芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒、方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及遺傳工程領(lǐng)域，具體設(shè)及芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒、方法和試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 芽胞桿菌(Bacillus)是細(xì)菌的一科，指能形成芽胞（內(nèi)生胞子）的桿菌或球菌，包 括芽胞桿菌屬、芽胞乳桿菌屬、梭菌屬、脫硫腸狀菌屬和芽胞八疊球菌屬等，它們對(duì)外界有 害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣。芽胞桿菌種屬中有許多被美國(guó)FDA認(rèn)定為GRAS (Generally Recognized as Safe)菌株，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品及醫(yī)療等領(lǐng)域都有著重要的應(yīng)用價(jià)值。芽胞 桿菌各屬擁有各自生物學(xué)特性，通過(guò)分子遺傳育種，可W選育出特定功能強(qiáng)勢(shì)的菌種，應(yīng)用 于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)各個(gè)方面。芽胞桿菌基因敲除技術(shù)是研究基因功能的重要手段，利用該技術(shù) 進(jìn)行分子生物學(xué)研究有利于加深對(duì)芽胞桿菌代謝調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)。近年來(lái)隨著大量芽胞桿 菌的基因組數(shù)據(jù)的公布，采用基因工程學(xué)育種的方法改造菌種成為當(dāng)下遺傳育種研究的熱 點(diǎn)，芽胞桿菌遺傳學(xué)研究和代謝工程研究迫切需要一種快速，無(wú)痕和高效的基因敲除和敲 入的載體工具。
[0003] 傳統(tǒng)基因敲除質(zhì)粒載體構(gòu)建方法是將待敲除基因上下游DNA片段和抗性基因片段 分別通過(guò)酶切連接或無(wú)縫克隆的方法整合到基因敲除骨架載體上，其最大的弊端是最終的 敲除菌株的基因組中會(huì)留下抗性基因和其它載體片段，對(duì)該菌株進(jìn)一步的基因敲除和篩選 不利，限定了敲除菌株的應(yīng)用范圍，如帶有外源抗性基因和載體片段的敲除菌株不適合于 食品類(lèi)產(chǎn)品的生產(chǎn)。
[0004] 為了實(shí)現(xiàn)基因的無(wú)痕敲除，更好地篩選發(fā)生同源重組的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，早期的研究 者開(kāi)發(fā)了一系列基于正負(fù)篩選系統(tǒng)的基因無(wú)痕敲除方法。運(yùn)類(lèi)方法一般分為兩步，第一步 采用正篩選標(biāo)記驗(yàn)證敲除載體與基因組發(fā)生了單交換或雙交換，第二步，迫使基因組發(fā)生 第二次同源重組，通過(guò)負(fù)篩選標(biāo)記篩選陽(yáng)性克隆子。常用的正篩選標(biāo)記有：抗生素抗性基 因，黃嚷嶺/鳥(niǎo)嚷嶺轉(zhuǎn)移酶基因，次黃嚷嶺轉(zhuǎn)移酶基因，胸腺喀晚轉(zhuǎn)移酶基因，嚷嶺霉素乙酷 轉(zhuǎn)移酶等。常用的負(fù)篩選標(biāo)記有mazF、upp、blaI、ysbC、hwel、SacB等，其中在芽胞桿菌基因 無(wú)痕敲除中應(yīng)用較多的是mazF (大腸毒性蛋白基因）和UPP (尿喀晚憐酸核糖基轉(zhuǎn)移酶基 因）。來(lái)自于大腸桿菌的毒性蛋白基因 mazF用時(shí)間長(zhǎng)了之后會(huì)累計(jì)產(chǎn)生抗mazF敏感性菌株， 且敲除構(gòu)建載體過(guò)程比較復(fù)雜，mazF的泄漏表達(dá)會(huì)使大腸桿菌致死，使得敲除載體易于發(fā) 生基因突變或缺失。而UPP的應(yīng)用需要首先敲除宿主的內(nèi)源基因，通用性較差，且喀晚類(lèi)似 物5-氣尿喀晚(5FU)的純度和穩(wěn)定性對(duì)陽(yáng)性克隆子的篩選非常大，篩選工作量較大。此外， 運(yùn)類(lèi)敲除質(zhì)粒一般不能在芽胞桿菌中自主復(fù)制，與基因組發(fā)生同源重組多數(shù)情況下是利用 同源雙交換的原理，而且芽胞桿菌的轉(zhuǎn)化效率普遍較低，發(fā)生單交換的效率都比較低，發(fā)生 雙交換的概率更低，鑒定和驗(yàn)證的工作量大，實(shí)際操作過(guò)程比較費(fèi)時(shí)費(fèi)力。
[0005] 此外，利用來(lái)源于金黃色釀脈葡萄球菌的質(zhì)粒PE194中的溫敏型復(fù)制子構(gòu)建的敲 除質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)芽胞桿菌中基因的無(wú)痕敲除也有成功的例子(Qi G，Kang Y，Li L，Xiao A， Zhang S, Wen Z, Xu D, Chen S, Deletion of meso-2,3-butanediol Dehydrogenase Gene budC for Enhanced D~2, 3- butanedio1 Production in Bacillus 1;[油6]11;1!'〇1'11113,6;[016油]1〇1.6;[(^6111,2014,7:16).運(yùn)類(lèi)敲除質(zhì)粒能夠在芽胞桿菌中 復(fù)制，而且能通過(guò)升高溫度脅迫敲除質(zhì)粒與基因組發(fā)生同源單交換，增加了與基因組發(fā)生 同源重組的概率。但發(fā)生同源單交換的菌株在篩選同源雙交換時(shí)只能依靠重復(fù)序列的自發(fā) 重復(fù)剪接，效率比較低，篩選工作量大，周期長(zhǎng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中基因敲除或敲入概率低、篩選鑒定和驗(yàn)證工作量大、成功率 低、周期長(zhǎng)等問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一 種用于增強(qiáng)敲除或敲入效率的輔助質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了一種基因敲除或敲入方法。本發(fā) 明還提供了一種基因敲除或敲入試劑盒。
[0007] 本發(fā)明提供的芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒，該質(zhì)粒的基因組中含有： 僅一種正篩選標(biāo)記的抗性基因，該抗性基因的啟動(dòng)子為雙功能啟動(dòng)子； 能在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制子； 能在芽胞桿菌中復(fù)制的溫敏型復(fù)制子； 至少一個(gè)I-Scel酶切位點(diǎn)； 僅一種顯色蛋白基因，該顯色蛋白基因的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子； 所述雙功能啟動(dòng)子是指既能在大腸桿菌中啟動(dòng)基因表達(dá)，也能在芽胞桿菌中啟動(dòng)基因 表達(dá)的啟動(dòng)子。
[0008] 所述的組成型啟動(dòng)子，是指在該類(lèi)啟動(dòng)子控制下，結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)大體恒定在一 定水平上，在不同組織、部位表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。
[0009] 優(yōu)選地，上述芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒中，所述組成型啟動(dòng)子的核巧酸序列 如SEQ ID NO.2~13中的任意一條所示。運(yùn)些啟動(dòng)子均選自芽胞桿菌：如P43 (SEQ ID NO. 2)，Pamy (沈Q ID NO. 3)，PliaG (沈Q ID NO. 4)，PyxiE (沈Q ID NO. 5)，Pcwp (沈Q ID N0.6)，P2(WQIDN0.7)，P5(WQIDN0.8)，PleipA(WQIDN0.9)，PyrkA(WQID NO. 10)，Pveg (沈Q ID NO. ll)，PgsiB (沈Q ID NO. 12)或化巧3Aa (沈Q ID NO. 13)。
[0010] 優(yōu)選地，上述芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒中，所述抗性基因?yàn)榭敲顾鼗?Kan、氯霉素基因 Cm、四環(huán)素基因 Tet、紅霉素基因 Erm或博來(lái)霉素基因化ble。
[0011] 優(yōu)選地，上述芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒中，所述顯色蛋白基因?yàn)榫G色巧光蛋 白基因或紅色巧光蛋白基因，所述紅色巧光蛋白基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 優(yōu)選地，上述芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒中，所述溫敏型復(fù)制子的核巧酸序列 如沈Q ID NO. 14~16中的任意一條所示。
[0013] 其中SEQ ID NO.14的序列來(lái)自祀194質(zhì)粒（源自金黃色釀脈葡萄球菌)的復(fù)制子； SEQ ID NO. 15的序列來(lái)自pWVOl質(zhì)粒（源自乳酸乳球菌）的復(fù)制子;SEQ ID NO. 16的序列來(lái) 自W上兩種質(zhì)粒復(fù)制子的突變形式。
[0014] 本發(fā)明提供的一種輔助質(zhì)粒，用于輔助提高W上任一所述的芽胞桿菌基因無(wú)痕敲 除/入質(zhì)粒的基因敲除或敲入效率，該質(zhì)粒的基因組中含有： 僅一種正篩選標(biāo)記的抗性基因，且該抗性基因 W上任一所述的芽胞桿菌基因無(wú)痕敲 除/入質(zhì)?；蚪M中的正篩選標(biāo)記的抗性基因不同，該抗性基因的啟動(dòng)子為雙功能啟動(dòng)子； 能在芽胞桿菌中復(fù)制的溫敏型復(fù)制子； 能在大腸桿菌中復(fù)制的復(fù)制子； 內(nèi)切酶I-Scel基因； 僅一種顯色蛋白基因，且與芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)粒基因組中的顯色蛋白基因 不同，該顯色蛋白基因的啟動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子； 所述雙功能啟動(dòng)子是指既能在大腸桿菌中啟動(dòng)基因表達(dá)，也能在芽抱桿菌中啟動(dòng)基因 表達(dá)的啟動(dòng)子； 其中，啟動(dòng)內(nèi)切酶I-Scel基因表達(dá)的啟動(dòng)子是芽胞桿菌中的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
[0015] 所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是指在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)的刺激下，該種類(lèi)型的啟動(dòng) 子可W大幅度地提高基因的轉(zhuǎn)錄水平，即其啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的功能需要經(jīng)過(guò)條件誘導(dǎo)。
[0016] 內(nèi)切酶I-Scel是一種由內(nèi)含子編碼的歸位內(nèi)切酶，該內(nèi)含子存在于釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)的線粒體中。
[0017] 優(yōu)選地，上述輔助質(zhì)粒中，所述內(nèi)切酶I-Scel基因的核巧酸序列如SEQ ID NO. 17 所示;輔助質(zhì)粒(溫敏型）中的顯色蛋白基因?yàn)榫G色巧光蛋白基因、紅色巧光蛋白基因、bgaB 基因（顯藍(lán)色）、鄰苯二酪2,3-雙加氧酶顯色標(biāo)志基因 xy化（顯黃色）或酪氨酸酶-黑色素報(bào) 告基因 melM(顯黑色）。
[0018] 輔助質(zhì)粒中的兩種復(fù)制子與芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)?；蚪M中的兩種復(fù)制 子相同。其中溫敏型復(fù)制子核巧酸序列如SEQ ID NO. 14~16任意一條所示。
[0019]優(yōu)選地，上述輔助質(zhì)粒中，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的核巧酸序列如SEQ ID NO. 18~25中 任意一條所示。
[0020] 本發(fā)明提供的一種芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入方法，當(dāng)需要敲除目的基因時(shí)，包括 W下步驟： (1) 分別擴(kuò)增待敲除基因的上、下游同源臂，通過(guò)重疊 PCR方法連接在一起，克隆至W上 任一所述的芽胞桿菌基因無(wú)痕敲除/入質(zhì)?；蚪M，測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化芽胞桿菌，在 含有質(zhì)粒中抗性基因?qū)?yīng)的抗生素培養(yǎng)基上42~44°C條件下培養(yǎng)，并設(shè)置用于檢測(cè)質(zhì)粒中 顯色基因表達(dá)情況的顯色條件，篩選出發(fā)生同源單交換的菌株； (2) 將W上任一所述的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到發(fā)生同源單交換的菌株中，在含有輔助質(zhì)粒中 抗性基因