快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及鮑魚養(yǎng)殖，具體涉及快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 鮑魚肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，其由于富各種含氨基酸、維生素及人體必需的多種微量 元素和礦物質(zhì)，被譽(yù)為海味八珍之冠。除了營養(yǎng)外，近代醫(yī)學(xué)家也認(rèn)為鮑魚有滋補(bǔ)強(qiáng)壯之 效，有溫補(bǔ)肝腎、益精明目、滋陰清熱、可明目和降血壓，故鮑魚即是豐盛宴席上的美味，也 是食物療法中佳肴，同時有研究表明從鮑魚提取的多糖具有很好的抗腫瘤、提高免疫力等 作用。鮑殼是著名的中藥"石決明"，有平肝潛陽，清肝明目的功效，是治療高血壓，頭昏、肝 硬化的良藥，臨床上常用其代替羚羊角。
[0003] 20世紀(jì)中期鮑魚的自然捕獲量每年僅有200至200噸，70年代廣東省進(jìn)行鮑魚的人 工養(yǎng)殖和幼苗實驗并獲得成功，80年代作為重點推廣性生產(chǎn)，開始被逐步推廣，近幾年來， 隨著鮑魚養(yǎng)殖技術(shù)的日趨成熟，我國鮑魚的人工養(yǎng)殖發(fā)展速度驚人，人工養(yǎng)殖的規(guī)模不斷 擴(kuò)大，已經(jīng)成為世界大型的鮑魚養(yǎng)殖國。
[0004] 隨著鮑魚養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，密集養(yǎng)殖程度日益增強(qiáng)，養(yǎng)殖環(huán)境的逐步惡化，各 種病害頻繁發(fā)生，如膿鮑病、"掉板癥"等，導(dǎo)致許多養(yǎng)鮑場嚴(yán)重虧損甚至倒閉，成為制約鮑 魚養(yǎng)殖業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的重要制約因素，其中，病原微生物被認(rèn)為是導(dǎo)致養(yǎng)殖鮑魚高死亡率 的重要因素鮑魚養(yǎng)殖遇到的各種病害，如大連地區(qū)1993年夏季發(fā)生了河流弧菌引起皺紋盤 鮑的"膿鮑病"；2000年東山縣爆發(fā)性流行鮑病由溶藻弧菌和副溶血弧菌共同作用導(dǎo)致； 2006年周晶等人研究發(fā)現(xiàn)溶藻弧菌是導(dǎo)致南方雜色鮑幼苗大規(guī)模死亡(業(yè)內(nèi)稱之為"掉板 癥"）的致病菌;2011年王智等人從九孔鮑苗病體上分離出的病原菌為溶藻弧菌。
[0005] 結(jié)合以往的報道和研究發(fā)現(xiàn)，鮑魚細(xì)菌性疾病多數(shù)由溶藻弧菌、副溶血弧菌和河 流弧菌引起，而且，有些細(xì)菌如副溶血弧菌還可以導(dǎo)致人類的疾病。因此，如何快速檢測鮑 魚養(yǎng)殖環(huán)境中的高致病病原微生物對于鮑魚的人工養(yǎng)殖具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中的高致病病原微生 物的問題。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種快速檢測鮑魚養(yǎng)殖 環(huán)境中高致病病原微生物的方法，包括以下步驟：
[0008] 確定鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中存在治病風(fēng)險且需及時處理，以及無治病風(fēng)險需但進(jìn)一步監(jiān) 測的菌限值；
[0009] 收集鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境水樣，并提取所收集水樣中全部病原菌DNA;
[0010]利用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種特定引物對樣品中病原菌的總DNA進(jìn) 行熒光定量PCR測定，獲得所收集水樣中是否存在上述三種病原菌或者病原菌總量是否超 過設(shè)定的菌限值，以此判斷所收集水樣是否存在病原微生物的威脅。
[0011] 在上述方法中，用于檢測溶藻弧菌的引物為：
[0012] F-引物，5-GTCGGATTCAAGAGTCGGTATT-3;
[0013] R-引物，5-TAACCCGCGCGTAAGTATAAG-3;
[0014] 片斷長度Amplicon Length = 136bp;
[0015] 解鏈溫度Tm = 60;
[0016] 用于檢測河流弧菌的引物為：
[0017] F-引物，5-CTCAAGCCATCTCAACCCTAC-3;
[0018] R-引物，5-CGGTCGCGATCAACTGATAA-3;
[0019] 片斷長度Amplicon Length = 102bp;
[0020] 解鏈溫度Tm = 60;
[0021] 用于檢測副溶血弧菌的引物為：
[0022] F-引物，5-CTGATAACTTGCCGGACGATAC-3;
[0023] R-引物，5-GTTTGCCACGCGAATGTAATC-3;
[0024] 片斷長度Amplicon Length = 101bp;
[0025] 解鏈溫度Tm = 60。
[0026] 在上述方法中，利用鮑魚在養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌半數(shù)致死量的測定結(jié)果，確定鮑魚養(yǎng) 殖環(huán)境中存在治病風(fēng)險且需及時處理，以及無治病風(fēng)險需但進(jìn)一步監(jiān)測的菌限值。
[0027]
[0028]在上述方法中，提取水樣中全部微生物的DNA的方法如下：
[0029] 使用10um無菌濾膜將收集到的鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境的水樣過濾，去除固體雜質(zhì)及真菌， 再利用〇 · 22um無菌濾膜過濾水樣，把水樣中的細(xì)菌微生物全部固定在0 · 22um濾膜上；
[0030] 收集0.22um濾膜，用無菌剪刀剪碎置放入50ml無菌離心管中，添加生理鹽水，充分 振蕩，然后收集濾膜上的微生物；
[0031 ]反復(fù)凍融及溶菌酶溶解細(xì)胞壁，并利用SDS和蛋白酶K變性蛋白質(zhì)破壞細(xì)胞膜，利 用CTAB除掉多糖，最后通過酚/氯仿/異戊醇抽得到樣本微生物總DNA，室溫干燥后溶于30yL 去離子水中，并置于_20°C備用。
[0032]在上述方法中，對樣品中病原菌的總DNA進(jìn)行熒光定量PCR測定的具體方法如下： [0033]將獲得的溶解DNA作為模板，選用溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌特 定引物進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增；
[0034] PCR反應(yīng)體系如下：
[0035] 8 · 5ul蒸饋水，SYBR Green Realtime PCR Master 12 · 5ul，濃度50ng/ul的引物各 lul，濃度50ng/yL的2yL DNA模板共25ul;
[0036] PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性lmin，94°C變性30s，60°C退火30min，72°C延伸30s，循 環(huán)40次，最后72°C延伸補(bǔ)平5min終止反應(yīng)。72°C到95°C，每升高0.5°C檢測一次熒光信號，繪 制溶解曲線，測得三種病原菌的含量。
[0037] 在上述方法中，針對熒光定量PCR測定結(jié)果，采取的措施如下：
[0038]測定結(jié)果顯示水樣中不存在溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌，則無 需消毒處理；
[0039] 測定結(jié)果顯示水樣中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌中的任一種 超過菌限值，存在對鮑魚有治病風(fēng)險，則需及時消毒處理；
[0040] 測定結(jié)果顯示水樣中的溶藻弧菌、河流弧菌和副溶血弧菌三種病原菌中的任一種 超過菌限值，但對鮑魚無治病風(fēng)險，則需進(jìn)一步監(jiān)測。
[0041] 本發(fā)明，針對三種致病病原菌設(shè)計特異引物，熒光定量PCR結(jié)果可以直接反應(yīng)該致 病菌，無需向16sRNA序列分析方法那樣需要測序進(jìn)行比對，更節(jié)省時間，從養(yǎng)殖場取樣到得 出結(jié)果只需四小時。使得，養(yǎng)殖廠可快速在疾病發(fā)病前期做出正確處理，避免鮑魚受到該三 種病原菌病害，減少損失。養(yǎng)殖廠也可在致病菌剛剛出現(xiàn)期向鮑魚養(yǎng)殖水樣中添加益生菌， 抑制致病菌的生長，維持水樣中微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定，減少消毒劑或者抗生素的使用，避免養(yǎng) 殖中環(huán)境污染，為低碳養(yǎng)殖、生態(tài)養(yǎng)殖打下基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0042]圖1為本發(fā)明的流程示意圖。
【具體實施方式】
[0043] 本發(fā)明提供了一種快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法，從養(yǎng)殖場 取樣到得出結(jié)果只需四小時，能迅速對水樣中是否存在三種治病病進(jìn)行定量檢測，養(yǎng)殖廠 可根據(jù)檢測結(jié)果快速做出判斷，在鮑魚發(fā)病前期做出正確處理，可保護(hù)鮑魚養(yǎng)殖廠免受三 種病原菌的災(zāi)害，減少損失。養(yǎng)殖廠也可在致病菌剛剛出現(xiàn)時向鮑魚養(yǎng)殖水樣中添加益生 菌，抑制致病菌的生長，維持水樣中微生物系統(tǒng)的穩(wěn)定，減少消毒劑或者抗生素的使用，避 免養(yǎng)殖中環(huán)境污染，為低碳養(yǎng)殖、生態(tài)養(yǎng)殖打下基礎(chǔ)。下面結(jié)合說明書附圖和【具體實施方式】 對本發(fā)明做出詳細(xì)的說明。
[0044] 如圖1所示，本發(fā)明提供的快速檢測鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境中高致病病原微生物的方法，包 括以下步驟：
[0045] 步驟10 :利用鮑魚在養(yǎng)殖環(huán)境中細(xì)菌半數(shù)致死量的測定結(jié)果，確定鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境 中存在治病風(fēng)險且需及時處理，以及無治病風(fēng)險需但進(jìn)一步監(jiān)測的菌限值；
[0046] 其中的一種具體實施例如下：
[0047]分別將三種細(xì)菌涂布于2216E海水固體培養(yǎng)基(上海哈靈生物科技有限公司生產(chǎn) 銷售)上，25°C恒溫培養(yǎng)24小時；
[0048]用無菌人工海水將上述三種細(xì)菌的菌苔洗滌下來，制成菌懸液，加入到1L滅菌海 水的燒瓶中，并分別調(diào)整菌體為濃度為l〇3CFU/ml、104CFU/ml、105CFU/ml和106CFU/ml四 種，放入相應(yīng)的1L燒瓶中。
[0049] 其中，CFU表不菌落形成單位(Colony-Forming Units)。
[0050] 剪取藻膜上的鮑魚(皺紋盤鮑），連同藻膜用無菌海水沖洗5次，然后分別放入上述 不同菌體濃度的燒杯中，每種濃度共設(shè)平行樣4個，實驗過程中保持溫度為25°C，不添換海 水，不另外加飼料，觀察鮑魚病變死亡情況。
[0051 ] 觀察時，分別于24h、48h和72h觀察鮑魚活動情況，計算致死率。用Reed Muench法 分別計算24h、和72h的半致死量(LD5Q)。本實施例中，皺紋盤鮑三種致病菌感染半致死量如 下：
[0052]
[0053] 以三種致病菌感染半致死量分別作為鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境的每種病菌的菌限值，當(dāng)水樣 中溶藻弧菌超過2.1 X 104CFU/mL、河流弧菌超過7.0 X 104CFU/mL、副溶血弧菌限度超過4.5 X 104CFU/mL時，必須在24小時內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的消毒處理。同樣，超過上表中72小時的菌限值 時，必須在72小時內(nèi)進(jìn)行相應(yīng)的消毒處理。否則，會引起鮑魚死亡。
[0054]步驟20:利用無菌容器收集鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境的水樣，并使用10um濾膜去除水樣中的 雜質(zhì)及真菌；
[0055]步驟30:利用0.22um濾膜過濾截留水樣中的全部微生物；
[0056]步驟40:利用DNA提取方法，提取水樣中全部微生物的DNA;
[0057] 步驟20-40的具體實施例如下：
[0058]使用10um無菌濾膜將收集到的鮑魚養(yǎng)殖環(huán)境的水樣過濾，去除固體雜質(zhì)及真菌， 再更換0 · 22um無菌濾膜過濾水樣，把水樣中的細(xì)菌微生物全部固定在0 · 22um濾膜上；
[0059]收集0.22um濾膜，用無菌剪刀剪碎置放入50ml無菌離心管中，添加生理鹽水，充分 振蕩