一種蔥鱗葡萄孢菌的快速檢測(cè)方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于作物病害診斷及防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種快速檢測(cè)蔥屬類作物主 要病原菌蔥鱗葡萄孢菌（Botrytissquamosa)的快速檢測(cè)方法及應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 蔥蒜類蔬菜是具有特殊氣味的一類作物，主要包括蔥、大蒜、蒜薹、蒜苗、洋蔥、韭 菜等。富含糖分、維生素以及多種礦物質(zhì)，并具有殺菌作用，在東西方飲食文化中都占據(jù)重 要地位。然而蔥蒜類蔬菜無論在田間栽培還是采后儲(chǔ)運(yùn)過程中，都容易受到病害的威脅，其 中一種最主要的真菌性病原為蔥鱗葡萄孢菌，其拉丁學(xué)名為：BotrytissquamosaWalker， 該菌屬半知菌亞門葡萄孢屬，在蔥蒜類蔬菜的主要種植產(chǎn)區(qū)如亞洲、歐洲、南美洲及北美洲 造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。以我國(guó)的特色蔬菜蒜薹為例，在采收以后由B.squamosa引起的灰霉 病，每年可導(dǎo)致20-30%的損失。
[0003]B.squamosa主要侵染蔥蒜類蔬菜的葉片。該菌的菌絲及分子孢子可隨病殘?bào)w越 冬；或以菌核形態(tài)在土壤中越冬越夏，并隨種苗調(diào)運(yùn)傳播，當(dāng)遇有較低的溫度和較高的濕度 條件時(shí)即可發(fā)生和流行。該菌的分生孢子可在3-27°C范圍內(nèi)由菌核產(chǎn)生，而且一旦侵染 寄主便會(huì)大量產(chǎn)生分生孢子，引發(fā)二次侵染，并迅速擴(kuò)展。因此，快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)和鑒定 B.squamosa并有效控制其引起的病害，對(duì)降低蔥蒜類蔬菜的經(jīng)濟(jì)損失至關(guān)重要。
[0004] 傳統(tǒng)的真菌鑒定方法主要通過形態(tài)學(xué)，如菌落、分生孢子等形態(tài)來鑒定。但形態(tài)學(xué) 鑒定方法繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，而且需要豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，分子 標(biāo)記成為鑒定真菌種類的主要技術(shù)手段。在各種分子標(biāo)記技術(shù)中，基于RAro結(jié)合SCAR的技 術(shù)，可以獲得物種特異性的標(biāo)記，其基本原理是，首先RAro利用隨機(jī)引物（一般為8-10bp) 通過PCR反應(yīng)隨機(jī)擴(kuò)增DNA片段，通過凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段的多態(tài)性，并在目的 菌種與近緣物種間進(jìn)行比較，獲取目的菌種所特有的擴(kuò)增產(chǎn)物，并將其從凝膠中切割回收， 將回收的產(chǎn)物進(jìn)行克隆并測(cè)序，進(jìn)一步獲得目的菌株經(jīng)RAH)擴(kuò)增所獲的特異性產(chǎn)物的序 列信息，并以片段兩端序列設(shè)計(jì)特異引物（>18bp)，對(duì)基因DNA片段再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增，就 能把與原RAH)片段相對(duì)應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒別出來。RAH)結(jié)合SCAR獲得的針對(duì)特定物種的特 異性引物，對(duì)待檢DNA間的差異可直接通過有無擴(kuò)增產(chǎn)物來顯示，可以方便、快捷、可靠地 檢測(cè)大量個(gè)體，結(jié)果穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性高。與傳統(tǒng)的真菌鑒定方法相比，分子標(biāo)記能準(zhǔn)確、快 速地從植物組織上附著的混合微生物群體中鑒定出特定類型的病原菌。
[0005] 對(duì)于蔥鱗葡萄孢菌B.squamosa這種危害蔥蒜類蔬菜作物的主要病原真菌，目前 還缺乏有效的分子標(biāo)記，本發(fā)明則通過RAPD結(jié)合SCAR技術(shù)開發(fā)了B.squamosa特異性的分 子標(biāo)記引物，并建立了快速、準(zhǔn)確地鑒定B.squamosa的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明克服現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，旨在提出一種快速、有效且容易操作的檢測(cè)方 法來鑒定蔥蒜類蔬菜作物的重要病原菌蔥鱗葡萄孢菌（Botrytissquamosa，B.squamosa)。
[0007] 本發(fā)明提出的蔥鱗葡萄孢菌的快速檢測(cè)方法，所述方法主要包括以下步驟：
[0008] (1)設(shè)計(jì)檢測(cè)所述蔥鱗葡萄孢菌（B.squamosa)的特異性引物：
[0009] 本發(fā)明中，設(shè)計(jì)檢測(cè)B.squamosa的特異性引物為：采用RAPD(Random AmplificationPolymorphicDNA,RAPD)和SCAR(Sequence-characterizedAmplified Regions)相結(jié)合的方法，開發(fā)設(shè)對(duì)能夠特異性檢測(cè)B.squamosa的引物，如以下SEQID Ν0· 1 和SEQIDΝ0· 2 所示：
[0010] 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDΝ0· 1);
[0011] 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDΝ0· 2)。
[0012] (2)提取對(duì)待檢樣品的總DNA;
[0013] (3)以待檢樣品DNA為模板，用所述蔥鱗葡萄孢菌特異性引物進(jìn)行PCR聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)；
[0014] (4)將得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)GoldenView染色后，在凝膠成 像系統(tǒng)下進(jìn)行分析，以是否具有301bp的蔥鱗葡萄孢菌的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，判斷對(duì)應(yīng)的待 檢樣品（包括植物樣品）是否受到蔥鱗葡萄孢菌的侵染。
[0015] 本發(fā)明技術(shù)方案包括：設(shè)計(jì)開發(fā)特異性檢測(cè)蔥鱗葡萄孢菌的特異性引物，蔥鱗葡 萄孢菌檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用。本發(fā)明檢測(cè)方法中，在一具體實(shí)施方案中包括如下步驟：
[0016] (1)設(shè)計(jì)蔥鱗葡萄孢菌特異性引物：
[0017] 上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO. 1);
[0018] 下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDΝ0· 2)。
[0019] (2)CTAB法提取待測(cè)樣品的DNA
[0020] a)取幼嫩菌絲0. 05g于研缽中，充分研磨破碎后，加入提前預(yù)熱的lmLCTAB提取 液，再將混合液轉(zhuǎn)入2mLEP管中，65°C水浴處理lh;
[0021] b)向EP管中加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（體積比25:24:1)，震蕩混勻后， 12000rpm離心 10min;
[0022] c)取上清液于新的EP管中，依次加入等體積的異丙醇溶液和1/10體積的NaAc， 輕輕上下顛倒，_20°C沉淀30min;
[0023] (1) 12000印111離心1〇111；[11，小心倒去上清液留沉淀，再加入5001]11^75%的乙醇清洗 沉淀；
[0024] e) 12000rpm離心5min，倒去上清，室溫瞭干沉淀；
[0025] f)加入20_30uL無菌水溶解DNA, _20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] CTAB提取液配方（1L):CTAB20g;NaCl81.82g;lMTris-Hcl(pH8.0)100mL; 0. 5MEDTA(pH8. 0)40mL，蒸餾水定容至 1L。
[0027] (3)?〇?擴(kuò)增：反應(yīng)體系2(^1，包括商品化的2\1^11(^了39?〇?11^1(^1，0嫩 10-20ng，上下游引物各0. 5μ1，ddH20補(bǔ)齊值20μ1。PCR擴(kuò)增條件為：第一循環(huán)94°C預(yù)變 性5min;第二循環(huán)94°C變性30sec，60°C退火30sec，72°C延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；第三循 環(huán)72°C終延伸7min。
[0028] (4)?0?產(chǎn)物6以1，2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓90￥，4〇1^11，凝膠成像儀觀察并拍照， 在301bp處出現(xiàn)條帶，貝lj說明該病原菌為B.squamosa。
[0029] 本發(fā)明還提出了一對(duì)用于特異性檢測(cè)蔥鱗葡萄孢菌的引物，所述引物如以下SEQ IDΝα1 和SEQIDΝα2 所示：
[0030]上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO.1);
[0031]下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDNO. 2)。
[0032] 本發(fā)明主要提出了用于特異性檢測(cè)蔥鱗葡萄孢菌的檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒包含 如以下SEQIDN0. 1、SEQIDN0. 2所示的引物：
[0033]上游引物 5' -CTCCGAGGAATGTAGCAATG-3'（SEQIDNO.1);
[0034]下游引物 5'-CTCAAAGGCCAACCATACAG-3'（SEQIDNO. 2)。
[0035] 所述試劑盒還進(jìn)一步包括：
[0036]PCR反應(yīng)體系；其中，所述PCR反應(yīng)體系20μ1包括：2XTiandzTaqPCRmix 10μ1，待測(cè)樣品的DNA10-20ng，上下游引物各0. 5μ1，ddH20補(bǔ)齊至20μ1。
[0037] 所述試劑盒還進(jìn)一步包含：CTAB提取DNA緩沖液、酚-氯仿-異戊醇（體積比 25:24:1)、異丙醇、NaAc溶液，乙醇溶液（75% )。
[0038] 本發(fā)明還提出了將所述檢測(cè)方法應(yīng)用于對(duì)蔥屬類蔬菜作物主要病原菌蔥鱗葡萄 孢菌快速檢測(cè)診斷中。
[0039] 本發(fā)明有益效果包括：利用一對(duì)特異性PCR引物，通過基本的PCR操作，利用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的有無，鑒定侵染蔥屬類致病菌B.squamosa，相比于對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行病原菌的分 離、純化、鑒定的現(xiàn)有傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明提供的快速、簡(jiǎn)便檢測(cè)B.squamosa方法的優(yōu)點(diǎn) 包括：（1)周期短：傳統(tǒng)方法從對(duì)病原菌的分離純化和培養(yǎng)，到對(duì)病原菌生物學(xué)特性的分析 鑒定，至少需要耗時(shí)3~7天，而本方法從DNA提取，到PCR和電泳檢測(cè)，可在1天之內(nèi)完 成。（2)簡(jiǎn)便易行：用傳統(tǒng)方法進(jìn)行蔥鱗葡萄孢菌鑒定，需要工作人員具備非常特殊的植物 病理學(xué)、微生物培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)分析等方面的專業(yè)知識(shí)，且步驟繁瑣，而本方法僅需具備普通 的分子生物學(xué)技術(shù)基礎(chǔ)就可以完成鑒定工作。（3)鑒定結(jié)果客觀可靠：