專利名稱：低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用，屬于微生物學(xué)，分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2009年，美國ASCO主席在介紹腫瘤進(jìn)展時提到，癌癥的第一死亡原因是癌癥本身和癌癥復(fù)發(fā)，第二位死因就是血栓。癌癥與血栓的關(guān)系非常密切，重視癌癥血栓的預(yù)防和治療已成為臨床醫(yī)生今后工作的重點之一。1865年，法國醫(yī)生Armand Trousseau首次報道了胃癌患者容易形成靜脈血栓， 不久，Billroth又于1878年發(fā)現(xiàn)了血栓中存在癌細(xì)胞，進(jìn)一步提出癌變可引起凝血功能紊亂。臨床上把腫瘤相關(guān)性血栓稱為Trousseau綜合癥。大量的病理、實驗和臨床研究證實了這一現(xiàn)象，而且還發(fā)現(xiàn)，幾乎所有的癌癥患者都存在局部或全部高凝狀態(tài)。癌癥患者的血栓性疾病包括深靜脈血栓(de印venous thlmmbosis，DVT)、肺 ^ (pulmonary embolism, ΡΕ) > ^ 1 ifil iW M ifil (disseminated intravascular
coagulation, DIC)、門靜脈血檢(portal vein thmrnbosis, PVT)禾口動脈血檢栓塞(arterial thromboembolism, AT)、游走性淺表血栓性靜脈炎(migratory thrombophlebitis superficial)等，其中下肢 DVT 最為常見。癌癥患者血栓形成的發(fā)病機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，至今尚未完全明確。多種因素通過不同途徑共同導(dǎo)致了癌癥患者的血栓易患傾向，主要包括抗癌治療、腫瘤細(xì)胞的表達(dá)物及釋放物和致癌基因等因素。抗癌治療導(dǎo)致血栓形成，主要是手術(shù)治療期間形成血栓，化療藥物和放射治療誘發(fā)血栓形成以及患者在接受中心靜脈穿刺置管治療期間，管周纖維蛋白鞘導(dǎo)致血栓形成。癌癥患者所患的血栓性疾病與腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的物質(zhì)關(guān)系密切。腫瘤細(xì)胞可通過釋放促凝因子或炎性因子來直接或間接地激活凝血級聯(lián)反應(yīng)，另一方面，炎性因子亦可刺激腫瘤細(xì)胞釋放更多的促凝因子而加劇血液的高凝狀態(tài)。腫瘤細(xì)胞表達(dá)和釋放的三種主要促凝物質(zhì)為組織因子(TF)、癌促凝物質(zhì)(cancer procoagulant CP)和絲氨酸蛋白酶 (hepsin)。新近的研究表明，某些致癌基因在促進(jìn)細(xì)胞惡變的同時也能夠引起凝血功能紊亂。如Yu J等證實，導(dǎo)致癌癥產(chǎn)生的某些基因病變?nèi)鏡as基因活化或p53基因失活能夠造成組織因子(TF)的過度表達(dá)，誘發(fā)凝血病變。最近的研究還顯示，血栓形成參與了腫瘤的進(jìn)展、血管生成和轉(zhuǎn)移等機(jī)制。除了癌癥治療形成血栓可視為外界因素外，其余兩種因素所形成的血栓都是應(yīng)機(jī)體癌變出現(xiàn)的。 研究發(fā)現(xiàn)，血栓的形成有利于腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制可能是纖維蛋白沉積于腫瘤細(xì)胞周圍為腫瘤生長提供了 2個便利條件一方面為腫瘤細(xì)胞附著提供了基質(zhì)，利于其局部擴(kuò)散和蔓延；另一方面，纖維蛋白凝血塊和相關(guān)的凝血因子能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的表達(dá)(VEGF)，從而為新生血管創(chuàng)造了條件。
金黃色葡萄球菌腸毒素C2 (staphylococcal enterotoxins, SEC2)是一類細(xì)菌超抗原，它們無需抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cells, APCs)的加工，也不受組織相容性復(fù)合體(MHC)的限制，在APC之外與T細(xì)胞受體V β鏈形成MHCII-SE-TCRVii復(fù)合物， 在極低濃度時就能刺激大部分有TCRVii序列的T細(xì)胞增殖，使之釋放多種細(xì)胞因子，產(chǎn)生極強(qiáng)的免疫應(yīng)答效應(yīng)。SEC2可對腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生超抗原依賴的細(xì)胞毒作用(Sag-cbpendent cell-mediated T-cell-derived cytotoxicity, SDCC)，從而產(chǎn)生系統(tǒng)的抗腫瘤反應(yīng)。但作為潛在胃腸毒素，SEC2可引起食物中毒，引發(fā)腹絞痛和腹瀉，作為外源蛋白，SEC2分子量大，易引起超敏反應(yīng)。N端17個氨基酸以及C端132個氨基酸缺失的ASEC2分子量小，毒副作用降低，而其抗腫瘤活性得以保持。葡激酶(staphylokinase，Mk)是由具有溶原性的金黃色葡萄球菌在指數(shù)期后期產(chǎn)生、分泌的一種胞外蛋白。葡激酶的溶栓作用機(jī)制是激活體內(nèi)溶栓系統(tǒng)，即通過激活纖溶酶原(Plg)轉(zhuǎn)變成纖溶酶(Pli)，而起到溶解血栓的作用，是典型的第三代溶栓藥物，同其它的溶栓藥物比較，葡激酶具有溶栓活力強(qiáng)，溶栓作用專一，免疫原性低以及過敏反應(yīng)少等多種特點，而且當(dāng)血栓被溶解后，葡激酶對纖溶酶原的激活作用會受到人體內(nèi)α 2抗纖溶酶的抑制，避免了出血反應(yīng)。并且N端缺失10個氨基酸的Δ SAK的抗血栓活性與SAK的活性相似。目前，治療腫瘤及血栓的藥物都為單一功能的藥物，對于腫瘤并發(fā)血栓尚無特效藥。因此，構(gòu)建出一種既抗腫瘤又溶栓的雙功能嵌合蛋白，對于治療癌癥并發(fā)血栓的病例具有重要意義。雖然也有既抗腫瘤又溶栓的嵌合蛋白，但是其分子量高達(dá)44kD，而且具有較高的免疫原性，因此，降低分子量、降低免疫原性成為當(dāng)前亟待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是構(gòu)建一種分子量低，免疫原性低的抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案一種低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，由序列表SEQ ID N0. 3所示的Δ Sak氨基酸序列和序列表SEQ ID Ν0. 4所示的 Δ SEC2氨基酸序列構(gòu)成，將Δ SEC2和Δ Sak連接在一起得到氨基酸序列如SEQ ID NO. 11 所示的嵌合蛋白Δ Mk-Δ SEC2，或氨基酸序列如SEQ ID Ν0. 12所示的嵌合蛋白Δ SEC2 -ASak。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白 Δ Sak- Δ SEC2的方法如下
1)構(gòu)建載體pET 2Sa~ Asak- linker-Δ sec2, Asak- /i/^er-」secS 的 DNA 序列如 SEQ ID NO. 5 所示；
2)將得到的載體pET28a~Δ saA-^secJ經(jīng)PCR去除」仰左禾口 Zl1SecJ之間的 linker，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Δ Δ SEC2的質(zhì)粒pEI^8a_」仰左-」sec么Zl sak-Δ sec2 的DNA序列如SEQ ID NO. 7所示；
3)將質(zhì)粒pEI^8a-」sak-Δ mcJ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿
菌；
4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時，在30°C條件下用1 mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時，之后離心收集菌體細(xì)胞；
5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率200-300W;處理時間6X9 sec,9 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；
6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白 His- Δ Sak- Δ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；
7)嵌合蛋白His-Δ Sak- Δ SEC2經(jīng)過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白A&ik-ASEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)上述的低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白Δ SEC2-Δ Sak的方法如下
1)構(gòu)建載體pET 28a-/isec^- linker-Δ sak，Δ sec2~ /i/^er-」sa左的 DNA 序列如 SEQ ID NO. 6 所示；
2)將得到的載體pET28a-Zl sec2~ linker-Δ sak經(jīng)PCR去除」sec2和」sak之間的 linker,構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白 Δ SEC2- Δ Sak 的質(zhì)粒 pEI^8a_」sec2~A sak, Δ sec2~A sak 的DNA序列如SEQ ID NO. 8所示；
3)將質(zhì)粒pEI^8a-」sec2-Δ sak轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿
菌；
4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時，在 30°C條件下用1 mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時，之后離心收集菌體細(xì)胞；
5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率200-300W;處理時間6X9 sec,9 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；
6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白 His-ASEC2-ASak，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 104所示；
7)嵌合蛋白His-Δ SEC2- Δ Sak經(jīng)過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白ASEC2-A&ik，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 12所示。本發(fā)明的嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應(yīng)用。以本發(fā)明的嵌合蛋白A&ik_ASEC2或嵌合蛋白Δ SEC2-Δ Sak為有效成分，添加藥學(xué)上常規(guī)的輔料，可制備具有抗腫瘤溶栓雙效的各種藥物制劑。本發(fā)明，基于SEC2的抑瘤活性和SAK的溶栓活性，且為了降低雙功能蛋白的分子量以及免疫原性，將N端缺失10個氨基酸的葡激酶Δ Sak及N、C端分別缺失10、132 個氨基酸的腸毒素ASEC2嵌合在一起，并使兩者之間無任何連接肽，所構(gòu)建的嵌合蛋白 Δ SEC2-A Sak和Δ Sak-ASEC2分子量大大降低，去掉了具有較高免疫原性的氨基酸序列， 解決了嵌合蛋白分子量大和高免疫原性的問題，同時抗腫瘤和溶栓的功能得以保留。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明所構(gòu)建的抗腫瘤溶栓雙效蛋白既保留了 Sak的溶栓活性又不減SEC2的抗腫瘤功能，并且分子量小，只有^kD,易于靜脈注射給藥，對于降低毒副作用具有實踐意義，是理想的溶栓抗癌雙效生物制劑。本發(fā)明采用基因工程方法，通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和M親和層析純化法，成功獲得了高蛋白純度的嵌合蛋白，并經(jīng)體外溶栓實驗和體外抑瘤實驗證明了，本發(fā)明的嵌合蛋白分別保留了 Sak的溶血栓活性和SEC2 的抗腫瘤活性，成功實現(xiàn)了低免疫原性的溶栓抗癌雙效生物制劑的構(gòu)建。
具體實施例方式
實施例1低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白Δ Sak- Δ SEC2的制備 (一)帶有嵌合基因」sak-Δ sec2的表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建
I) Asak的PCR擴(kuò)增，」sak基因序列如SEQ ID NO. 1所示，」sak通過Xhol 連接在pET28a上，構(gòu)建質(zhì)粒pEI^8a_」sak,以質(zhì)粒pEI^8a_」sak為模板，通過設(shè)計特定引物
上游5’ -ATTAATCATATGGACGACGACGACAAAAAAGGCGATGACGCGAGT-3’ 下游5’ -CGGGCCGAATTCTTTCTTTTCTATAACAAC-3，
利用PCR方法擴(kuò)增」sak,并使」sak編碼氨基酸上游具有腸激酶識別為點，」sak兩端分別帶有限制性酶切位點Nde\和。2) pET28a-」sak - linker-Δ sec2 的構(gòu)建」sec2 基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示，」sec2通過Xhol連接在pET 28a上，構(gòu)建質(zhì)粒pEI^8a_」sec2, Δ sak經(jīng)MfeI 和&0RI雙酶切后插入pET28a-」sec2中Zl sec2上游的MfeI和位點，T4連接酶 16°C連接過夜，得到連接反應(yīng)液。將連接反應(yīng)液加入到預(yù)先通過氯化鈣法制備的大腸桿菌 BL21感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)化學(xué)方法轉(zhuǎn)化(42°C水浴熱激)，之后，將菌液涂布于含有Kan抗性的 LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜后挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)MfeI和雙酶切驗證， 確定」^aA是否被插入到pET ZSa-Zl1SecJ中，是否構(gòu)建pET 28a~AsaA - linker-Δ sec2 (由于」sak和」^ecJ 是通過&0RI酶切位點連接，所以在」sak和」mcJ 之間有一個序列為GAATTC (即feoRI酶切位點)的linker)ο3)pET28a-」sak -Δ sec2 的構(gòu)建,將 pET28a_」sak- linker-Δ sec2 經(jīng) PCR 去除 」sak和」之間的linker (GAATTC),對PCR產(chǎn)物進(jìn)行末端平滑化及5’磷酸化處理， 高效連接酶進(jìn)行自身連接(環(huán)化反應(yīng))，然后化學(xué)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，將菌液涂布于含有Kan抗性的LB平板上，37°C培養(yǎng)過夜后挑取陽性克隆，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒經(jīng)feoRI 單酶切驗證，確定linker是否被去掉。再由上海生工公司(Sangon，China)對得到的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序確認(rèn)。試驗結(jié)果
經(jīng)酶切驗證和測序分析綜合表明，表達(dá)嵌合蛋白His-A&ik-ASEC2的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。獲得帶有重組質(zhì)粒pET28a_」mi -ZMCJ 的重組大腸桿菌。(二)His- Δ Sak- Δ SEC2的誘導(dǎo)表達(dá)純化及Δ Sak- Δ SEC2的獲得 UHis-ASak-ASEC2的誘導(dǎo)表達(dá)
將帶有重組質(zhì)粒pEI^8a_」sak -Δ sec2的重組大腸桿菌接種于含有Kan (卡那霉素， Kanamycine, Kan) (40 μδ/πι1)的10 ml LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 16小時，次日按2%的接種量，將培養(yǎng)好的菌液接種到含有Kan (40 Pg/ml)的200 ml LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時，用1 mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。為了避免在表達(dá)過程中出現(xiàn)包涵體，本發(fā)明選擇在菌體生長不是很活躍的30°C作為誘導(dǎo)溫度，誘導(dǎo)4 一 5 h。2、His- Δ Sak- Δ SEC2 的純化
經(jīng)過4個小時的誘導(dǎo)表達(dá)后，通過8000 rpm離心5分鐘收集菌體細(xì)胞。零下20°C過夜凍存菌體，次日取出，室溫放置15分鐘。用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率200-300 W ；處理時間6X9sec，9sec間隔。處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液。將上清液低速上樣于Ni-NTA親和層析柱，平衡緩沖液(30 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl pH7. 6)平衡至基線，洗脫緩沖液(30 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 50-300 mM 咪唑 PH7. 6)梯度洗脫，收集洗脫峰，濃縮除鹽，SDS-PAGE分析純度。得到帶有組氨酸標(biāo)簽的重組 His-ASak-ASEC2。本發(fā)明中，載體質(zhì)粒pET28a(+)編碼了三個用于純化的標(biāo)簽，C端6XHistag， t7tag和N端6XHistag，本發(fā)明選擇了 N端6XHistag。利用Ni離子特異性螯合His的特點，實現(xiàn)含有6 XHistag的Δ Sak- Δ SEC2與雜蛋白的分離，再通過咪唑競爭6 XHistag與 Ni離子的結(jié)合實現(xiàn)His-A&ik-ASEC2的洗脫。3、Δ Sak- Δ SEC2 的制備
His- Δ Sak- Δ SEC2經(jīng)過重組牛腸激酶切割后的混合物再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白ASak-ASEC20(三)ΔSak- Δ SEC2 的 SDS-PAGE 驗證和 western blot 分析
Δ &ik-Δ SEC2經(jīng)SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)印至NC膜上，經(jīng)5% BSA封閉，TBST漂洗后，加入兔抗SEC2抗體，37°C反應(yīng)1 h;TBST漂洗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，37°C 1 h，TBST 漂洗3次，DAB染色。結(jié)果顯示經(jīng)SDS-PAGE驗證，成功獲得嵌合蛋白Δ Sak- Δ SEC2，Δ Sak- Δ SEC2 蛋白能與兔抗SEC抗體結(jié)合，在相對分子質(zhì)量約^kD處可見特異性反應(yīng)條帶，表明 Δ Sak- Δ SEC2蛋白具有良好的反應(yīng)原性，Δ SEC2保留了與SEC2超抗原相關(guān)的抗原決定簇。 Δ Sak- Δ SEC2氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。(四)Δ Sak- Δ SEC2體外溶栓活性分析
Sak以及A&ik_ASEC2的溶栓活性是相比尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品相比測得的。具體實施如下 稱取125 mg瓊脂糖(電泳級)，加入23 ml生理鹽水，煮沸溶解，60°C水浴平衡，加凝血酶14 μ (100 IU/ml)，人纖溶酶原沘0 μ 1 (0.5 mg/ml)，人纖維蛋白原2. 2 ml (6 mg/ ml)，倒入80 mm平板內(nèi)冷卻，制成人纖維蛋白平板，用前于4°C放置半個小時。在形成的纖維蛋白平板內(nèi)打孔(直徑2 mm)，每孔點樣10 μ ，水平放置于37°C孵箱M h。標(biāo)準(zhǔn)品尿激酶(1280IU)稀釋成 640 IU,320 IUU60 IU,80 IU,40 IU,20 IUUO IU制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。點樣平板經(jīng)過縱橫兩次去溶圈直徑，以各個稀釋度的活性的對數(shù)(X)為橫坐標(biāo)，以溶圈直徑的平均數(shù)(四次量取的數(shù)值)的對數(shù)為縱坐標(biāo)(y)，利用統(tǒng)計學(xué)軟件中的回歸分析方法作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得尸a+bx中的a和b及線形回歸系數(shù)r值，根據(jù)樣品的溶圈直徑可求得樣品的活性。實驗結(jié)果
根據(jù)尿激酶標(biāo)準(zhǔn)曲線側(cè)得Mk的溶栓活性為7. 5 X IO3 IU/mg, Δ Sak- Δ SEC2為 7. 5 X IO3 IU/mg, Δ Sak- Δ SEC2 保留了 Sak 的溶栓活性。(五)ΔSak- Δ SEC2鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗
取4-6周齡的小鼠，雄性，體重18-22 g。脫頸處死小鼠，75%酒精浸泡消毒5 min。無菌條件下剖開小鼠，腹腔取脾，研磨過100目篩網(wǎng)，々-Hank’ s液沖洗，收集分離的脾細(xì)胞懸液。1000 r/min常溫離心5 min，棄上清；加紅細(xì)胞裂解液10 ml，混勻脾細(xì)胞，靜止4_5 min，使紅細(xì)胞完全破碎。1000 r/min常溫離心5 min，棄上清，去除紅細(xì)胞?！?Hank’ s液洗2-3遍，用2 ml RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，用血球計數(shù)板計數(shù)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2X IO6個/ml。用RPMI1640培養(yǎng)液稀釋供試品，每孔100 μ 1，加入到96 孔板中，以PHA-P為陽性對照，以BSA為陰性對照孔，以RPMI1640培養(yǎng)液為空白對照孔，設(shè)6 個復(fù)孔，向各孔中分別加入100 μ 1脾淋巴細(xì)胞懸液。待脾淋巴細(xì)胞貼壁后，加樣。每個孔加100 μ 樣品。將加好樣的96孔板置37 0C ,5% CO2孵箱中培養(yǎng)72 h。終止培養(yǎng)，3000 rpm離心10 min，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加120 μ 1 二甲基亞砜(DMS0)，振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶，置酶標(biāo)儀上測定各孔在波長為570 nm處的吸光值。
對.Rsfi (ODd:>
權(quán)利要求
1.低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白，其特征在于所述的嵌合蛋白為氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示的嵌合蛋白A&ik-ASEC2，或氨基酸序列如SEQ ID NO. 12所示的嵌合蛋白 ASEC2 - ASak。
2.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白A&ik_ASEC2的方法，其特征在于步驟如下1)構(gòu)建載體pET 28a-Zl sak~ linker-Δ sec2, Asak- yi/^er_」secS 的 DNA 序列如 SEQ ID NO. 5 所示；2)將得到的載體pET28a-Zl sak~ linker-Δ sec2經(jīng) PCR去除」sak和」sec2之間的linker，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Δ Δ SEC2的質(zhì)粒pEI^8a_」仰左-Zl sec2, Asak -Δ sec2 的 DNA 序列如 SEQ ID NO. 7 所示；3)將質(zhì)粒pEI^8a-」sak-Δ mcJ 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時，在 30°C條件下用1 mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時，之后離心收集菌體細(xì)胞；5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率200-300W;處理時間6X9 sec,9 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白 His- Δ Sak- Δ SEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 9所示；7)嵌合蛋白His-Δ Sak- Δ SEC2經(jīng)過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白A&ik-ASEC2，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示。
3.一種利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)權(quán)利要求1所述的低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白ASEC2 - ASak的方法，其特征在于步驟如下1)構(gòu)建載體pET 2^~Asec2~ linker-Δ sak，Δ sec2~ /i/^er-」sa左的 DNA 序列如 SEQ ID NO. 6 所示；2)將得到的載體pET28a-Zl sec2~ linker-Δ sak經(jīng) PCR去除」sec2和」sak之間的linker，構(gòu)建出表達(dá)嵌合蛋白Δ SEC2-Δ &ik的質(zhì)粒pEI^8a_」^secJ -Zl sak, Δ sec2 -Δ sak的DNA序列如SEQ ID NO. 8所示；3)將質(zhì)粒pEI^8a-」sec2-Δ sak轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組大腸桿菌；4)將重組大腸桿菌接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，當(dāng)菌液吸光度值達(dá)到0.6時，在 30°C條件下用1 mM IPTG誘導(dǎo)4 5小時，之后離心收集菌體細(xì)胞；5)用超聲波破碎菌體細(xì)胞，功率200-300W;處理時間6X9 sec,9 sec間隔；處理后，6000 rpm離心10 min，去除不溶性細(xì)胞碎片，收集上清液；6)將上清液過Ni-NTA親和層析柱，經(jīng)梯度洗脫和濃縮除鹽，得到嵌合蛋白 His-ASEC2-ASak，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；7)嵌合蛋白His-Δ SEC2- Δ Sak經(jīng)過腸激酶切割，再次過Ni-NTA親和層析柱，得到嵌合蛋白ASEC2-A&ik，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 12所示。
4.權(quán)利要求1所述的低免疫原性嵌合蛋白在制備抗腫瘤溶栓藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及低免疫原性抗腫瘤溶栓雙效嵌合蛋白及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明嵌合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.11或如SEQIDNO.12所示。本發(fā)明的嵌合蛋白使N端缺失10個氨基酸的金葡球菌激酶ΔSak及N、C端分別缺失10、132個氨基酸的金葡球菌腸毒素ΔSEC2嵌合在一起，并使兩者之間無任何連接肽，所構(gòu)建的嵌合蛋白ΔSEC2-ΔSak和ΔSak-ΔSEC2分子量大大降低，去掉了具有較高免疫原性的氨基酸序列，解決了嵌合蛋白分子量大和高免疫原性的問題，同時抗腫瘤和溶栓的功能得以保留。
文檔編號C07K19/00GK102492043SQ201110441070
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者崔小進(jìn), 林家?guī)? 胡風(fēng)慶 申請人:遼寧大學(xué)