一種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒dna的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取和檢測(cè)在植物基因工程研究中是必需的試驗(yàn)，也是在分子 生物學(xué)試驗(yàn)中一項(xiàng)常規(guī)技術(shù)。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)是一種天然的基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。農(nóng)桿菌分為 根瘤農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌。根瘤農(nóng)桿菌中含有腫瘤誘導(dǎo)（T)質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上含有可轉(zhuǎn)移 DNA(T-DNA)區(qū)、毒性區(qū)（Vir區(qū)）以及冠癭堿代謝基因編碼區(qū)。T-DNA兩端是兩個(gè)25bp的 重復(fù)序列，分別稱為左邊界和右邊界，兩個(gè)邊界序列之間是生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素合成基因 以及冠癭堿合成基因。Vir區(qū)中也含有多個(gè)基因段，如FiM、FirB、FirC、VirD.、VirE、VirG、 VirH等，每個(gè)基因段都含有多個(gè)基因。當(dāng)植物受到傷害時(shí)，分泌含有酚類化合物的汁液，這 些酚類化合物一方面通過染色體毒性基因（chvA、chvB等介導(dǎo)的趨化性促使農(nóng)桿菌向植物 受傷部位移動(dòng)并附著于植物細(xì)胞表面；另一方面則被Ti質(zhì)粒上由VirA和VirG組成的雙組 分調(diào)節(jié)系統(tǒng)識(shí)別，從而誘導(dǎo)其他Vir的表達(dá)。VirDl和VirD2共同作用，由T-DNA右邊界開 始向左邊界切割產(chǎn)生一條T-DNA單鏈，并與Vir其它表達(dá)蛋白結(jié)合成復(fù)合體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌 外，然后進(jìn)入細(xì)胞到達(dá)細(xì)胞核內(nèi)并整合到細(xì)胞染色體上。
[0003] 轉(zhuǎn)基因植物在近代工業(yè)、醫(yī)藥業(yè)、特別是農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域的研究和應(yīng)用越來越為 人類所重視。通過農(nóng)桿菌對(duì)植物植株、器官、組織及細(xì)胞的侵染進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，是將外源基 因?qū)肽康闹参锏闹匾椒ㄖ?。將外源基因人為?dǎo)入天然植物中，從遺傳物質(zhì)水平上對(duì) 植物進(jìn)行有目的改造，由此獲得轉(zhuǎn)基因植物，其性狀將按著有利于人們需要的方向發(fā)生改 變。如轉(zhuǎn)基因的抗蟲棉花，通過人們的改造，使棉花在生長(zhǎng)過程中體內(nèi)能夠自主地產(chǎn)生抵抗 害蟲的毒素，以達(dá)到自我保護(hù)、減少農(nóng)藥使用增產(chǎn)增收的目的。
[0004] 為了更好地將外源基因?qū)肽康闹参?，需要研制一種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的方 法。因此研制一種農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA提取的試劑盒對(duì)于外源基因整合到植物基因組中，參與 植物基因調(diào)控表達(dá)具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】
： 本發(fā)明提供一種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的試劑盒，利用該試劑盒可以方便、快速地提取 到農(nóng)桿菌的質(zhì)粒DNA。
[0006] -種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的試劑盒，包括農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)，農(nóng)桿菌細(xì)胞破碎，DNA 吸附柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除，DNA洗脫，具體步驟如下： 農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)：挑取含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株接種到50-100ml YEB液體培養(yǎng)基中， 在恒溫?fù)u床上28-30°C，160-200rpm/h，培養(yǎng)40-48h。吸取2-4ml菌液于5ml離心管中， 10000-13000rpm/min 離心 5-10min，棄上清，保留沉淀。
[0007] 農(nóng)桿菌細(xì)胞破碎：往含有農(nóng)桿菌沉淀的5ml離心管中加入3-4ml Buffer A，漩 禍懸浮菌體后10000-13000rpm/h離心3-5min，棄上清，保留沉淀。往沉淀中加入3-4ml Buffer A,漩禍懸浮菌體后10000-13000rpm/h離心3-5min，棄上清，保留沉淀。往沉淀中 加入0. 4-0. 5ml Buffer B，漩渦懸浮菌體，室溫下靜止10-20min，加入0. 8-lml新配置的 Buffer C，上下顛倒離心管5-10次，室溫下靜止10_20min，加入0.4-lml Buffer D，輕柔顛 倒離心管數(shù)次，使其充分混勻。加入0.2-lml Buffer E，輕柔顛倒離心管數(shù)次，使其充分混 勾，將離心管冰浴5-10min后10000-13000rpm/h離心10_15min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。 加入與上清等體積的Buffer F溶液抽提，10000-13000rpm/min離心5-10分鐘，將上清轉(zhuǎn) 移至新的離心管中。加入與上清等體積的Buffer G抽提，10000-13000rpm/min離心10-20 分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。
[0008] DNA吸附柱吸附DNA以及雜質(zhì)的去除：往離心管中加入兩倍體積的沉淀劑，混勻后 加入DNA吸附柱，10000-13000rpm/min離心l-2min，棄廢液，加入500-600 y 1去蛋白液， 10000-13000rpm/min 離心 l-2min，棄廢液，加入 300-500 y 1 漂洗液，12000-13000rpm/min 離心l-2min，棄廢液，加入500-600 y 1漂洗液，12000-13000rpm/min離心l-2min，棄廢液， 12000-13000rpm/min 離心 l_2min，靜置吹干。
[0009] DNA 洗脫：往吸附柱中加入 30-60 y 1 洗脫液，12000-13000rpm/min 離心 l-2min， 所得液體為農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA。取3-6 yl DNA水溶液，于1-2%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。
[0010] 試劑的配方如下： DNA吸附柱為硅膠模吸附柱，購自北京天恩澤公司。
[0011] YEB液體培養(yǎng)基：5-10g/L牛肉浸膏，5-10g/L胰蛋白胨，l-10g/L酵母提取物， 5-10g/L蔗糖，0. 5-lg/L七水硫酸鎂，用氫氧化鈉調(diào)PH至7. 0-8. 0。
[0012] Buffer A:0. 1-0. 5mol/L 氯化鈉，10-20mmol/L 三羥甲基氨基甲烷（PH = 8-9)， 0? 1-0. 3mol/L 乙二胺四乙酸（PH = 8-9)。
[0013] Buffer B: 50_80mmol/L 葡萄糖，25_50mmol/L 三輕甲基氨基甲燒（PH = 8-9)， 10_20mmol/L 乙二胺四乙酸（PH = 8-9)，2. 5_4mg/ml 溶菌酶。
[0014] Buffer C:0. 2-0. 5mol/L氫氧化鈉，1-3%質(zhì)量體積比的十二烷基硫酸鈉（SDS)，氫 氧化鈉溶液與SDS溶液?jiǎn)为?dú)配置，使用前現(xiàn)配現(xiàn)用，等體積混合即是Buffer C溶液。
[0015] 811打6『0:3-5111〇1/1醋酸鉀，11.5-20%冰醋酸。
[0016] Buffer E:3-5mol/L 乙酸鈉（PH = 4. 8-6)，用冰乙酸調(diào) PH 至 4. 8-6〇
[0017] Buffer F:酸：氯仿：異戊醇的體積比為25:24:1。
[0018] Buffer G:氯仿：異戊醇的體積比為24:1。
[0019] 沉淀劑：70-80 %無水乙醇。
[0020] 去蛋白液：3-61鹽酸胍，10-30禮三羥甲基氨基甲烷〇^8)，口11 = 6.0-7.0，用前 加乙醇，使得乙醇在去蛋白液中的終濃度為30-40 %。
[0021] 漂洗液：20-50mM 氯化鈉（NaCL)，2-5mM 三羥甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 7. 0-8. 0， 80-90%比重?zé)o水乙醇。
[0022] 洗脫液：10-20mM三羥甲基氨基甲烷（Tris)，pH = 8. 0-9. 0。
[0023] 本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)： 農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取和檢測(cè)在植物基因工程研究中是必需的試驗(yàn)，常規(guī)的農(nóng)桿菌質(zhì) 粒提取步驟繁瑣，操作麻煩，一般需要4h左右才能完成農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的提取。本發(fā)明提 供一種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的試劑盒，利用該試劑盒僅需1. 5h即可完成農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的 提取，該試劑盒與常規(guī)提取方法相比不僅節(jié)省了大量時(shí)間，同時(shí)也更加方便、快捷，具有一 定的經(jīng)濟(jì)效應(yīng)。
【附圖說明】
[0024] 圖1為利用本試劑盒提取的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的電泳檢測(cè)圖。 具體實(shí)施例
[0025] 圖1中，泳道1、2均為利用本試劑盒提取的農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA電泳檢測(cè)圖，泳道3為 TAKARA 公司的 DL4500Marker。
[0026] -種提取農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA的試劑盒，具體步驟如下： (1)農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)：挑取含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌株EH105接種到50ml YEB液體培養(yǎng)基 中，在恒溫?fù)u床上28°C，160rpm/h,培養(yǎng)48h。吸取4ml菌液于5ml離心管中，10000rpm/min 離心5min，棄上清，保留沉淀。
[0027] (2)農(nóng)桿菌細(xì)胞破碎：往含有農(nóng)桿菌沉淀的5ml離心管中加入3ml Buffer A，漩 禍懸浮菌體后l〇〇〇〇rpm/h離心3min，棄上清，保留沉淀。往沉淀中加入3ml Buffer A,漩 禍懸浮菌體后l〇〇〇〇rpm/h離心3min，棄上清，保留沉淀。往沉淀中加入0.4ml Buffer B， 漩渦懸浮菌體，室溫下靜止l〇min，加入0. 8ml新配置的Buffer C，上下顛倒離心管5次，室 溫下靜止l〇min，加入0. 4ml Buffer D，輕柔顛倒離心管數(shù)次，使其充分混勻。加入0. 2ml Buffer E，輕柔顛倒離心管數(shù)次，使其充分混勻，將離心管冰浴5min后10000rpm/h離心 10min，將上清轉(zhuǎn)入新的離心管中。加入與上清等體積的Buffer F溶液抽提，13000rpm/min 離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入與上清等體積的Buffer G抽提，1300