一種檢測腫瘤組織中EGFRvIII的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體來說，涉及一種檢測腫瘤組織中EGFRvIII 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤嚴(yán)重威脅著人類的健康，是我國乃至全世界公關(guān)的重點疾病之一，其發(fā) 病率有逐漸增加的趨勢。近年來的腫瘤學(xué)研究和臨床觀察，發(fā)現(xiàn)環(huán)境因素與個人行為對人 類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著重要的影響。越來越多的研究表明：幾乎所有的惡性腫瘤都與外 界所遭受的環(huán)境因素有關(guān)。各種環(huán)境因素以不同的方式造成了有機體遺傳物質(zhì)的損傷，例 如基因的突變、重組等，從而直接或間接的造成原癌基因的激活或者抑癌基因的失活，使細(xì) 胞病變、永生化，繼而造就了腫瘤的產(chǎn)生。歸根結(jié)底，腫瘤是一類基因疾病。近年來發(fā)展起來 的免疫治療和細(xì)胞治療針對的就是導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生的特異性的基因，來靶向殺死腫瘤細(xì)胞。
[0003] 惡性腫瘤如：膠質(zhì)細(xì)胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、非小細(xì)胞肺癌等的細(xì)胞表面有表皮生 長因子受體（EGFR)的過表達和基因的突變或重組，而EGFRvIII(表皮生長因子受體III型 突變體）是表皮生長因子受體（EGFR)最常見的突變體形式。EGFRvIII是EGFR缺失了胞外 段的2-7外顯子部分（801bp)，而1和8外顯子直接連接，且在連接處形成了一個新的甘氨 酸。較EGFR野生型來說，EGFRvIII缺失了胞外段的6-273號氨基酸殘基，S卩EGFR的配體 結(jié)合區(qū)，其本身不和配體結(jié)合，即可產(chǎn)生持續(xù)的磷酸化，使受體產(chǎn)生持續(xù)的刺激信號。近年 來的研究報道，EGFRvIII通過促進細(xì)胞的增殖、迀移和侵襲，降低細(xì)胞的死亡來促進腫瘤的 發(fā)生和發(fā)展。與此同時，EGFRvIII僅表達于腫瘤細(xì)胞，而正常細(xì)胞中卻沒有報道，這也是近 年來越來越多的免疫治療以EGFRvIII為靶向的主要原因。
[0004] 如何準(zhǔn)確、快速的檢測出各腫瘤組織EGFRvIII的表達情況是靶向免疫治療的關(guān) 鍵因素，從1962年Montalcini和Cohen等人發(fā)現(xiàn)表皮生長因子（EGF)至今，關(guān)于其受體 EGFR及相關(guān)突變的研究取得了重要的進展，對于EGFR及相關(guān)突變體的鑒定也伴隨EGF的研 究延續(xù)至今。主要采用的方法有直接測序法、實時定量PCR及組織免疫組化等的方法。這 些方法各有優(yōu)勢，但操作復(fù)雜、耗時長、成本相對較大一定程度上限制了這些方法的推廣使 用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對相關(guān)技術(shù)中的上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出一種檢測腫瘤組織中EGFRvIII的 方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實現(xiàn)的： 一種檢測腫瘤組織中EGFRvIII的方法，包括以下步驟： 1. 對EGFR，EGFRvIII基因序列進行分析：采用編寫的序列分析程序?qū)ν蛔儏^(qū)之前的基 因序列進行逐個堿基掃描，得到56-70位堿基的低重復(fù)性區(qū)域； 2. 針對突變區(qū)前的低重復(fù)區(qū)域設(shè)計出兩條特異性的正向引物，利用序列分析軟件進行 特異性反向引物設(shè)計，并與突變區(qū)之前的正向引物所匹配，分別設(shè)計出跨突變區(qū)的第一輪 和第二輪特異性擴增引物； 3. 檢測模板的獲得：采用RT-PCR的方法檢測EGFRvIII基因表達情況，更加靈敏、準(zhǔn)確 的探知EGFRvIII在表達水平的變化，有利于對其進行特異性的靶向治療，包括： 1) 組織樣品RNA的提取：取適量RNAlater保存的組織樣品，參照TRIzol裂解法提取 組織樣品RNA; 2) 獲得模板cDNA:以組織樣品RNA為模板，oligodT為引物進行RNA的反轉(zhuǎn)錄得到組 織樣品cDNA; 4. EGFRvIII的檢測 采用巢式PCR的方法進行連續(xù)的兩輪PCR，特異性的檢測EGFRvIII在組織樣品的表達 情況，包括： 1) 以步驟3獲得的cDNA為模板（以水為陰性對照，設(shè)置空白對照，陽性對照)，進行第一 輪擴增；以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，進行第二輪PCR擴增； 2) 1%瓊脂糖凝膠直接檢測兩輪PCR擴增情況，并根據(jù)EGFRvIII目的片段較EGFR野生 型小801bp，直觀觀察EGFRvIII的組織表達情況； 5. 檢測結(jié)果的測序驗證：切膠回收EGFRvIII目的片段，基因測序驗證巢式PCR檢測結(jié) 果。
[0007] 本發(fā)明在RT-PCR和常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上采用巢式PCR的方法來檢測組織樣品中 EGFRvIII的表達情況，巢式PCR是基于常規(guī)PCR，采用第一對引物擴增目的基因片段，第二 對引物特異性擴增第一輪PCR的產(chǎn)物。由于第二對引物位于第一輪PCR產(chǎn)物的內(nèi)部，而非 特異的目的片段包含兩對引物的結(jié)合位點的概率極小，因此，第二對引物不會擴增出非特 異的目的片段，確保了第二輪PCR產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。經(jīng)過兩輪的PCR擴增，組織樣品中的低表 達基因經(jīng)過兩次的信號放大，完全可以直接通過瓊脂糖凝膠直觀的分離開來，進一步提高 了方法的適用性 本發(fā)明的有益效果：對于檢測腫瘤細(xì)胞EGFRvIII具有靈敏度高、準(zhǔn)確性高的優(yōu)點，且 耗時短，結(jié)果直觀，可以在短時間內(nèi)靈敏檢測出惡性腫瘤組織中EGFRvIII的存在，為靶向 治療提供良好的如提和基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0008] 為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例中所 需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施 例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲 得其它的附圖。
[0009] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例所述的GAPDH擴增各組織樣品，用1%凝膠檢測結(jié)果，其 中，從左至右的樣品依次為：D12000標(biāo)準(zhǔn)參照和1-21號樣品； 圖2為第二輪PCR擴增產(chǎn)物用1%凝膠檢測結(jié)果，其中，從左至右的樣品依次為：D12000 標(biāo)準(zhǔn)參照、1-21號樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品； 圖3為第二輪PCR擴增產(chǎn)物的反向測序分析結(jié)果，其中，F(xiàn)66-496.seq為第二輪PCR擴 增產(chǎn)物序列，EGFR-vIII.seq為EGFRvIII序列，Consensus,seq為共有序列。
【具體實施方式】
[0010] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明實施例的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描 述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明實施例所述的一種檢測腫瘤組織中EGFRvIII的方法，包括以下步驟： 1. EGFRvIII基因序列分析和引物設(shè)計 利用編寫的序列分析程序?qū)ν蛔儏^(qū)之前的基因序列（GC含量71. 6%，重復(fù)率高）進行逐 個堿基掃描，得到56-70位堿基的低重復(fù)性區(qū)域，利用序列分析軟件設(shè)計特異性反向引物， 并與突變區(qū)之前的正向引物F56(SEQIDN0:1)和F66(SEQIDN0:3)所匹配，利用NCBI 引物搜索軟件檢測各配對引物在人基因組中的特異性，分別設(shè)計得出跨突變區(qū)的第一輪和 第二輪特異性反向擴增引物R796(SEQIDN0:2)和R496(SEQIDN0:4); 表1 :PCR檢測引物
2. 檢測模板的獲得 已有報道PCR檢測EGFR及其突變體的方法多采用DNA來直接進行擴增，由于包含了諸 多內(nèi)含子，無論在特異性還是準(zhǔn)確性方面都會大打折扣。且基因組水平無法體現(xiàn)EGFRvIII 的表達情況，因此，我們采取了表達水平的EGFRvIII檢測，更加直觀、準(zhǔn)確的檢測腫瘤組織 中EGFRvIII的表達情況，為惡性腫瘤的靶向治療打下基礎(chǔ)。
[0012] 1)組織樣品RNA的提取，包括如下步驟： 1. 1)組織樣品的選取和制備：手術(shù)切下的腫瘤組織，切除邊緣，選取中間完好的組織塊 在最短的時間內(nèi)放置于RNAlater中在-80°c下保存，防止RNA降解； 1. 2)取30mgRNAlater保存樣品，加lmlTRIzol充分研磨，使組織塊充分裂解，按 200μ1/mlTRIzol的比例加入氯仿，充分震蕩混勻，4°C，12000rpm離心15分鐘； 1. 3)取上層水相于另一EP(離心）管中，加入等體積異丙醇沉淀RNA，4°C，12000rpm離 心10分鐘，收集沉淀的RNA; 1. 4)用75%乙醇清洗沉淀得到的RNA，4°C，12000rpm離心10分鐘； 1. 5)棄掉乙醇，待乙醇揮發(fā)殆盡，適量DEPC水溶解組織樣品RNA; 2)模板cDNA的獲得，包括： 2. 1)準(zhǔn)確測得組織樣品RNA濃度； 2. 2)高容量cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書嚴(yán)格在冰上配置好反轉(zhuǎn)體系； 表2 :cDNA獲得反應(yīng)體系
輕柔混勻以上反應(yīng)體系，并利用離心機短暫離心，獲得模板cDNA; 表3 :cDNA獲得反應(yīng)程序
2. 3)用Taq高保真DNA聚合酶配置反應(yīng)體系，引物為F(SEQIDN0:5)和R(SEQID N0:6)，用人內(nèi)參基因（GAPDH)進行PCR擴增各組織樣品，產(chǎn)物1%凝膠檢測，以確保RNA的 提取質(zhì)量及獲得的cDNA質(zhì)量； 表4 :GAPDH擴增體系

3.EGFRvIII的PCR檢測 由基因序列分析中我們可以清晰的得到：EGFRvIII較野生型EGFR缺失801bp，可以通 過PCR的方法得到各組織樣品的PCR產(chǎn)物，通過凝膠檢測，直觀地觀察EGFRvIII的突變情 況及粗略的表達情況。
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