用于篩查脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者的試劑盒及應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明特別涉及一種可用于篩查脊髓性肌萎縮癥的致病基因攜帶者的試劑盒及 篩查方法，屬于基因檢測領域。
【背景技術】
[0002] 脊髓性肌萎縮癥（SMA)，是一種神經(jīng)肌肉疾病，屬于常染色體隱性遺傳病。每6000 名新生兒中就會有1名患有此病。臨床表現(xiàn)為進行性、對稱性的肌肉萎縮及肌無力。目前 為止SMA無特效治療方法，預后主要與疾病的類型有關，I型患者一般生存期在2歲以內， II型患者生存期在5歲以內，而III型患者可存活至成人，其病情進展較慢，最終均死于呼吸 肌麻痹，或全身衰竭。
[0003] 目前發(fā)現(xiàn)的與SMA相關的基因有2個，即神經(jīng)元凋亡抑制蛋白基因（neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP)和運動神經(jīng)元存活基因(survival motoneuron， SMN)。NAIP基因定位于5ql3區(qū)，67%的SMA患者發(fā)生此基因突變，相比之下正常人群中突 變率僅2%。SMN基因也定位于5ql3區(qū)，約98%以上的SMA患者發(fā)生此基因突變。5ql3區(qū) 存在2個SMN等位基因：SMN1和SMN2,只有SMN1基因的純合缺失才會導致SMA，而SMN2基 因的純合缺失則出現(xiàn)在5%的正常人群中，因此作為基于人群范圍的SMA致病基因篩查主 要針對SMN1基因進行檢測即可，也無需對SMN2基因拷貝數(shù)進行檢測。SMN1基因的缺失突 變，可引起脊髓前角運動神經(jīng)元和腦干運動神經(jīng)核變性，最終導致肌無力、肌萎縮。如此高 的攜帶率和發(fā)病率，而目前國內還沒有針對此疾病的攜帶者的臨床篩查。
[0004] 人群中SMA致病基因的攜帶者為1/40~1/50。攜帶者本人不發(fā)病，但是可以傳 給下一代，其配偶如果也是基因攜帶者，則生育患兒的幾率為1/4。通過對SMN1基因的拷 貝數(shù)進行定量檢測，可篩查出95%以上的攜帶者。如果孕婦為攜帶者，則需對丈夫進行該 基因的檢測，如夫妻雙方均為攜帶者，則后代患病概率為1/4,則需在妊娠時進行產前診斷。 所以，通過檢測SMA攜帶者并對其進行婚姻及生育指導，配合產前診斷，就可以從第一胎起 防止重型患兒出生，這不僅降低了本病的發(fā)病率，而且防止了不良基因在群體中播散。
[0005] 現(xiàn)有技術中所采用的SMA基因診斷方法主要有聚合酶鏈反應一限制性片段長度 多態(tài)性分析技術、等位基因特異性擴增、多重連接探針依賴性擴增技術（MLPA)等，但限制 性片段長度多態(tài)性分析技術、等位基因特異性擴增這些技術僅能定性的檢測患者是否存在 SMN1基因純合缺失，不能區(qū)分SMN1致病基因攜帶者。而MLPA雖能夠進行攜帶者檢測，其技 術成本高，儀器要求高，操作復雜，耗時長，不適合大規(guī)模的臨床篩查。
[0006] 雖然諸如 CN 103789440A、CN 103614477A、CN104480206A 等專利還提出了利用熒 光PCR等技術檢測脊髓性肌萎縮癥相關基因突變的方案，但這些技術方案普遍存在準確性 低，可靠性差，成本高而不利于大規(guī)模人群篩查等缺陷。

【發(fā)明內容】

[0007] 針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的主要目的在于提供一種用于篩查脊髓性肌萎縮癥 致病基因攜帶者的試劑盒。
[0008] 為實現(xiàn)前述發(fā)明目的，在本發(fā)明的一實施方案之中提供的一種用于人群范圍篩查 脊髓性肌萎縮癥致病基因攜帶者的試劑盒包括：
[0009] 以SMN1基因exon7為檢測對象而設計的PCR擴增引物和第一 Taqman探針，
[0010] 以及，PCR反應試劑，包括聚合酶及緩沖溶液；
[0011] 其中，所述PCR擴增引物具有：
[0012] SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2 所示序列，
[0013] 或者，相對于SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2的核酸序列有一個或多個堿基缺失、替代 或插入且保留與SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2相同生物活性的核酸序列；
[0014] 所述第一 Taqman探針具有：
[0015] SEQ ID No. 3 所示序列；
[0016] 或者，相對于SEQ ID No. 3的核酸序列有一個或多個堿基缺失、替代或插入且保留 與SEQ ID No. 3相同生物活性的核酸序列。
[0017] 進一步的，所述試劑盒還包括以ALB基因exonl2為檢測對象而設計的內參引物和 第二Taqman探針，所述內參引物具有SEQ ID No. 4、SEQ ID No. 5所示序列，所述第二Taqman 探針具有SEQ ID No. 6所示序列。
[0018] 需要說明的是，在本發(fā)明中，還可以選擇其他表達水平趨于相對穩(wěn)定的管家基因 作為內對照基因，例如 0 _actin(0 -肌動蛋白）、glyceraldehyde-3_phosphate(GAPDH，磷 酸甘油醛脫氫酶）和ribosomal RNA(rRNA，核糖體核糖核酸）。
[0019] 進一步的，所述第一 Taqman探針的一端連接有焚光基團，另一端連接有淬滅基 團。
[0020] 進一步的，所述第二Taqman探針的一端連接有焚光基團，另一端連接有淬滅基 團。
[0021] 其中，所述熒光基團包括FAM、TET或VIC等，但不限于此。
[0022] 其中，所述淬滅基團包括MGBNFQ等，但不限于此。
[0023] 例如，在一些實施例中，所述第一 Taqman探針的序列可以為：
[0024] 5' -VIC-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3'
[0025] 或者，5 ' -FAM-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3 '
[0026] 或者，5 ' -TET-CAGGGTTTCAGACAAA-MGBNFQ-3 '。
[0027] 進一步的，所述PCR反應試劑包括TaqMan通用PCR擴增預混試劑。
[0028] 本發(fā)明的另一重要目的在于提供一種采用前述任一種試劑盒篩查脊髓性肌萎縮 癥基因攜帶者的PCR擴增方法。
[0029] 在一實施例中，該PCR擴增方法可以包括：
[0030] 將受檢樣本（即待檢測的基因樣本）與所述PCR擴增引物、第一 Taqman探針、內 參引物、第二Taqman探針、PCR反應試劑混合形成PCR反應體系，
[0031] 進行PCR擴增反應，包括：
[0032] 第一步變性反應，條件包括：溫度為95°C -97°C，時間為5min-10min ;
[0033] 第二步PCR循環(huán)擴增反應，條件包括：退火和延伸溫度為58-61°C，40個循環(huán)；
[0034] 以及，檢測SMN1基因ex〇n7拷貝數(shù)，從而判別所述基因樣本是否來源于脊髓性肌 萎縮癥基因攜帶者。
[0035] 其中，PCR擴增反應的最佳反應條件包括：
[0036]第一步，50。(：、2111111，95。(：、1〇111111;
[0037] 第二步：95°C、15s，60°C、lmin，40 個循環(huán)。
[0038] 其中，每個樣本可檢測三復孔。
[0039] 進一步的，當計算的相對定量值為1. 7-2. 3之間時，定義為拷貝數(shù)為2,為正常人 (非脊髓性肌萎縮癥基因攜帶者）；當相對定量值為〇. 7-1. 3之間時，定義為拷貝數(shù)為1，為 SMA致病基因攜帶者（脊髓性肌萎縮癥基因攜帶者）；當相對定量值低于0.3時，定義為拷 貝數(shù)為〇,為SMA患者；當相對定量值為2. 5-3. 3之間時，定義為拷貝數(shù)為3時，為SMN1基 因多拷貝正常人。
[0040] 本發(fā)明針對SMN1基因exon7設計引物及探針，利用Taqman探針，檢測脊髓性 肌萎縮癥的基因攜帶者的SMN1拷貝數(shù)的變化，通過分析數(shù)據(jù)，繪制標準曲線來相對定量 SMNlexon7的拷貝數(shù)，從而區(qū)分SMA的攜帶者和非攜帶者。
[0041] 與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果包括：藉由本發(fā)明的試劑盒，能夠快速、方便、 相對定量遺傳病SMA致病基因，且還具有高通量、重復性好、結果準確、可靠性好、成本低等 優(yōu)點，可以大規(guī)模的的用于臨床篩查，例如產前、婚前檢測。
【具體實施方式】
[0042] 以下結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行更具體的說明，但并不是對本發(fā)明技術 范圍的限定。通過本說明書的記載，本領域技術人員可以容易的對本發(fā)明進行修飾/改變， 這些包含在本發(fā)明的技術范圍內。
[0043] 本發(fā)明的一個方面公開了一種用于篩查脊髓性肌萎縮癥基因攜帶者的試劑盒，其 包含PCR擴增引物和第一 Taqman探針，其中所述PCR擴增引物包括
[0044] 引物 SMN1-Ex7-1 :5' -AATGCTTTTTAACATCCATATAAAGCT-3'；
[0045] 引物 SMNl-Ex7-2: :5' -CCTTAATTTAAGGAATGTGAGCACC-3'；
[0046] 第一 Taqman 探針（或稱特異性探針 Ml)為：5' -VIC-CAGGGITTCAGACAAA-MGBN FQ-3'。
[0047] 本發(fā)明的內參引物為表達水平趨于相對穩(wěn)定的管家基因作為內對照基因，例如 0-actin(0-肌動蛋白）、glyceraldehyde-3_phosphate(GAPDH)(磷酸甘油醛脫氫酶）和 ribosomal RNA(rRNA)(核糖體核糖核酸），管家基因ALB基因exonl2等。優(yōu)選的，內參基 因為ALB基因ex〇nl2,其引物和探針序列分別為：
[0048] 內參引物 ALB - 1 :5 ' -ATGCTGCACAGAATCCTTGGT-3 '
[0049] 內參引物 ALB - 2 :5 ' -TCATCGACTTCCAGAGCTGAAA-3 '，
[0050] 第二 Taqman 探針 M2 為：
[0051] 5 ' -FAM-AACAGGCGACCATGC-MGBNFQ-3 '。
[0052] 針對目的基因的引物和探針可以重新設計或者標記不同的熒光染料，序列可以有 單個堿基的差異，序列末端可以標記不同熒光基團和熒光淬滅基團，例如，可優(yōu)選FAM、VIC