一種基于Ms30基因建立的玉米雄性不育系保持和繁殖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一般地，本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及用于恢復(fù)雄性不育玉米育性的育性恢復(fù)基因的構(gòu)建體、包含所述構(gòu)建體的重組載體、以及用所述構(gòu)建體或重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞、轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因玉米制備方法，且由此產(chǎn)生的玉米雄性不育系種子和保持系種子。
【背景技術(shù)】
[0002]作物雜種優(yōu)勢利用和雜交育種技術(shù)是一種提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)、保障國家糧食安全的有效手段。玉米是雜種優(yōu)勢利用的典范，其中雜交育種和制種技術(shù)的關(guān)鍵均在于母本的去雄。人工去雄相對容易，還可以通過機械去雄、化學(xué)殺雄等途徑，但是這些策略也存在一些問題:一方面，這些技術(shù)大大增加了制種的成本，另一方面，因人工去雄的不徹底或不及時，會降低雜交種的純度，造成生產(chǎn)上大面積減產(chǎn)，最終導(dǎo)致很大的經(jīng)濟損失。因此，提高雜交種種子純度是當(dāng)前玉米生產(chǎn)上急待解決的問題，而利用雄性不育系制種是提高雜交種質(zhì)量最為有效的途徑之一。
玉米核雄性不育材料是一種寶貴的種質(zhì)資源，對玉米雜交種生產(chǎn)具有極其重要的意義，但長期以來，由于純合核雄性不育系無法繁殖保持等問題，這類材料在實際生產(chǎn)上幾乎沒有被有效地利用起來。隨著新的核雄性不育材料的不斷發(fā)現(xiàn)，玉米育種家對其進(jìn)行了多方面的研究和利用嘗試，如利用標(biāo)記性狀與不育性的緊密連鎖關(guān)系，開發(fā)了粒色標(biāo)記系統(tǒng)法、黃綠苗連鎖標(biāo)記法和多花絲連鎖標(biāo)記體系等，但是由于標(biāo)記性狀與不育性連鎖不完全、標(biāo)記性狀鑒定困難、鑒定時期滯后等問題，這些方法和嘗試在玉米生產(chǎn)上并沒有得到推廣應(yīng)用。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，部分玉米核雄性不育材料的不育機理逐漸明確，為分子設(shè)計創(chuàng)制穩(wěn)定的玉米不育系奠定了理論基礎(chǔ)。
本發(fā)明旨在將隱性核雄性不育材料的育性恢復(fù)基因表達(dá)元件、抑制雄配子體形成的基因表達(dá)元件、熒光蛋白篩選標(biāo)記基因表達(dá)元件和除草劑抗性基因表達(dá)元件串聯(lián)起來，構(gòu)建高效的玉米多控不育遺傳轉(zhuǎn)化載體，導(dǎo)入相應(yīng)的隱性核雄性不育材料中，獲得玉米雄性不育系的保持系，從而有效地解決玉米隱性核雄性不育系的保持和繁殖問題，以實現(xiàn)高效的不育化雜交育種和雜交制種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種基于堪因的能恢復(fù)雄性不育玉米生育力的多控不育載體(構(gòu)建體)及其應(yīng)用的方法。
本發(fā)明所述的多控不育載體是指用于恢復(fù)雄性不育玉米生育力的遺傳轉(zhuǎn)化載體，其含有多個功能元件(4種不同類型表達(dá)盒的元件)，這些功能元件的組裝和表達(dá)，使轉(zhuǎn)化植株得以可控地(通過雄性育性、種皮顏色和除草劑抗性)用于玉米雄性不育系的繁殖和保持。
本發(fā)明所述的多控不育載體的4種不同類型表達(dá)盒元件，包含玉米雄性育性相關(guān)基因的表達(dá)盒、抑制植物雄配子體形成或功能的表達(dá)盒、除草劑抗性基因表達(dá)盒和顏色標(biāo)記基因表達(dá)盒。
(1)具體地，玉米雄性育性相關(guān)基因的表達(dá)盒中，從上游至下游依次包括雄性器官特異表達(dá)啟動子或組成型表達(dá)啟動子、育性相關(guān)基因和終止子。
進(jìn)一步，上述育性相關(guān)基因即玉米ifeJi堪因。
上述啟動子可以是雄性器官特異表達(dá)啟動子5126、Ms30基因的啟動子或組成型表達(dá)的Ubiquitin啟動子。
5126啟動子是玉米花藥特異性啟動子。
Ubiquitin啟動子來自于玉米多聚泛素蛋白基因(maize poly ubi gene)，由Ubi基因的啟動子區(qū)，5’非翻譯區(qū)和第一內(nèi)含子組成。
(2)抑制植物雄配子體形成或功能的表達(dá)盒中，從上游至下游依次包括花藥或雄蕊器官特異啟動子、抑制植物雄配子體形成或功能的基因以及終止子。
具體地，上述花藥或雄蕊器官特異啟動子可以為Pg47啟動子或Zml3啟動子；抑制植物雄配子體形成或功能的基因為玉米α淀粉酶基因或Dam甲基化酶基因；終止子為Ιη2_1終止子或Pin II終止子。
Pg47和Zml3都是花粉特異性啟動子，Pg47啟動子來自玉米花粉特異性聚半乳糖醛酸酶(Pg47)基因的 5’ 調(diào)節(jié)區(qū)(Allen 和 Lonsdale，Plant J(1993) 3:261-271) ο
玉米α淀粉酶基因，可以是玉米α淀粉酶-1基因，該基因在雄性組織表達(dá)時會導(dǎo)致花粉粒能量來源崩潰，從而遏制花粉發(fā)育。
Dam 甲基化酶基因(Brooks et al., Nucleic Acids Res (1983) 11: 837-851)白勺表達(dá)產(chǎn)物能催化植物DNA中腺嘌呤殘基的甲基化，經(jīng)甲基化的腺嘌呤會影響到細(xì)胞存活。
終止子為In2-1終止子(玉米In2-1基因的終止子)或Pin II終止子(馬鈴薯蛋白酶抑制劑 II 的終止子，An et al., Plant Cell (1989) 1: 115-122)。
(3)除草劑抗性基因表達(dá)盒為35S啟動子驅(qū)動Bar基因的表達(dá)盒，終止子是35S終止子。
35S啟動子來自花椰菜花葉病毒基因組的增強子區(qū)(Franck et al.，Cell(1980)21:285-294)。
(4)顏色標(biāo)記基因表達(dá)盒為由Ltp2啟動子、紅色熒光蛋白DsRed2基因或mCherry基因以及pin II終止子依次串聯(lián)構(gòu)成的表達(dá)盒。
Ltp2啟動子是大麥脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因的啟動子，在種子的糊粉層特異表達(dá)(Kalla etal., Plant J(1994) 6: 849-860)0
上述含多基因表達(dá)盒的構(gòu)建體是以來自pCambia系列載體的pCambia3301 (信息見網(wǎng)址:http://www.cambia.0rg/daisy/cambia)為骨架進(jìn)行依次構(gòu)建的。
利用本發(fā)明所述的構(gòu)建體，本發(fā)明還提供了一種用于保持玉米雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)，并能繁殖玉米雄性不育系的保持系植株的方法，其中還包括鑒定玉米保持系種子和植株的方法。
本發(fā)明提供的獲得上述雄性不育系和保持系的培育方法是將恢復(fù)雄性不育玉米育性的多控不育構(gòu)建體導(dǎo)入目的植物一玉米隱性核不育系中獲得的。
上述導(dǎo)入目的植物的方法是通過花粉管或農(nóng)桿菌導(dǎo)入植物細(xì)胞、愈傷組織、組織或器官中獲得植株。
本發(fā)明所述的用于保持玉米雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)的方法，包含:(a)提供第一植株，所述第一植株包含雄性不育基因的純合隱性等位基因(且所述第一植株是雄性不育的；(b)向上述第一植株中引入權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體以獲得第二植株，所述第二植株只在同源染色體的其中一條染色體上含有所述構(gòu)建體，即所述構(gòu)建體為半合子狀態(tài)；半合子(hemizygote)指的是具有二組相同的染色體組，但有一個或多個基因是單價的，只存在于一個染色體組，另一個染色體組沒有與之相對應(yīng)的等位基因，這種合子稱為半合子。所述第二植株包含與所述第一植株相同的雄性不育基因的純合隱性等位基因，當(dāng)其構(gòu)建體中的玉米雄性育性控制基因康達(dá)時將恢復(fù)第二植株雄性生育力；當(dāng)抑制植物雄配子體形成或功能的基因(如淀粉酶基因或細(xì)胞毒素基因)表達(dá)時，所述第二植株抑制產(chǎn)生攜帶構(gòu)建體的可育雄性配子的形成或功能，從而使得在所述第二植株中只能產(chǎn)生不包含所述構(gòu)建體的可育雄性配子，其基因型為Ms30' (c)用所述第二植株的雄性配子使所述第一植株受精，以保持并產(chǎn)生所述第一植株純合隱性狀態(tài)的后代種子。
本發(fā)明所述的用于繁殖玉米不育系的保持系植株的方法，包含:通過權(quán)利要求21所述的第二植株自花受精，產(chǎn)生50%的含有所述構(gòu)建體的種子(即保持系種子);產(chǎn)生50%的正常不育系種子。
鑒定保持系種子和植株的方法，具體為:將所述第二植株的種子播種后，其產(chǎn)生的花粉作為供體(父本)，與其它正常育性植株(作為母本)雜交，所獲得Fl種子全部是正常顏色種子(非焚光種子)。
將所述第二植株自交后產(chǎn)生的種子在熒光顯微鏡下觀察，具有紅色熒光的種子即為保持系種子。
種植所述第二植株自交后產(chǎn)生的種子，使所述種子長成待鑒定植株，用除草劑噴灑所述待鑒定植株，保持系植株與非保持系植株相比，沒有植物損傷癥狀或具有的損傷癥狀程度更輕。
【附圖說明】
[0004]圖1所示為玉米多控不育載體pMCS3001構(gòu)建流程圖。
圖2所示為玉米多控不育載體pMCS3001的T-DNA區(qū)域圖譜；T_DNA的大小為12，660bp，其中包含4個表達(dá)盒，從T-DNA的左邊界到右邊界分別是除草劑抗性基因Bar的表達(dá)盒，雄性育性恢復(fù)基因Ms30的表達(dá)盒，抑制花粉形成的α淀粉酶基因表達(dá)盒，以及顏色標(biāo)記基因DsRed2的表達(dá)盒。
圖3所示為玉米多控不育載體PMCS3001的質(zhì)粒圖譜。
圖4所示為玉米多控不育載體PMCS3001的酶切鑒定圖；M為I kb plus DNA marker ；I，2，3分別為pMCS3001質(zhì)粒用HindII1、BamHI和BglII進(jìn)行酶切。
圖5所示為玉米多控不育載體pMCS3002、pMCS3003構(gòu)建流程圖。
圖6所示為玉米多控不育載體pMCS3002的T-DNA區(qū)域圖譜；T_DNA的大小為11，906bp，其中包含4個表達(dá)盒，從T-DNA的左邊界到右邊界分別是除草劑抗性基因Bar的表達(dá)盒，抑制花粉形成的表達(dá)盒，雄性育性恢復(fù)基因Ms30的表達(dá)盒以及顏色標(biāo)記基因DsRed2的表達(dá)盒。 圖7所示為玉米多控不育載體PMCS3002的質(zhì)粒圖譜。
圖8所示為玉米多控不育載體PMCS3002的酶切鑒定圖；M為I kb plus DNA marker ；I，2，3分別為pMCS3002質(zhì)粒用HindII1、EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切。
圖9所示為玉米多控不育載體pMCS3003的T-DNA區(qū)域圖譜；T_DNA的大小為13，474bp，其中包含5個表達(dá)盒，從T-DNA的左邊界到右邊界分別是除草劑抗性基因Bar的表達(dá)盒，2個抑制花粉形成的表達(dá)盒(α淀粉酶基因表達(dá)盒和Dam甲基化酶基因表達(dá)盒)，雄性育性恢復(fù)基因Ms30的表達(dá)盒，以及顏色標(biāo)記基因DsRed2的表達(dá)盒。
圖10所示為玉米多控不育載體PMCS3003的質(zhì)粒圖譜。
圖11所示為玉米多控不育載體PMCS3003的酶切鑒定圖；M為1 kb plus DNA marker ；I，2，3分別為pMCS3003質(zhì)粒用HindII1、EcoRI和XbaI進(jìn)行酶切。
圖12所示為多控不育載體(pMCS3001，3002, 3003)的玉米轉(zhuǎn)化流程和植株的再生。圖13所示為多控不育轉(zhuǎn)基因玉米植株的PCR陽性鑒定；M為DL2000 DNA marker，I至22為不同的轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒陽性對照。H2O為水對照。
圖14所示為多控不育轉(zhuǎn)基因玉米植株的RT-PCR檢測結(jié)果；M為DL2000 DNA marker,I至8樣品為隨機取樣的轉(zhuǎn)基因植株。圖A為植株DNA的PCR檢測，圖B、C為I至8樣品的RT-PCR檢測，檢測基因分別為Bar和玉米actin基因。
圖15所示為收獲的轉(zhuǎn)基因玉米植株穗子