專利名稱：檢測卵巢癌腫瘤標志物he4蛋白的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，尤其涉及一種使用具有 高敏感性和特異性的時間分辨熒光免疫檢測技術實時監(jiān)測血液樣品中HE4蛋白的方法。
背景技術：
卵巢惡性腫瘤(卵巢癌)由于發(fā)病隱匿，被形容為最致命的癌癥之一。卵巢癌的 早期癥狀很不明顯，初期癥狀只是腹部疼痛或膨脹、腸胃消化不良，而未引起足夠的重視。 僅2004年，美國約有24，000名婦女患卵巢癌，而有14，000名婦女死于卵巢癌。全世界范 圍內，估計每年有190，000新增病例，有114，000例死亡病例。如果能在早期診斷將會提高治愈率，不幸的是，卵巢癌患者發(fā)現時往往已經到了 晚期，四例卵巢癌病人中三例在晚期才被診斷，延誤了病情。傳統的治療方法，包括手術、化 學藥物治療、放射治療及綜合治療等，仍難以治愈卵巢癌，其存活率小于20%，并容易舊病 復發(fā)。因此，提高卵巢癌的早期診斷水平、監(jiān)測其治療效果是新近婦科腫瘤研究關注的熱點。目前使用CA125標志物的檢測方法能夠診斷出末期的卵巢癌，但不能夠非常有效 地診斷出初期的卵巢癌，且有時還會呈現“誤導性”的結果。CA125是一種腫瘤表面抗原。 上皮組織產生病變，體內就會產生CA125，因此上皮組織的癌癥一般會使血液中的CA125上 升。但與其他多數腫瘤標記物一樣，CA125沒有百分百的“標準值”，即不是只有癌癥才會使 CA125上升，子宮內膜異位癥、骨盆腔發(fā)炎時，也會導致CA125上升，所以利用CA125來診斷 是否患有癌癥，并不是那么準確。此外，不是每一種卵巢癌都是屬于上皮細胞腫瘤，有些是 胚胎組織或腺體細胞的腫瘤，因此CA125不會出現變化。使用CA125標志物的檢測方法不 可避免的存在一些缺陷。因此，迫切需要一個特異性和敏感性較強的標志物來提高卵巢癌 的診斷水平。現今，將基因與蛋白質組技術相結合，已篩選出卵巢癌HE4差異蛋白，并且證明 HE4是WFDC2基因的產物。HE4這一新的標志物在良性腫瘤及正常組織中含量極低，但在卵 巢癌中含量很高?；蛐酒夹g也顯示，HE4與MSLN在卵巢癌中高表達，更重要的是，HE4 在19例CA125 > 30U/ml的良性腫瘤組織中不增殖。雙盲實驗的結果也顯示，HE4在卵巢 癌方面的診斷優(yōu)于CA125。更多的實驗可以證明HE4是一個非常有診斷意義的腫瘤標記物， 也有報道稱HE4在卵巢癌中高表達，而在肺癌、肝癌、腎癌、甲狀腺癌中未見表達。盡管有報 道稱HE4基因也表達于正常組織中，這暗示HE4蛋白并非腫瘤特異性蛋白，但是，能作為新 的標記物來提高卵巢癌診斷的敏感性。目前世界上對于卵巢癌的診斷用的最多的還是檢測CA125，已建立的方法主要包 括酶聯免疫吸附法(ELISA)，免疫熒光法(FAT)和化學發(fā)光(CLIA)。其中，ELISA方法和 FAT方法由于受其靈敏度和特異性的限制，無論是檢測抗原還是抗體，都很難滿足早期診斷 的需要。時間分辨熒光檢測(TR-FIA)儀(DELFIA1235，Wallac)檢測熒光值(CPS)。TR-FIA技術是利用能夠發(fā)射長壽命熒光的熒光化合物作為示蹤物，標記被檢分子(配體或配基) 并形成絡合物例如鑭系金屬離子絡合物，通過免疫學反應即可在具有較短壽命的本底熒光 消失后對被標記物發(fā)出的熒光信號進行時間分辨檢測。其中被標記物可以是參與反應體系 (如抗原抗體反應、核酸探針雜交、生物素親和素反應以及靶細胞對效應細胞的殺傷反應 等)的任何一種配體或配基。待反應體系形成并發(fā)生配體與其配基的反應后，可使用時間 分辨熒光免疫方法檢測反應結合物的熒光強度。基于對反應結合物的熒光強度與已知量分 析物所產生的相對熒光強度的比較，即可利用標準曲線確定反應體系中分析物的濃度。在常規(guī)熒光測定中，由于樣品檢測體系中含有多種熒光成分(例如來自樣品中的 膠體顆粒和溶劑分子引起的散射光，以及血清中蛋白質和其他化合物發(fā)出的非特異性熒 光)，導致本底熒光過大，從而限制了熒光分析方法的廣泛使用。與常規(guī)免疫熒光方法不同， 時間分辨熒光免疫檢測技術(TR-FIA)則是基于鑭系金屬元素(特別是銪)能夠發(fā)射具有 較長衰變期(約為傳統熒光的103-106倍)和較大Mokes位移(為普通熒光素Mokes位 移的10倍以上)的特殊熒光(發(fā)射波波長為615nm)這一性質，以其標記構成檢測體系的 配體或配基。因此，可以幾乎完全避免體系中與某些類型的蛋白質有關的激發(fā)波(波長為 340nm)和瞬時本底熒光(波長為350-600nm)的干擾，從而可借助時間延遲和波長分辨，大 大提高檢測的準確性和靈敏度。與目前普遍使用的放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA) 及化學發(fā)光免疫分析和電化學發(fā)光免疫分析(ECLIA)相比，TR-FIA方法具有靈敏度高、示 蹤物穩(wěn)定、不受樣品自然熒光干擾、無放射性污染等多方面的優(yōu)點，是各種生物醫(yī)學研究和 臨床超微量生化檢驗手段中的一種優(yōu)選方法。該技術已在病原體檢測、內分泌檢查、腫瘤檢 查、遺傳學檢查、血液學檢測和細胞學檢查等多方面得到普遍應用。發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供了一種針對卵巢癌的更為高效率、 高敏感性的檢測方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現的一種檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，包括以下步驟(1)HE4基因的獲取和克?。?2)重組表達質粒的構建及鑒定；(3)表達產物分析；(4)抗HE4蛋白抗體的制備；(5)抗HE4蛋白抗體的純化和Eu3+標記；(6)使用本發(fā)明的抗HE4蛋白抗體，以雙抗體夾心時間分辨熒光檢測技術 (TR-FIA)檢測血液樣品中HE4蛋白的含量。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了抗HE4蛋白抗體，再結合已知的時間分辨熒 光檢測技術，可以在卵巢癌發(fā)生的早期從極微量臨床樣品中準確地檢測到HE4的存在。因 此，基于TR-FIA技術的高度靈敏度、特異性和選擇性，本發(fā)明建立的卵巢癌標志物HE4蛋白 檢測方法為實現卵巢癌的早期診斷提供了重要的臨床判斷依據。本發(fā)明建立了一套行之有 效的可以在早期診斷卵巢癌的檢測方法，為早期卵巢癌的診斷提供了一種高靈敏度、高特 異性的檢測手段。


圖1是經RT-PCR擴增HE4基因的結果。其中，泳道1是分子量標志；泳道2是PCR 產物；圖2是T-A克隆重組子的酶切鑒定。其中，泳道2-4是T-A重組載體的EcoRI+Xhol I酶切片段；泳道1是分子量標志；圖3顯示重組蛋白的SDS-PAGE分析。其中，泳道5是蛋白質分子量標準；泳道1_2 是PGEX-HE4/BL21在IPTG誘導前后工程菌全細胞(1，誘導后；2，誘導前)；3 4含空載體 PGEX-4T-1的受體菌全細胞(4，誘導前；5，誘導后)；圖4是重組蛋白的ffestern-blot分析。其中，泳道1是蛋白質分子量標準；泳道2 是經誘導的HE4蛋白的Western blot分析，泳道3是經誘導的PGEX-4T-1的Western blot 分析；圖5是抗HE4蛋白單克隆抗體的亞型分析結果；圖6是純化的抗HE4蛋白的單克隆抗體的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)圖譜 其中A是6B8，B是10D2 ；圖7是按本發(fā)明方法檢測HE4蛋白得到的標準曲線。
具體實施例方式將基因與蛋白質組技術相結合，成功篩選出卵巢癌HE4差異蛋白，并且證明HE4是 WFDC2基因的產物。HE4這一新的標志物在良性腫瘤及正常組織中含量極低，但在卵巢癌中 含量很高。基因芯片技術也顯示，HE4與MSLN在卵巢癌中高表達，更重要的是，HE4在19例 CA125 > 30U/ml的良性腫瘤組織中不增殖。通過設計針對HE4蛋白的高效檢測方法，可以 更特異、更敏感地檢測早期卵巢癌的發(fā)病情況，從而可以有效提高初期卵巢癌的檢測及診 斷水平。本發(fā)明建立的卵巢癌標志物HE4蛋白檢測方法，是通過以下步驟實現的1.獲取并克隆HE4基因卵巢癌細胞在含10% (M/V)的小牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞數達到 1 X 107，用TRIzol試劑提取總RNA，按Genebank中HE4的cDNA編碼區(qū)序列設計引物。上游引物Pl :5，ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC，(SEQ ID NO 1)下游引物P2 :5，ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC，(SEQ ID NO:2)以提取的適量 總RNA為模板進行反轉錄，然后PCR擴增目的條帶，電泳顯示在約400bp處有一特異擴增條 帶，與報道的Genebank中的序列(Accession number AY212888)大小一致(圖1)。2.構建并鑒定重組表達質粒獲得目的基因HE4后，將HE4基因克隆至T載體中，然后進行DNA測序，確證序列 的正確性。PCR產物經酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。將PCR產物與PMD18T載體 置16°C水浴連接過夜。將連接混合物轉化入感受態(tài)細胞。被轉化的細胞經37°C培養(yǎng)過夜挑 取9個單菌落，分別培養(yǎng)后，以提取的質粒DNA為酶消化的底物，用EcoRI、Xhol I雙酶切， 消化后的片段經DNA電泳產生一條約400bp的片段(圖2)。將酶切產物克隆至PGEX-4T-1 表達載體中，命名為PGEX-HE4重組載體。3.表達產物分析
將陽性克隆株活化后，加入IPTG 30°C誘導培養(yǎng)4小時收菌。經SDS-PAGE檢測， 可見重組子表達產物顯示為一條分子量約為39KDa的新的蛋白條帶(圖幻。將重組蛋白 純化后作為抗原并使用鼠抗HE4蛋白血清對表達產物進行ELISA分析，結果可見鼠抗HE4 蛋白血清能夠與PGEX-HE4表達產物反應，而與BL21和pGEX_4T_l轉化菌的表達產物無反 應。然后將工程菌的表達產物電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清為抗體進行 Western印跡分析，結果顯示在39KDa蛋白處出現一特異性反應條帶，而pGEX_4T_l轉化的 細菌則未見相應的帶(圖4)。4.制備抗HE4蛋白的抗體使用19-21周齡的Balb/C小鼠作為被免疫動物。首先用純化的重組HE4蛋白 75 μ g加等體積完全弗氏佐劑乳化后，皮下多點注射進行基礎免疫。再進行兩次加強免疫。 末次免疫后，從動物的尾靜脈采血并測試抗體效價。必要時，可于處死動物分離脾細胞前3 天，再加強免疫一次。血清抗體效價達到足夠的水平后，分離脾細胞，按適當比例將被免疫 小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞混合并在PEG-4000作用下融合之。適當稀釋純化的重組HE4蛋白后，用所得稀釋液包被微量滴定板，然后以間接 ELISA法檢測雜交瘤陽性克隆，并用有限稀釋法對檢出的陽性克隆進行亞克隆。經四次亞克 隆后，共篩選出15株分泌抗HE4蛋白的雜交瘤細胞株。經配對實驗得到兩株可與HE4蛋白 發(fā)生反應，且可與不同結合位點結合的單克隆抗體(6B8和10D2)。ELISA試驗表明，在體外 培養(yǎng)條件下，得自雜交瘤培養(yǎng)物上清的抗體6B8和10D2的效價分別為1 512、1 256。 在體內培養(yǎng)條件下，得自動物腹水液的抗體效價為分別1 25600、1 12800。進一步的抗 體分型實驗結果顯示，6B8和10D2雜交瘤細胞分泌的抗體類型均為IgGl。5.純化并Eu3+標記抗HE4蛋白抗體純化腹腔內接種雜交瘤(細胞株10擬)后得到的小鼠腹水液，然后充分透析。最 后將其中的蛋白質濃度調整到5.0mg/ml。SDS-PAGE分析可見，純化后的抗體在電泳凝膠上 顯示為兩條帶(輕鏈和重鏈，見附圖6)。ELISA檢測結果表明抗體效價與純化前基本相同。向111^(20(^1^)單抗1002溶液中加入0.511^ DTTA并調整pH值至8. 5，然后于4°C 保溫4小時。保溫后將溶液對生理鹽水透析6小時以上，然后加入EuCl3溶液(33mmol/L， 3(^0，并于41下繼續(xù)保溫10小時，以標記抗體蛋白質。標記反應完成后，用Superdex 200柱純化所得到的反應溶液，并用含0. 9% (MA)NaCl的Tris-HCl緩沖液(50mmol/L，pH 7. 6)洗脫液洗脫。參照Eu3+標準品，計算標記產物中平均每個抗體蛋白分子所結合的Eu3+ 離子數目。過濾標記產物后，并加入終濃度為0. 1% (M/V)胎牛血清白蛋白(BSA)，于-20°C 或-70°C保存?zhèn)溆谩?.使用本發(fā)明的抗HE4蛋白抗體，以雙抗體夾心時間分辨熒光檢測技術(TR-FIA) 檢測血液樣品中HE4蛋白的含量。實驗采用標準的雙抗體夾心法完成。其中所使用的參考標準品是分別有以下濃 度的冊4蛋白的溶液0、0.2、1、5、25和150叫/!111。所使用的洗滌液是含有0. 1 % (V/V) Tween-20 和 0. 9% NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液(50mmol/L，ρΗ7· 6)。用 Na2C03/NaHC03 緩沖溶 液將如上方法純化的抗HE4蛋白抗體6B8 (作為第一抗體)蛋白濃度稀釋至5 μ g/ml，并按 每孔200μ 1的體積加至96孔微量滴定板的各孔中，然后4°C孵育M小時。孵育后，用洗滌 液沖洗3次，并于每孔內各加入含0. 1% Tween-20的1% (M/V)FBSA 250 μ 1。37°C封閉孵育8小時后，再次用洗滌液洗3次，然后凍干即制成單克隆抗體包被的微量滴定板。于4°C 或-20°C下保存?zhèn)溆?。實際檢測時，按順序分別向抗體預包被的小孔內加入陰性和陽性對照樣品、參考 標準品及待檢樣本各100 μ 1。用薄膜貼封后，緩慢振蕩下室溫孵育1小時。孵育后，用洗 滌液洗滌小孔4次并風干，然后每孔內再加入上述銪標記的抗ΗΕ4蛋白抗體10D2(100y 1) (作為第二抗體)。用薄膜貼封各小孔，并在緩慢振搖下室溫孵育1小時。孵育后再用洗滌 液洗6次并風干，每孔各加入增強液100 μ 1，密封和緩慢振蕩條件下繼續(xù)室溫孵育5分鐘。 然后用時間分辨熒光檢測儀(DELFIA1235，Wallac)檢測熒光值(CPS)。本發(fā)明的一個目的是提供一種檢測生物學體液樣品中可能存在的卵巢癌標記物 HE4抗原的方法，該方法包括(1)提供可與卵巢癌標記物HE4抗原結合的第一抗體并用所說的抗體包被固相載 體；(2)向步驟⑴的被包被的固相內加入待檢生物學體液樣品和對照樣品并于適當 的條件下保溫；(3)反應后充分洗滌所說的固相并加入適當量鑭系金屬離子標記的、可與HE4蛋 白結合的第二抗體并再次保溫；(4)反應后充分洗滌所說的固相并檢測與第二抗體結合的鑭系金屬離子發(fā)射的熒 光值；(5)將所測得的熒光值與平行測得的已知量標準品的熒光相比較以確定樣品中 HE4蛋白的存在及其相對量。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，所說的第一抗體和第二抗體是可分別與HE4蛋 白的不同抗原表位結合的單克隆抗體。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中所說的鑭系金屬離子是銪。根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中所說的生物學體液樣品選自血清。根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中所說的固相是具有足夠的免疫球蛋白吸 附能力的微量滴定板。根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，其中所說的檢測是使用時間分辨熒光免疫技 術完成的。本發(fā)明的另一個目的是提供用于本發(fā)明的檢測方法的抗HE4蛋白的抗體，特征在 于所說的抗體可與HE4蛋白的特定抗原決定基區(qū)域結合，并可與鑭系金屬離子形成絡合 物。根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，如上限定的抗體包括可與HE4蛋白的不同抗 原決定簇特異性結合的第一和第二抗體。根據本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案，如上限定的抗體是單克隆抗體。本發(fā)明的再一個目的是提供用于檢測生物學血清樣品中HE4蛋白的時間分辨熒 光免疫檢測方法的試劑盒，其中包括可同時與固相和HE4蛋白結合的第一抗體，以及可與 HE4蛋白結合并且偶聯了鑭系金屬離子的第二抗體。使用本發(fā)明提供的抗HE4蛋白抗體和已知的時間分辨熒光檢測技術，可以在卵巢 癌發(fā)生的早期從極微量臨床樣品中準確地檢測到HE4的存在。因此，基于TR-FIA技術的高度靈敏度、特異性和選擇性，本發(fā)明建立的卵巢癌標志物HE4蛋白檢測方法為實現卵巢癌 的早期診斷提供了重要的臨床判斷依據。在實驗室研究的基礎上，我們使用本發(fā)明的方法檢測了包括89例已確診病例、56 例疑似病例和93例正常人群的共238份臨床血清樣品。結果顯示，89例臨床病人的樣品 中，有64例確定為HE4蛋白陽性(陽性檢出率為71. 9% ) ；56例疑似病人中，有18例檢測 為HE4蛋白陽性(陽性檢出率為32. 1%) ；93例健康自愿者的樣品則全部為HE4蛋白陰性。 如果以所有89例臨床確診病例作為真陽性病例，并將所有93例正常人定為真陰性，由此可 以計算出本發(fā)明方法的靈敏度為71.9%，特異性為100%，而且檢測的靈敏度很高(可檢測 的HE4蛋白濃度下限在0. 2ng/ml以下)。因此，本發(fā)明的方法足可以為卵巢癌的早期診斷 提供可靠的臨床檢驗數據。另外，還應指出的是，雖然用于本發(fā)明方法和試劑盒的第二抗體通常是與預先標 記或結合了鑭系金屬離子(例如銪)的，但第二抗體也可以是與所說的鑭系金屬離子分離 并在檢測樣品時臨時偶聯在一起的。實施例實施例1本實施例舉例描述本發(fā)明的HE4蛋白檢測方法中所涉及的材料及其制備。(1)HE4基因的獲取和克隆卵巢癌細胞在含10%的小牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞數達到1X107，用 TRIzol試劑提取總RNA，按Genebank中HE4的cDNA編碼區(qū)序列設計引物。上游引物Pl :5，ACTGAGAATTCATGCCTGCTTGTCGCC，(SEQ ID NO 1)下游引物P2 :5，ATGCTCTCGAGTCAGAAATTGGGAGTGAC，(SEQ ID NO 2)反應體系 50μ 1 :RNase Free dH20 27 μ1、Total RNA 2μ IUOXone step RNA PCR buffer 5 μ UdNTP Mixture 1 μ 1、MgCl2 10 μ URNase inhibitor 1 μ UAMV RTase XL 1 μ l.AMV-Optimized Taq 1 μ 1、上游引物、下游引物各1 μ 1。混勻，在50°C RT反應15 分鐘，再在94°C中變性anin滅活RTase。按下列條件于進行PCR，94°C變性Imin，62°C退火 lmin，72°C延伸lmin，共進行35次循環(huán)，最后再于72°C延伸lOmin。擴增產物用瓊脂 糖凝膠電泳檢測。電泳顯示在約400bp處有一特異擴增條帶，與報道的Genebank中的序列 (Accession number AY212888) 一致(圖 1)。(2)重組表達質粒的構建及鑒定獲得目的基因HE4后，在構建重組表達載體前，將HE4基因克隆至T載體中，然后 進行DNA測序，確證序列的正確性。具體方法如下PCR產物經酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。按照PMD18T試劑盒說明書，將 PCR產物與PMD18T載體置16°C水浴連接過夜。取30 μ 1連接混合物轉化TGl感受態(tài)細胞。 被轉化的細胞經37°C培養(yǎng)過夜挑取9個單菌落，分別培養(yǎng)后，以提取的質粒DNA作為酶消化 的底物，用EcoR I.Xhol I雙酶切，消化后的片段經DNA電泳產生一條約400bp的片段(圖 2)。將酶切產物克隆至PGEX-4T-1表達載體中，命名為pGEX-HE4重組載體。(3)表達產物分析將陽性克隆株接種于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中保溫過夜，次日按(V/ V)比例轉入相應的新鮮培養(yǎng)液中。當培養(yǎng)物的OD6tltl值達到0.8時，加入IPTG至終濃度為1. 0mmOl/L，3(TC誘導培養(yǎng)4小時收菌。經SDS-PAGE檢測，可見重組子表達產物顯示為 一條分子量約為39KDa的新的蛋白條帶(圖3)。用制備性電泳法純化的重組蛋白為抗原 并使用鼠抗HE4蛋白血清對表達產物進行ELISA分析，結果可見鼠抗HE4蛋白血清能夠與 PGEX-HE4表達產物反應，而與BL21和pGEX_4T_l轉化菌的表達產物無反應。然后將工程菌 的表達產物電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清為抗體進行Western印跡分析， 結果顯示在39KDa蛋白處出現一特異性反應條帶，而pGEX-4T-l轉化的細菌則未見相應的 帶(圖4)。(4)抗HE4蛋白抗體的制備使用19-21周齡的Balb/C小鼠作為被免疫動物。首先用純化的重組HE4蛋白 75 μ g加等體積完全弗氏佐劑乳化后，皮下多點注射進行基礎免疫。2周后，以在不同完全 弗氏佐劑中乳化的同樣劑量蛋白進行追加免疫。追加免疫后2周，再次用不含弗氏佐劑的 同樣劑量HE4蛋白腹腔注射，以進行加強免疫。末次免疫后，從動物的尾靜脈采血并測試抗 體效價。必要時，可于處死動物分離脾細胞前3天，再加強免疫一次。血清抗體效價達到足夠的水平后，處死動物并分離脾細胞，按適當比例將被免疫 小鼠的脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞混合并在PEG-4000作用下融合之。適當稀釋純化的重組HE4蛋白后，用所得稀釋液包被微量滴定板，然后以間接 ELISA法檢測雜交瘤陽性克隆，并用有限稀釋法對檢出的陽性克隆進行亞克隆。經四次亞克 隆后，共篩選出15株分泌抗HE4蛋白的雜交瘤細胞株。經配對實驗得到兩株可與HE4蛋白 發(fā)生反應，且可與不同結合位點結合的單克隆抗體(6B8和10D2)。ELISA試驗表明，在體外培養(yǎng)條件下，得自雜交瘤培養(yǎng)物上清的抗體6B8和10D2 的效價分別為1 512、1 256。在體內培養(yǎng)條件下，得自動物腹水液的抗體效價為分別 1 25600,1 12800。進一步的抗體分型實驗結果顯示，6B8和10D2雜交瘤細胞分泌的抗 體類型均為IgGl。(5)抗HE4蛋白抗體的純化和Eu3+標記用蛋白G Sepharose 4Fast Flow柱(Amersham)純化腹腔內接種雜交瘤(細胞株 10D2)后得到的小鼠腹水液，然后于4°C磁力攪拌下對過量妝20)3溶液(pH9.3，50mmol/L) 充分透析(12小時)。最后將其中的蛋白質濃度調整到5.0mg/ml。SDS-PAGE分析可見，純 化后的抗體在電泳凝膠上顯示為兩條帶(輕鏈和重鏈，見附圖6)。ELISA檢測結果表明抗 體效價與純化前基本相同。向111^(20(^1^)單抗1002溶液中加入0.511^ DTTA并調整pH值至8. 5，然后于4°C 保溫4小時。保溫后將溶液對生理鹽水透析6小時以上，然后加入EuCl3溶液(33mmol/L， 30 μ L)，并于4°C下繼續(xù)保溫10小時，以標記抗體蛋白質。標記反應完成后，用Superdex 200柱(Amersham)純化所得到的反應溶液，并用含 0.9% NaCl 的 Tri s-HCl 緩沖液(50mmol/L, pH 7. 6)洗脫液洗脫。參照Eu3+標準品，計算標記產物中平均每個抗體蛋白分子所結合的Eu3+離子數 目。用0. 22 μ m超濾膜過濾如此得到的標記產物，并加入終濃度為0. 胎牛血清白蛋白 (BSA)，于-20 V或-70 V保存?zhèn)溆?。實施?本實施例舉例描述使用本發(fā)明的抗HE4蛋白抗體，以雙抗體夾心時間分辨熒光檢測技術(TR-FIA)檢測血液樣品中HE4蛋白的方法。 實驗采用標準的雙抗體夾心法完成。其中所使用的參考標準品是分別有以下濃度 的HE4蛋白的溶液:0、0· 2、1、5、25和150ng/ml。所使用的洗滌液是含有0. 1 % Tween-20和 0. 9% NaCl 的 Tris-HCl 緩沖液(50mmol/L, pH 7. 6)。用Na2C03/NaHC03緩沖溶液(50mmol/L，pH9. 6)將如上方法純化的抗HE4蛋白抗 體6B8 (作為第一抗體)蛋白濃度稀釋至5 μ g/ml，并按每孔200 μ 1的體積加至96孔微量 滴定板的各孔中，然后4°C孵育24小時。孵育后，用洗滌液沖洗3次，并于每孔內各加入含 0. 1% Tween-20的FBSA 250 μ 1。37°C封閉孵育8小時后，再次用洗滌液洗3次，然后 凍干即制成單克隆抗體包被的微量滴定板。于4°C或-20°C下保存?zhèn)溆?。實際檢測時，按順序分別向抗體預包被的小孔內加入陰性和陽性對照樣品、參考 標準品及待檢樣本各100μ 1。用薄膜貼封后，緩慢振蕩下室溫孵育1小時。孵育后，用洗滌液洗滌小孔4次并風干，然后每孔內再加入上述銪標記的抗ΗΕ4蛋 白抗體10D2 (100 μ 1)(作為第二抗體)。用薄膜貼封各小孔，并在緩慢振搖下室溫孵育1小 時。孵育后再用洗滌液洗6次并風干，每孔各加入增強液100 μ 1，密封和緩慢振蕩條件下繼 續(xù)室溫孵育5分鐘。然后用時間分辨熒光檢測儀(DELFIA1235，WallaC)檢測熒光值(CPS)。TR-FIA技 術是利用能夠發(fā)射長壽命熒光的熒光化合物作為示蹤物，標記被檢分子(配體或配基)并 形成絡合物例如鑭系金屬離子絡合物，通過免疫學反應即可在具有較短壽命的本底熒光消 失后對被標記物發(fā)出的熒光信號進行時間分辨檢測。其中被標記物可以是參與反應體系 (如抗原抗體反應、核酸探針雜交、生物素親和素反應以及靶細胞對效應細胞的殺傷反應 等)的任何一種配體或配基。待反應體系形成并發(fā)生配體與其配基的反應后，可使用時間 分辨熒光免疫方法檢測反應結合物的熒光強度?；趯Ψ磻Y合物的熒光強度與已知量分 析物所產生的相對熒光強度的比較，即可利用標準曲線確定反應體系中分析物的濃度。根據平行檢測的已知HE4蛋白濃度的參考標準品所制作的標準曲線(附圖7)，由 電腦程序自動計算出各樣品的濃度值。其中同一樣品平行孔間的變異系數(CV)應不高于 10%。蛋白濃度值彡0. 2ng/ml的樣品判斷為HE4蛋白陽性，小于0. 2ng/ml的樣品則定為 陰性。上述實驗證明，使用本發(fā)明提供的分別作為第一和第二抗體的兩種可與HE4蛋白 的不同抗原結合位點結合的抗體(6B8和10D2)，以時間分辨熒光檢測技術檢測未知臨床樣 品中存在的HE4蛋白，其所能夠檢測到的最低蛋白濃度可低至0. 2ng/ml。統計學分析表明， 該方法的靈敏度約為71.9%，特異性達100 %。因此，本發(fā)明的基于時間分辨熒光檢測技術的HE4蛋白檢測方法，是一種檢測臨 床樣品中HE4蛋白存在的十分準確、靈敏和快捷的方法。該方法的推廣使用必將為卵巢癌 的早期診斷作出貢獻。
權利要求
1.一種檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)HE4基因的獲取和克隆。(2)重組表達質粒的構建及鑒定。(3)表達產物分析。(4)抗HE4蛋白抗體的制備。(5)抗HE4蛋白抗體的純化和Eu3+標記。(6)使用本發(fā)明的抗HE4蛋白抗體，以雙抗體夾心時間分辨熒光檢測技術(TR-FIA)檢 測血液樣品中HE4蛋白的含量。
2.根據權利要求1所述檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(1)具體為卵巢癌細胞在含10%(M/V)的小牛血清的1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當細胞數達到 1 X IO7,用TRIzoI試劑提取總RNA，按Genebank中HE4的cDNA編碼區(qū)序列設計引物；以提 取的適量總RNA為模板進行反轉錄，然后PCR擴增目的條帶，電泳顯示在約400bp處有一特 異擴增條帶，該特異擴增條帶即為目的基因HE4。
3.根據權利要求1所述檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(2)具體為獲得目的基因HE4后，將HE4基因克隆至T載體中，然后進行DNA測序，確證序 列的正確性。PCR產物經酚/氯仿抽提、乙醇沉淀后溶解于水中。將PCR產物與PMD18T載 體置16°C水浴連接過夜。將連接混合物轉化入感受態(tài)細胞。被轉化的細胞經37°C培養(yǎng)過 夜挑取9個單菌落，分別培養(yǎng)后，以提取的質粒DNA為酶消化的底物，用EcoR I, Xhol I雙 酶切，消化后的片段經DNA電泳產生一條約400bp的片段。將酶切產物克隆至PGEX-4T-1 表達載體中，命名為PGEX-HE4重組載體。
4.根據權利要求1所述檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，其特征在于，所述步驟(3)具體為將陽性克隆株活化后，加入IPTG30°C誘導培養(yǎng)4小時收菌。經SDS-PAGE檢測， 可見重組子表達產物顯示為一條分子量約為39KDa的新的蛋白條帶。將重組蛋白純化后作 為抗原并使用鼠抗HE4蛋白血清對表達產物進行ELISA分析，結果可見鼠抗HE4蛋白血清 能夠與PGEX-HE4表達產物反應，而與BL21和pGEX_4T_l轉化菌的表達產物無反應。然后 將工程菌的表達產物電轉移至硝酸纖維素膜上，以鼠抗HE4蛋白血清為抗體進行Western 印跡分析，結果顯示在39KDa蛋白處出現一特異性反應條帶，而pGEX-4T-l轉化的細菌則未 見相應的帶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測卵巢癌腫瘤標志物HE4蛋白的方法，本發(fā)明提供了抗HE4蛋白抗體，再結合已知的時間分辨熒光檢測技術，可以在卵巢癌發(fā)生的早期從極微量臨床樣品中準確地檢測到HE4的存在。因此，基于TR-FIA技術的高度靈敏度、特異性和選擇性，本發(fā)明建立的卵巢癌標志物HE4蛋白檢測方法為實現卵巢癌的早期診斷提供了重要的臨床判斷依據。
文檔編號G01N33/68GK102103144SQ20101053055
公開日2011年6月22日 申請日期2010年11月2日 優(yōu)先權日2010年11月2日
發(fā)明者朱曉龍, 趙同峰, 黃曉 申請人:浙江大學