是中性鹽(NaCl和Na2SO4)和堿性鹽(NaHCO3和Na2CO3)，并且堿性鹽除了中性鹽所造成的傷害外還包含碳酸根及碳酸氫根產(chǎn)生的pH傷害，對(duì)植物造成的傷害更大。因此，如何提高植物耐堿性、合理開(kāi)發(fā)利用鹽堿地資源，挖掘逆境農(nóng)業(yè)生態(tài)區(qū)生產(chǎn)潛力，是我國(guó)農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展、保證我國(guó)糧食安全亟待解決的重大問(wèn)題之一?，F(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，尤其是生物信息學(xué)、功能基因組學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，為挖掘耐鹽堿關(guān)鍵基因、分子育種以及合理開(kāi)發(fā)利用鹽堿地奠定了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。植物質(zhì)膜H+-ATPase是一類廣泛存在于植物質(zhì)膜及內(nèi)膜系統(tǒng)的質(zhì)子泵，主要功能是分解并利用細(xì)胞內(nèi)ATP的分解釋放出的能量將質(zhì)子運(yùn)出細(xì)胞，產(chǎn)生并維持細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)H+的電化學(xué)梯度，為次級(jí)轉(zhuǎn)運(yùn)體和通道蛋白對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)提供能量。此外，質(zhì)膜H+-ATPase還參與細(xì)胞內(nèi)pH平衡、細(xì)胞伸長(zhǎng)、氣孔開(kāi)閉以及植物響應(yīng)外界脅迫等多種生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何調(diào)控植物抗逆性。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了與植物抗逆性相關(guān)蛋白，本發(fā)明所提供的與植物抗逆性相關(guān)蛋白的名稱為GsHA16，為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白質(zhì)；b)在序列2所示的蛋白質(zhì)的N端和/或C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)。其中，序列2由951個(gè)氨基酸殘基組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1、標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-His2-10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述c)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列1所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了與GsHA16蛋白相關(guān)的生物材料。本發(fā)明提供的與GsHA16蛋白相關(guān)的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼GsHA16蛋白的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達(dá)盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達(dá)盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達(dá)盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A10)含有A2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系。上述相關(guān)生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列1所示的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，序列1由2856個(gè)核苷酸組成，編碼序列2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼GsHA16蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有編碼GsHA16蛋白的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GsHA16蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語(yǔ)“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GsHA16蛋白的核酸分子的表達(dá)盒(GsHA16基因表達(dá)盒)，是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)GsHA16蛋白的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)GsHA16轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止GsHA16轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于：組成型啟動(dòng)子；組織、器官和發(fā)育特異的啟動(dòng)子及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S：來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187，267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，057,422)；種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子pF128(CN101063139B(中國(guó)專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子(參見(jiàn)，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述GsHA16基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號(hào)可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、抗生素的標(biāo)記基因(如賦予對(duì)卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的nptII基因，賦予對(duì)除草劑膦絲菌素抗性的bar基因，賦予對(duì)抗生素潮霉素抗性的hph基因，和賦予對(duì)氨甲喋呤抗性的dhfr基因，賦予對(duì)草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等(如抗除莠劑基因)、提供代謝甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶基因。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細(xì)菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了GsHA16蛋白或上述相關(guān)生物材料的新用途。本發(fā)明提供了GsHA16蛋白或上述相關(guān)生物材料在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了GsHA16蛋白或上述相關(guān)生物材料在培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO3脅迫，體現(xiàn)為在NaHCO3脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)高于受體植物。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明最后提供了一種培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育抗逆性提高的轉(zhuǎn)基因植物的方法包括在受體植物中過(guò)表達(dá)GsHA16蛋白，得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述受體植物。上述方法中，所述過(guò)表達(dá)的方法為將GsHA16蛋白的編碼基因?qū)胧荏w植物。上述方法中，所述GsHA16蛋白的編碼基因的核苷酸序列是序列1所示的DNA分子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述GsHA16蛋白的編碼基因(即序列表中序列1所示的DNA分子)通過(guò)重組載體pCAMBIA330035Su-GsHA16導(dǎo)入所述受體植物中，所述重組載體pCAMBIA330035Su-GsHA16為在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。上述方法中，所述抗逆性為抗碳酸鹽脅迫，所述抗碳酸鹽脅迫具體為抗NaHCO3脅迫，體現(xiàn)為在NaHCO3脅迫的條件下：轉(zhuǎn)基因植物的根長(zhǎng)高于受體植物。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體可為豆科植物和/或十字花科植物和/或菊科植物；所述豆科植物可為大豆、百脈根、苜?；蛩S皮；所述十字花科植物可為擬南芥或油菜；所述菊科植物可為向日葵；所述擬南芥可為擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GsHA16基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對(duì)于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細(xì)胞。擴(kuò)增編碼上述GsHA16蛋白的核酸分子全長(zhǎng)或其片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種與植物碳酸鹽脅迫耐性相關(guān)蛋白GsHA16。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，將GsHA16基因超表達(dá)于擬南芥中，可增強(qiáng)擬南芥對(duì)碳酸鹽脅迫的耐性，說(shuō)明該蛋白可以為培育具有碳酸鹽脅迫耐性的轉(zhuǎn)基因植物的研究奠定基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1為GsHA16蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位分析。圖2為GsHA16基因在碳酸鹽脅迫下的表達(dá)模式分析。圖3為GsHA16轉(zhuǎn)基因擬南芥PCR鑒定。圖4為GsHA16轉(zhuǎn)基因擬南芥RT-PCR鑒定。圖5為轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥的耐碳酸鹽脅迫分析。其中，圖5A為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的幼苗期表型；圖5B為不同濃度的碳酸鹽脅迫處理后的T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的根長(zhǎng)，其中，縱坐標(biāo)代表根長(zhǎng)，橫坐標(biāo)代表NaHCO3濃度；圖5C為150mM的NaHCO3脅迫處理后的T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的成苗期表型。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的野生大豆G07256種子在文獻(xiàn)“MingzheSun,XiaoliSun,YangZhao,HuaCai,ChaoyueZhao,WeiJi,HuiziDuanMu,YangYu,YanmingZhu.EctopicexpressionofGsPPCK3andSCMRPinMedicagosativaenhancesplantalkalinestresstoleranceandmethioninecontent.PLOSONE2014,9(2):e89578”中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)或東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pBSK-eGFP載體在文獻(xiàn)“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)或東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的pCAMBIA330035Su載體在文獻(xiàn)“XiaoliSun,WeiJi,XiaodongDing,XiBai,HuaCai,ShanshanYang,XueQian,MingzheSun,YanmingZhu.GsVAMP72,anovelGlycinesojaR-SNAREprotein,isinvolvedinregulatingplantsalttoleranceandABAsensitivity.PlantCellTissOrganCult2013,113:199–215”中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)或東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的根癌農(nóng)桿菌GV3101在文獻(xiàn)“LeeCW,etal.AgrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinArabidopsisthaliana,PlantCell,2009,21(9),2948-62”中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)或東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。下述實(shí)施例中的野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型col-0)在文獻(xiàn)“LuoX,SunX,LiuB,etal.EctopicexpressionofaWRKYhomologfromGlycinesojaaltersfloweringtimeinArabidopsis[J].PloSone,2013,8(8):e73295.”中公開(kāi)過(guò)，公眾可以從黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)或東北農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。實(shí)施例1、野生大豆中耐碳酸鹽相關(guān)基因GsHA16的獲得一、GsHA16基因的獲得1、總RNA的提取選取飽滿的野生大豆G07256種子，用濃H2SO4處理10min，無(wú)菌水沖洗3～4次，25℃暗培養(yǎng)2-3d催芽。待芽長(zhǎng)到1～2cm時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至1/4Hogland營(yíng)養(yǎng)液中，置于人工氣候箱中培養(yǎng)。取3周齡野生大豆G07256幼苗的根，采用RNApreppure試劑盒(TIANGEN)提取總RNA。2、cDNA的獲得以O(shè)ligodT為引物進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成，方法參見(jiàn)Invitrogen公司SuperScriptTMIIIReverseTranscriptase說(shuō)明書(shū)，得到野生大豆總cDNA。3、PCR擴(kuò)增以野生大豆總cDNA為模板，采用引物GsHA16-FL-F和GsHA16-FL-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。引物序列如下：GsHA16-FL-F：5'-ATGGGTGGCATCAGCCTCGA-3'；GsHA16-FL-R：5'-TTAAACTGTATAGTGCTGCTGAATCGTGT-3'。4、GsHA16基因的克隆載體構(gòu)建及測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物與pEASY-T載體連接，構(gòu)建pEASY-GsHA16克隆載體。并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：PCR擴(kuò)增得到的大小為2856bp的DNA片段，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為GsHA16基因，自5’端第1-2856位為ORF，GsHA16基因編碼序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)，將序列2所示的氨基酸序列命名為GsHA16蛋白。二、GsHA16蛋白在植物細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞定位分析1、以pEASY-GsHA16克隆載體質(zhì)粒為模板，采用GsHA16-GFP-F/GsHA16-GFP-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到GsHA16基因全長(zhǎng)CDS區(qū)(不含終止密碼子TAA)，引物序列如下所示(下劃線代表酶切位點(diǎn))：GsHA16-GFP-F:5’-CGCATCGATATGGGTGGCATC-3’；GsHA16-GFP-R:5’-GGCTCTAGAAACTGTATAGTGCTGCTGAAT-3’。2、用限制性內(nèi)切酶ClaI和XbaI分別對(duì)GsHA16基因全長(zhǎng)CDS區(qū)和pBSK-eGFP載體進(jìn)行雙酶切，連接，構(gòu)建GsHA16-eGFP融合表達(dá)載體。通過(guò)PEG法將GsHA16-eGFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，同時(shí)以未轉(zhuǎn)化GsHA16-eGFP載體的原生質(zhì)體作為對(duì)照，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察綠色熒光蛋白表達(dá)。結(jié)果如圖1所示，未轉(zhuǎn)化GsHA16-eGFP載體的原生質(zhì)體細(xì)胞中沒(méi)有觀察到綠色熒光信號(hào)，而轉(zhuǎn)化GsHA16-eGFP載體的原生質(zhì)體細(xì)胞中綠色熒光蛋白主要分布在細(xì)胞膜上，說(shuō)明GsHA16蛋白主要定位在細(xì)胞膜上。三、GsHA16基因在碳酸鹽脅迫條件下的表達(dá)模式分析1、植物材料的處理取3周齡的野生大豆幼苗，置于50mMNaHCO3(碳酸鹽脅迫)條件下處理，分別取處理0h、1h、3h、6h和12h的根尖組織，置于-80℃保存。2、cDNA的獲得取經(jīng)上述處理不同時(shí)間后的野生大豆根尖組織各約100mg，液氮研磨，用RNAprepPlantKit(TIANGEN,catno:DP432)試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptTMIIIReverseTranscriptasekit(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。3、通過(guò)Real-timePCR對(duì)GsHA16基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)以上述步驟2獲得的cDNA為模板，采用引物GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R進(jìn)行Real-timePCR，對(duì)GsHA16基因進(jìn)行表達(dá)量檢測(cè)。引物序列如下所示：GsHA16-RT-F：5’-ATCTTCGTCACAAGGTCCCGC-3’；GsHA16-RT-R：5’-GCAAAGCCCCAGTTAGCATACAC-3’。Real-timePCR采用比較CT法(ΔΔCT)計(jì)算基因表達(dá)量，以野生大豆GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，以未經(jīng)處理的樣品作為對(duì)照。目標(biāo)基因表達(dá)差異通過(guò)經(jīng)過(guò)處理的樣本相對(duì)于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)未經(jīng)處理的樣本的倍數(shù)來(lái)表示。每個(gè)樣品包括3次生物學(xué)重復(fù)和3次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)取3次生物學(xué)重復(fù)的平均值，如果有一個(gè)數(shù)值的偏差比較大則取兩個(gè)數(shù)據(jù)的平均值。原始數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理。標(biāo)準(zhǔn)化處理后的數(shù)據(jù)經(jīng)T-test進(jìn)行差異顯著性分析。相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法：2-ΔΔCT＝2-(ΔCT處理-ΔCT對(duì)照)＝2-[(CT處理目的基因-CT處理內(nèi)參基因)-(CT對(duì)照目的基因-CT對(duì)照內(nèi)參基因)]。內(nèi)參基因引物序列如下所示：GAPDH-RT-F：5’-GACTGGTATGGCATTCCGTGT-3’；GAPDH-RT-R：5’-GCCCTCTGATTCCTCCTTGA-3’。定量Real-timePCR結(jié)果如圖2所示：碳酸鹽脅迫處理后，GsHA16基因表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，并在碳酸鹽脅迫處理6h后達(dá)到頂峰，表明GsHA16基因的表達(dá)受碳酸鹽脅迫誘導(dǎo)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥植株的獲得及耐鹽堿性分析一、轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥植株的獲得1、以pEASY-GsHA16克隆載體為模板，采用基因特異引物GsHA16-U-F和GsHA16-U-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到GsHA16基因全長(zhǎng)CDS區(qū)。引物序列如下(下劃線代表載體構(gòu)建時(shí)所需的接頭序列，其中U為USER酶切位點(diǎn))：GsHA16-U-F:5’-GGCTTAAUATGGGTGGCATCAGC-3’；GsHA16-U-R:5’-GGTTTAAUTTAAACTGTATAGTGCTGCTGA-3’。2、用限制性內(nèi)切酶PacI和Nt.BbvCI對(duì)pCAMBIA330035Su載體進(jìn)行雙酶切，得到載體酶切產(chǎn)物。將獲得的載體酶切產(chǎn)物、USER酶(NEB,M5505S)和步驟1獲得的GsHA16基因在37℃下孵育20min，利用USER酶對(duì)GsHA16基因片段的尿嘧啶處進(jìn)行切割，形成可與pCAMBIA330035Su載體互補(bǔ)的粘性末端，接著25℃下孵育20min，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α(全式金，CD201-01)，得到的重組表達(dá)載體記作pCAMBIA330035Su-GsHA16，并送交測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明：pCAMBIA330035Su-GsHA16在pCAMBIA330035Su載體中插入如序列表中序列1所示的GsHA16基因。GsHA16基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3、采用凍融法，將pCAMBIA330035Su-GsHA16載體轉(zhuǎn)化至根癌農(nóng)桿菌GV3101，獲得重組農(nóng)桿菌，并經(jīng)PCR鑒定得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子(含有序列表中序列1所示的GsHA16轉(zhuǎn)化子)，用于侵染擬南芥植株。4、轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥的獲得及鑒定將上述重組農(nóng)桿菌通過(guò)Floral-dip法侵染野生型擬南芥(哥倫比亞生態(tài)型)。將T0代種子表面消毒后，播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選。將T1代抗性苗移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中培養(yǎng)，提取基因組DNA，進(jìn)行PCR和RT-PCR鑒定。具體步驟如下：采用EasyPurePlantGenomicDNAKit基因組提取試劑盒(全式金，EE111-01)，提取野生型和固殺草抗性植株的基因組DNA，用基因特異引物(GsHA16-FL-S和GsHA16-FL-AS)進(jìn)行PCR鑒定(圖3)。對(duì)PCR鑒定陽(yáng)性的植株，提取總RNA，采用半定量RT-PCR，以擬南芥ACTIN2基因?yàn)閮?nèi)參，利用實(shí)施例1中的Real-timePCR引物(GsHA16-RT-F和GsHA16-RT-R)檢測(cè)GsHA16基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量(圖4)。ACTIN2基因特異引物序列如下：ACTIN2-RT-F：5’-TTACCCGATGGGCAAGTC-3’；ACTIN2-RT-R：5’-GCTCATACGGTCAGCGATAC-3’。將RT-PCR陽(yáng)性的T1代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥單株收種子，并分別播種于含25mg/L固殺草的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，觀察T2代分離情況。如此重復(fù)，直至得到T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系。選取T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)用于下述耐碳酸鹽分析。二、轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥耐碳酸鹽分析1、選取飽滿的野生型擬南芥、T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的種子，用5％NaClO處理6-8min，滅菌ddH2O沖洗5-7次，4℃春化3d，播種于正常的1/2MS培養(yǎng)基，22℃培養(yǎng)11d。待擬南芥長(zhǎng)至六葉期，將幼苗分別移至正常的1/2MS培養(yǎng)基、含7mMNaHCO3的1/2MS培養(yǎng)基、含8mMNaHCO3的1/2MS培養(yǎng)基和9mMNaHCO3的1/2MS培養(yǎng)基豎直培養(yǎng)7d。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖5A和圖5B所示。當(dāng)NaHCO3的濃度為7mM時(shí)，T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長(zhǎng)分別為4.37cm和4.49cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為3.98cm。當(dāng)NaHCO3的濃度為8mM時(shí)，T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長(zhǎng)分別為3.79cm和3.94cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為3.71cm。當(dāng)NaHCO3的濃度為9mM時(shí)，T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長(zhǎng)分別為3.08cm和2.97cm；野生型擬南芥的根長(zhǎng)為2.74cm。從圖中和以上結(jié)果可以看出：碳酸鹽脅迫抑制了野生型擬南芥、T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的根的伸長(zhǎng)(圖5A)，但T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(4#)的根長(zhǎng)要長(zhǎng)于野生型擬南芥(圖5B)。2、選取飽滿的野生型擬南芥、T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)種子，春化后播種于營(yíng)養(yǎng)缽中(營(yíng)養(yǎng)土：君子蘭土：蛭石1：1：1)，置于人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的4周齡擬南芥植株，每3d澆灌1次150mMNaHCO3(pH9.0)溶液進(jìn)行鹽堿脅迫處理，觀察脅迫處理后植株表型。結(jié)果如圖5C所示：碳酸鹽脅迫處理后野生型擬南芥、T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)都逐漸失綠變紫甚至死亡，但是T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE3(#3)和T3代轉(zhuǎn)GsHA16擬南芥純合體株系OE4(#4)的長(zhǎng)勢(shì)明顯優(yōu)于野生型。上述結(jié)果表明GsHA16基因超量表達(dá)顯著提高了植物的碳酸鹽脅迫耐性。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3