專利名稱：高通量微流控紙芯片即時(shí)快速檢測(cè)多種人體腫瘤標(biāo)志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)裝置，尤其涉及一種能高通量檢測(cè)樣品中多種腫瘤標(biāo)志物的便攜式快速檢測(cè)微流控紙芯片裝置及其與自制膠片電極的結(jié)合應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血液和組織中的腫瘤標(biāo)志物的水平為臨床癌癥篩選和疾病診斷提供了非常重要的信息，因此，如能現(xiàn)場(chǎng)快速即時(shí)診斷腫瘤標(biāo)志物將促進(jìn)疾病的及時(shí)發(fā)現(xiàn)與治療。目前，化學(xué)傳感器領(lǐng)域中一個(gè)非常重要的新領(lǐng)域就是為醫(yī)學(xué)診斷發(fā)展一種簡(jiǎn)單經(jīng)濟(jì)實(shí)用的傳感器。具備簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速、信號(hào)穩(wěn)定等性能的傳感器裝置，使發(fā)展中國(guó)家及邊遠(yuǎn)地區(qū)普及使用醫(yī)療保健設(shè)備成為可能。為適應(yīng)臨床診斷和即時(shí)檢測(cè)的要求，實(shí)驗(yàn)室芯片應(yīng)運(yùn)而生，為全球健康及其它應(yīng)用提供了可能行。實(shí)驗(yàn)室芯片的重要性和應(yīng)用性已被廣泛認(rèn)知，復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備和概念驗(yàn)證也正被進(jìn)一步的研究。目前市場(chǎng)上已有幾種使用無(wú)塵技術(shù)的商業(yè)化芯片產(chǎn)品，但為數(shù)不多，這一方面是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室芯片盡管比傳統(tǒng)分析設(shè)備簡(jiǎn)單，但仍然沒(méi)有得到普及，特別是在發(fā)展中國(guó)家；另一方面大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)室芯片部件是由玻璃、塑料、硅膠原料等構(gòu)成的通道、泵、閥門等，這些部件復(fù)雜且比較昂貴，再次這類產(chǎn)品檢測(cè)樣品所花費(fèi)的時(shí)間比較長(zhǎng)。為使越來(lái)越多的人能夠使用即時(shí)檢測(cè)裝置，新型傳感器需具備以下特征原材料易得、廉價(jià)，有實(shí)用可讀的分析儀器可供使用。需要注意的是現(xiàn)存的很多臨床檢測(cè)都是使用多孔基質(zhì)，比如抓絨、過(guò)濾膜、絲網(wǎng)等等，這些裝置因?yàn)轶w積小，均已被稱為實(shí)驗(yàn)室芯片。紙通常是由纖維素纖維構(gòu)成的，數(shù)量豐富、價(jià)格便宜、可放置時(shí)間長(zhǎng)，可一次性使用，易于儲(chǔ)藏、運(yùn)輸，易于進(jìn)行化學(xué)修飾、并為大眾所熟悉。懷特塞得等人第一次描述了構(gòu)建微流控紙傳感器，其中微流控通道是通過(guò)光刻膠產(chǎn)生的疏水圖案，該微流控紙芯片裝置具有以下優(yōu)點(diǎn)通過(guò)毛吸作用而不需要額外的流動(dòng)運(yùn)輸裝置，只需要很小的樣品體積，可以用來(lái)過(guò)濾或者分離樣品，易于焚化處理。有很多經(jīng)濟(jì)實(shí)用的構(gòu)建微流控紙芯片的方法已被應(yīng)用，其中打印是最經(jīng)濟(jì)，并最容易進(jìn)行大量生產(chǎn)的方式之一，而打印中最省時(shí)有效的構(gòu)建紙傳感器的則是蠟打印。微流控紙芯片傳感器可用比色法和電化學(xué)方法來(lái)檢測(cè)，其中電化學(xué)免疫傳感器之所以引起公眾極大的興趣是由于此法大量生產(chǎn)時(shí)成本較低，需樣量較少及較高的靈敏度。電化學(xué)尤其適合免疫傳感器檢測(cè)因?yàn)槠湔w檢測(cè)裝置已經(jīng)像市場(chǎng)上現(xiàn)有的血糖儀一樣簡(jiǎn)單微型化，涉及到的絲網(wǎng)印刷電極的生產(chǎn)及使用技術(shù)也已非常成熟。此外，紙上電化學(xué)呈現(xiàn)出了較好的運(yùn)行結(jié)果；纖維素纖維沒(méi)有任何擴(kuò)散阻礙，反而，黏貼在電極表面的浸透的芯片使檢測(cè)更不易受震動(dòng)和其它對(duì)流的影響。由于腫瘤標(biāo)志物的特異選擇性，同時(shí)篩選多種癌癥的多通道免疫檢測(cè)方法迫切需要。這些方法通常使用酶比如辣根過(guò)氧化物酶來(lái)產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)。為了能在疾病早期檢測(cè)更低水平的生物標(biāo)記物，人們采用了很多信號(hào)放大的措施來(lái)增強(qiáng)識(shí)別電子信號(hào)的傳輸，特別是納米材料的應(yīng)用，像金納米粒子、碳納米管、金屬氧化物、半導(dǎo)體等等。本專利選用碳納米管為例，因?yàn)樗麄兙哂锌箯垙?qiáng)度大、比表面積大、電子傳導(dǎo)率高、導(dǎo)熱性能好等的優(yōu)點(diǎn)；碳納米管生物傳感器因其具有現(xiàn)成可用的框架模塊，能適用微量檢測(cè)的小型化設(shè)備，以及碳納米管極好的電子傳輸特性而被廣泛關(guān)注并運(yùn)用；此外，碳納米管可以固定生物分子并維持它們的生物活性，比如酶反應(yīng)和識(shí)別功能；最重要的是小型化的納米傳感器平臺(tái)的開發(fā)實(shí)現(xiàn)了半自動(dòng)化的一次性樣品檢測(cè)。本文第一次在使用碳納米管的基礎(chǔ)上將微流控紙芯片與電化學(xué)相結(jié)合。將蠟打印微流控紙芯片與絲網(wǎng)印刷電極相結(jié)合，構(gòu)建低成本、一次性使用的碳納米管電化學(xué)微流控紙芯片傳感器。在安培免疫檢測(cè)中采用的多路復(fù)用電極避免了串?dāng)_和除氧過(guò)程，這極大地簡(jiǎn)化了檢測(cè)過(guò)程。此類傳感器通過(guò)碳納米管殼聚糖修飾的紙芯片來(lái)捕獲抗體，碳納米管用于加速電子轉(zhuǎn)移速率，放大酶信號(hào)以提高傳感器的靈敏度。用幾種抗原作為實(shí)例分析物，超靈敏多路復(fù)用免疫傳感器展現(xiàn)了極好的分析性能。這種簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、線性范圍廣、重現(xiàn)性好、靈敏度高的免疫傳感器在臨床檢測(cè)不同的腫瘤標(biāo)志物方面有很好的發(fā)展前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種診斷監(jiān)測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)，現(xiàn) 場(chǎng)體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)的多通道微流控紙芯片免疫傳感器的制備及檢測(cè)方法，此方法可以在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中輕易實(shí)現(xiàn)而不需要復(fù)雜繁瑣的大型設(shè)備支持。本發(fā)明用碳納米管多通道微流控紙芯片免疫傳感器的制造方法，其特征包括以下步驟
(1)在色譜紙上用蠟打印機(jī)打印設(shè)計(jì)的通道圖案，用電子控溫儀器對(duì)蠟印的色譜紙進(jìn)行加熱，目的是將蠟烤化并使其均勻的滲透到色譜紙的內(nèi)部，從而在未印蠟的部位形成親水通道；
(2)選擇病人體內(nèi)的某幾種腫瘤標(biāo)志物作為抗原，并制備與抗原--對(duì)應(yīng)的抗體；
(3)采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體作為二抗，便于檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)；
(4)將納米材料修飾于處理后的紙芯片通道上，用以提高微流控紙芯片的導(dǎo)電性，提高其靈敏度；
(5)在步驟(4)之后修飾用于捕捉抗體的殼聚糖等多糖類；
(6)處理好的微流控紙芯片需要與絲網(wǎng)印刷電極相結(jié)合檢測(cè)電信號(hào)；
(7)絲網(wǎng)印刷電極在使用前需要用拋光粉打磨光滑，備用。本發(fā)明所述電極為多電極體系形成的多通道免疫，多通道數(shù)量可以在2—8之間； 本發(fā)明所述納米材料包括石墨烯、碳納米管、金納米離子、金屬氧化物、半導(dǎo)體等等；


圖1. a—微流控紙芯片免疫修飾過(guò)程的區(qū)域；
b—將工作電極與參比電極和對(duì)電極相連使其能順利通過(guò)電化學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)；c一對(duì)應(yīng)a的兩個(gè)工作電極；d—銀/氯化銀參比電極；e一石墨對(duì)電極；f一導(dǎo)電通道；g—聚酰胺纖維膠片；
圖2.1—圖1中的a區(qū)域的剖面圖；2—在a區(qū)域中先修飾碳納米管再修飾殼聚糖后的示意3—在2步驟后，捕獲與抗原相應(yīng)的抗體；
4一用牛血清白蛋白封閉可能結(jié)合抗原的位點(diǎn)；
5一抗體捕獲相應(yīng)的抗原；
6—用酶標(biāo)記的抗體與抗原結(jié)合。實(shí)施例I CEA和CA125兩種腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)
CEA :癌胚抗原，一種酸性糖蛋白。主要存在于胎兒消化到上皮組織、胰臟和肝臟。正常成人血清中CEA的含量極低，但發(fā)生腫瘤時(shí)可重新表達(dá)，并隨腫瘤分期的進(jìn)展、細(xì)胞惡性程度的升高而逐漸升高。其中以結(jié)腸癌升高為甚，約有709^90%顯示陽(yáng)性。血清CEA水平變化與結(jié)腸癌Duke分期密切相關(guān)。對(duì)于CEA升高的結(jié)腸癌患者，血清CEA水平與癌腫大小、 有無(wú)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，當(dāng)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移時(shí)，CEA升高更為明顯。CA125 :1983年由Bast等從上皮性卵巢癌抗原檢測(cè)出可被單克隆抗體0C125結(jié)合的一種糖蛋白。95%的健康女性CA125水平< 35U/mL。如果病人血清CA125的水平是基線水平的兩倍，就應(yīng)該立即進(jìn)行檢查。另外，CA125不僅是卵巢癌的特異性標(biāo)志物，輸卵管腺癌、子宮內(nèi)膜癌、宮頸癌、胰腺癌、腸癌、乳腺癌和肺癌患者CA125的水平也會(huì)升高。具體步驟
(I)在血液或分泌物樣品中提取CEA和CA125作為抗原。然后通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)注射方法制備上述抗原對(duì)應(yīng)的抗體。(2)制備雙工作電極檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)雙電極絲網(wǎng)印刷模板，用絲網(wǎng)印刷機(jī)或手工印刷石墨電極和銀氯化銀電極，并打磨光滑備用。設(shè)計(jì)與膠片電極模型對(duì)應(yīng)的紙芯片，用蠟印機(jī)打印出設(shè)計(jì)的圖案，并烘烤至蠟滲透紙芯片，制備吸水的工作區(qū)域，
(3)將150微升酸化好的碳納米管滴加到工作電極對(duì)應(yīng)的工作區(qū)域進(jìn)行修飾，并進(jìn)一步分別滴加50微升的殼聚糖和戊二醛對(duì)紙芯片進(jìn)行修飾，為接抗原抗體做好準(zhǔn)備。(4)將步驟(I)中制備的相應(yīng)的5微升的一抗修飾到步驟(2)中處理好的紙芯片上，隨后用30微升牛血清白蛋白封閉可能存在的活性位點(diǎn)，隨后接相應(yīng)的5微升的抗原，反應(yīng)完全后，接帶辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的10微升的二抗，每一步接抗原抗體的后面都用pH6. 8的緩沖溶液進(jìn)行洗滌，以洗滌掉吸附性不穩(wěn)固的抗原或者抗體，使檢測(cè)更加靈敏、準(zhǔn)確。(5)如圖所示，將修飾有CEA和CA125的微流控紙芯片免疫傳感器置于底端的膠片電極上，將電極與電化學(xué)工作站相連接，檢測(cè)時(shí)滴加一定濃度的雙氧水，使其與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，此時(shí)用電化學(xué)工作站記錄下顯示的電流值，根據(jù)電流值的大小準(zhǔn)確診斷檢測(cè)物質(zhì)的量。實(shí)施例2. AFP和CA199、CEA三種腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)
AFP :甲胎蛋白又稱APF，它是胚胎時(shí)期血液里含有的一種特殊蛋白質(zhì)，只有在胎兒的肝細(xì)胞中才能合成，尤其在懷孕16 — 20周時(shí)，胎兒的這種蛋白質(zhì)含量最高，100毫升血中可達(dá)到300— 400毫克，以后逐漸減少，待出生以后一周完全消失。一般情況下只存在于胎兒的血液中，正常人的肝細(xì)胞是不產(chǎn)生甲胎蛋白的，可是當(dāng)?shù)昧烁伟r(shí)，由于肝細(xì)胞幼稚化無(wú)休止地生長(zhǎng)惡化，就又恢復(fù)了合成甲胎蛋白的能力，有時(shí)在100毫升血中竟達(dá)到1000毫克的高度，所以檢查AFP在血液中的含量，對(duì)這類疾病的發(fā)現(xiàn)和診斷有重要意義。CA 199 CA199是胰腺癌和結(jié)、直腸癌的標(biāo)志物。血清CA199陽(yáng)性的臨界值為37KU/L0胰腺癌患者85%-95%為陽(yáng)性。腫瘤切除后CA199濃度會(huì)下降，如在上升，則可表示復(fù)發(fā)。結(jié)直腸癌、膽囊癌、膽管癌、肝癌和胃癌的陽(yáng)性率也很高，若同時(shí)檢測(cè)CEA和AFP可進(jìn)一步提高陽(yáng)性檢測(cè)率。CEA :癌胚抗原，一種酸性糖蛋白。主要存在于胎兒消化到上皮組織、胰臟和肝臟。正常成人血清中CEA的含量極低，但發(fā)生腫瘤時(shí)可重新表達(dá)，并隨腫瘤分期的進(jìn)展、細(xì)胞惡性程度的升高而逐漸升高。其中以結(jié)腸癌升高為甚，約有709^90%顯示陽(yáng)性。血清CEA水平變化與結(jié)腸癌Duke分期密切相關(guān)。對(duì)于CEA升高的結(jié)腸癌患者，血清CEA水平與癌腫大小、有無(wú)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，當(dāng)發(fā)生肝轉(zhuǎn)移時(shí)，CEA升高更為明顯。具體步驟
(1)在血液或分泌物樣品中提取AFP、CA125和CA199作為抗原。然后通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)注射方法制備上述抗原對(duì)應(yīng)的抗體。(2)制備三工作電極檢測(cè)裝置設(shè)計(jì)雙電極絲網(wǎng)印刷模板，用絲網(wǎng)印刷機(jī)或手工印刷石墨電極和銀氯化銀電極，并打磨光滑備用。設(shè)計(jì)與膠片電極模型對(duì)應(yīng)的紙芯片，用蠟印機(jī)打印出設(shè)計(jì)的圖案，并烘烤至蠟滲透紙芯片，制備吸水的工作區(qū)域，
(3)將150微升酸化好的碳納米管滴加到工作電極對(duì)應(yīng)的工作區(qū)域進(jìn)行修飾，并進(jìn)一步分別滴加50微升的殼聚糖和戊二醛對(duì)紙芯片進(jìn)行修飾，為接抗原抗體做好準(zhǔn)備。(4)將步驟(I)中制備的相應(yīng)的5微升的一抗修飾到步驟(2)中處理好的紙芯片上，隨后用30微升牛血清白蛋白封閉可能存在的活性位點(diǎn)，隨后接相應(yīng)的8微升的抗原，反應(yīng)完全后，接帶辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的16微升的二抗，每一步接抗原抗體的后面都用pH6. 8的緩沖溶液進(jìn)行洗滌，以洗滌掉吸附不穩(wěn)固的抗原或者抗體，使檢測(cè)更加靈敏、準(zhǔn)確。(5)如圖所示，將修飾有AFP、CA 199和CEA的微流控紙芯片免疫傳感器置于底端的膠片電極上，將電極與電化學(xué)工作站相連接，檢測(cè)時(shí)滴加一定濃度的雙氧水，使其與辣根過(guò)氧化物酶反應(yīng)，此時(shí)用電化學(xué)工作站記錄下顯示的電流值，根據(jù)電流值的大小準(zhǔn)確診斷檢測(cè)物質(zhì)的量。
具體實(shí)施例方式(I)手動(dòng)印刷本實(shí)驗(yàn)所用膠片電極，并用三氧化二鋁拋光粉將電極打磨光滑，備用；
(2)使用蠟打印機(jī)打印如圖1-A所示圖案，并使用電子控溫儀器對(duì)印蠟的色譜紙進(jìn)行加熱，使蠟均勻的滲透到色譜紙內(nèi)部，未印蠟的區(qū)域形成微流控紙芯片通道；
(3)選用多壁碳納米管，用硝酸和硫酸的混合酸酸化碳納米管，使其帶羧基；
(4)將100-200微升酸化的碳納米管溶液滴到圖1所示的a區(qū)域即通道區(qū)域；
(5)待碳納米管溶液在紙上完全干燥后，在a區(qū)域滴加10-100微升的殼聚糖溶液；
(6)待殼聚糖溶液在紙上與碳納米管結(jié)合完全，并穩(wěn)定吸附于紙上后，a區(qū)域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥；
(7)用pH為6.8的Tris-HNO3緩沖溶液沖洗三次，沖洗方法為正面滴加緩沖溶液，在反面用吸水紙引水；
(8)緩沖溶液干透后，在a區(qū)域的兩端分別滴加1-10微升的兩種不同種類的一抗； (9)重復(fù)步驟(7)，洗去未吸附或吸附不牢固的抗體
(10)待一抗溶液在a區(qū)域吸附穩(wěn)固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液，以封閉可能得活性位點(diǎn)；
(11)重復(fù)步驟(7)；
(12)在a區(qū)域滴加與步驟(8)中分別相對(duì)應(yīng)的1-10微升的抗原，使其反應(yīng)完全；
(13)在反應(yīng)完全后，立即重復(fù)步驟(7)；
(14)緩沖溶液洗脫后即可在a區(qū)域滴加相對(duì)應(yīng)的5-20微升的二抗，使其充分反應(yīng)；
(15)之后立即重復(fù)步驟(7)；
(16)在完成最后一步洗滌后，將微流控紙芯片通道放置于制備好的膠片電極上，并滴加一定濃度的雙氧水，立即用電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)。至此即可準(zhǔn)確測(cè)定樣品中抗原的濃度。本發(fā)明簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、是用，有很好的發(fā)展前景。本文示意圖以兩電極體系為例，多工作電極體系可以依次類推增加工作電極的個(gè)數(shù)。本發(fā)明的有益效果1.本發(fā)明底端的膠片電極可以設(shè)計(jì)為2-8電極體系，這樣對(duì)應(yīng)的紙芯片亦需要設(shè)計(jì)為對(duì)應(yīng)電極數(shù)的工作區(qū)域，利用不同界面的抗原抗體的特異性結(jié)合，識(shí)別腫瘤細(xì)胞，即可進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)；這樣修飾的樣品可以同時(shí)對(duì)血液樣品進(jìn)行識(shí)別，相應(yīng)的抗原抗體結(jié)合，使診斷檢測(cè)步驟更加簡(jiǎn)單，更易于非專業(yè)人士操作；該傳感器底端的膠片電極可以多次反復(fù)使用，大大降低了診斷監(jiān)測(cè)成本。2.本發(fā)明所得到的現(xiàn)場(chǎng)快速體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)微流控紙芯片免疫傳感器，可以實(shí)現(xiàn)樣本中多種疾病抗原的高特異性、高靈敏度、同時(shí)快速診斷監(jiān)測(cè)。3.本發(fā)明的現(xiàn)場(chǎng)快速體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)微流控紙芯片免疫傳感器的特異性強(qiáng)，樣品中其它非特異性物質(zhì)對(duì)診斷監(jiān)測(cè)結(jié)果無(wú)影響；靈敏度高，可以達(dá)到ng級(jí)；診斷監(jiān)測(cè)速度快，完成一個(gè)基本診斷監(jiān)測(cè)過(guò)程僅需1-2分鐘的時(shí)間，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量樣本的高通量篩選,成本低。4.本發(fā)明的現(xiàn)場(chǎng)快速體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)微流控紙芯片免疫傳感器診斷監(jiān)測(cè)疾病抗原的方法，操作快速簡(jiǎn)單，反應(yīng)及結(jié)果均由儀器自動(dòng)完成和記錄，避免了主觀因素的影響，并保證有很好的重復(fù)性，便于現(xiàn)場(chǎng)診斷監(jiān)測(cè)。5.本發(fā)明的現(xiàn)場(chǎng)快速體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)微流控紙芯片免疫傳感器可以用于環(huán)境樣品溶液、體液、血液或分泌物樣品等多種樣品的診斷監(jiān)測(cè)，這就是使得該免疫傳感器可用于傳染病的傳播和流行環(huán)節(jié)的診斷和監(jiān)測(cè)，并能現(xiàn)場(chǎng)及時(shí)的發(fā)現(xiàn)、預(yù)防、快速診斷傳染性疾病。6.本發(fā)明的工作電極可以多個(gè)(2-8個(gè))，但參比電極和對(duì)電極可以共用一套，這樣既有利于制備電極時(shí)成本的節(jié)省，也有利于減小不同電極間的誤差，更有利于整體檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明用碳納米管多通道免疫微流控紙芯片的制造方法，其特征包括以下步驟 (1)在色譜紙上用蠟打印機(jī)打印設(shè)計(jì)的通道圖案，用電子控溫儀器對(duì)蠟印的色譜紙進(jìn)行加熱，目的是將蠟烤化并使其均勻的滲透到色譜紙的內(nèi)部，從而在未印蠟的部位形成親水通道； (2)選擇病人體內(nèi)的某幾種腫瘤標(biāo)志物作為抗原，并制備與抗原--對(duì)應(yīng)的抗體； (3)采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體作為二抗，便于檢測(cè)電化學(xué)信號(hào)； (4)將納米材料修飾于處理后的紙芯片通道上，用以提高微流控紙芯片的導(dǎo)電性，提高其靈敏度； (5)在步驟(4)之后修飾用于捕捉抗體的殼聚糖等多糖類； (6)處理好的微流控紙芯片需要與絲網(wǎng)印刷電極相結(jié)合檢測(cè)電信號(hào)； (7)絲網(wǎng)印刷電極在使用前需要用拋光粉打磨光滑，備用。
2.本發(fā)明所述電極為多電極體系形成的多通道免疫，多通道數(shù)量可以在2—8之間； 本發(fā)明所述納米材料包括石墨烯、碳納米管、金納米離子、金屬氧化物、半導(dǎo)體等等； 具體實(shí)施步驟包括 (1)手動(dòng)印刷本實(shí)驗(yàn)所用膠片電極，并用三氧化二鋁拋光粉將電極打磨光滑，備用； (2)使用蠟打印機(jī)打印設(shè)計(jì)好的圖案，并使用電子控溫儀器對(duì)印蠟的色譜紙進(jìn)行加熱，使蠟均勻的滲透到色譜紙內(nèi)部，未印蠟的區(qū)域形成微流控紙芯片通道； (3)選用多壁碳納米管，用硝酸和硫酸的混合酸酸化碳納米管，使其帶羧基； (4)將100-200微升酸化的碳納米管溶液滴到通道區(qū)域； (5)待碳納米管溶液在紙上完全干燥后，在通道區(qū)域滴加10-100微升的殼聚糖溶液； (6)待殼聚糖溶液在紙上與碳納米管結(jié)合完全，并穩(wěn)定吸附于紙上后，通道區(qū)域滴加10-100微升的戊二醛溶液，并等其自然干燥； (7)用pH為6.8的Tris-HNO3緩沖溶液沖洗三次，沖洗方法為正面滴加緩沖溶液，在反面用吸水紙引水； (8)緩沖溶液干透后，在通道區(qū)域的兩端分別滴加1-10微升的兩種不同種類的一抗； (9)重復(fù)步驟(7)，洗去未吸附或吸附不牢固的抗體； (10)待一抗溶液在a區(qū)域吸附穩(wěn)固后，再滴加20-100微升的牛血清白蛋白溶液； (11)重復(fù)步驟(7)； (12)在通道區(qū)域滴加與步驟(8)中分別相對(duì)應(yīng)的1-10微升的抗原，使其反應(yīng)完全； (13)在反應(yīng)完全后，立即重復(fù)步驟(7)； (14)緩沖溶液洗脫后即可在通道區(qū)域滴加相對(duì)應(yīng)的5-20微升的二抗，使其充分反應(yīng)； (15)之后立即重復(fù)步驟(7)； (16)在完成最后一步洗滌后，將微流控紙芯片通道放置于制備好的膠片電極上，并滴加一定濃度的雙氧水，立即用電化學(xué)工作站進(jìn)行檢測(cè)，至此即可根據(jù)顯示的電流值準(zhǔn)確測(cè)定樣品中抗原的濃度。
全文摘要
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供了一種無(wú)需特殊樣品前處理、診斷監(jiān)測(cè)速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)，現(xiàn)場(chǎng)體外即時(shí)多疾病同時(shí)診斷監(jiān)測(cè)的多通道微流控紙芯片免疫傳感器的制備及檢測(cè)方法，此方法可以在絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中輕易實(shí)現(xiàn)而不需要復(fù)雜繁瑣的大型設(shè)備支持。該傳感器底端的膠片電極可以多次反復(fù)使用，大大降低了診斷監(jiān)測(cè)成本。靈敏度高，可以達(dá)到ng級(jí)；診斷監(jiān)測(cè)速度快，完成一個(gè)基本診斷監(jiān)測(cè)過(guò)程僅需1-2分鐘的時(shí)間，可在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大量樣本的高通量篩選。
文檔編號(hào)G01N27/42GK102980998SQ201210472330
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者于京華, 王盼盼, 顏梅, 葛慎光, 葛磊, 張彥, 楚成超, 李偉平, 劉芳, 王衍虎, 李龍, 劉偉艷, 李蒙 申請(qǐng)人:濟(jì)南大學(xué)