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一種維吉尼亞鏈霉菌ibl14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法

文檔序號:9744975閱讀:680來源:國知局
一種維吉尼亞鏈霉菌ibl14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域,確切地說是一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組 菌株的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 青霉素是英國人Alexander Fleming 1928年意外發(fā)現(xiàn)地一種毒性低、療效高的抗 生素(許鐘巧.(2005)發(fā)現(xiàn)青霉素.健康博覽,29)。1939年,F(xiàn)leming將歷時(shí)10年培養(yǎng)的菌種 提供給牛津大學(xué)澳大利亞病理學(xué)家弗洛里(Howard Florey)和英國生物化學(xué)家錢恩 化arnest化ain)J940年,他們完成了制備青霉素結(jié)晶體和動物實(shí)驗(yàn)(林蔭.(2007)青霉素 的輝煌往事.科學(xué)24小時(shí),40-42)。1941年,第二次世界大戰(zhàn)爆發(fā),美國政府下達(dá)了大規(guī)模 量產(chǎn)青霉素,W供戰(zhàn)時(shí)之需的艱巨任務(wù),當(dāng)時(shí)的輝瑞公司采用其特有的深罐發(fā)酵技術(shù)完成 了任務(wù),成為了世界上首個(gè)量產(chǎn)青霉素的公司(許鐘巧.(2005)發(fā)現(xiàn)青霉素.健康博覽,29)。 從發(fā)現(xiàn)到量產(chǎn)歷時(shí)14年,臨床首選于G+球菌所致的感染。
[0003] β-內(nèi)酷胺抗生素是具有四元內(nèi)酷胺環(huán)的一大類抗生素,主要代表有青霉素和頭抱 菌素。青霉素具有與細(xì)菌細(xì)胞壁膚聚糖單體中D-丙氨酷-D-丙氨酸相似的結(jié)構(gòu),與其競爭轉(zhuǎn) 膚酶,阻礙膚聚糖的形成,造成細(xì)胞壁的缺損,進(jìn)而起到殺菌作用(于海軍.(2009)β-內(nèi)酷胺 類抗生素作用機(jī)制及頭抱菌素發(fā)展.石家莊職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào).21,12-16)。
[0004] β-內(nèi)酷胺酶是一類破壞β-內(nèi)酷胺環(huán)抗生素酶的總稱。它使β-內(nèi)酷胺環(huán)水解開環(huán)生 成青霉素嚷挫酸,該酶功能的缺失可使得維吉尼亞鏈霉菌IBL14中青霉素得到積累,同時(shí)β-內(nèi)酷胺酶和青霉素酷胺酶水解基因和頭抱菌素代謝支路中的異青霉素-Ν異構(gòu)酶基因的缺 失使得維吉尼亞鏈霉菌IBL14中青霉素的產(chǎn)量得到進(jìn)一步的提高。
[0005] 眾所周知,當(dāng)前青霉素生產(chǎn)的主要菌株是真菌(如:產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum和點(diǎn)青霉化nicillium nota化m),由細(xì)菌維吉尼亞鏈霉菌生產(chǎn)青霉素未見報(bào) 道。
[0006] 近年來,基于CRISPR-Cas系統(tǒng)發(fā)展而來的DNA編輯新技術(shù),成功地應(yīng)用于細(xì)胞染色 體中基因組編輯與改造,在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域中顯示出了巨大的潛力(Doudna, J.A.and Charpentier,E.(2014)The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346)。但到目前為止,廣泛應(yīng)用的CRISPR-Cas系統(tǒng)均為CRISPR-Cas II型系統(tǒng)。
[0007] 維吉尼亞鏈霉菌IBkl4(Streptomyces virginiae IBL14)是本實(shí)驗(yàn)室自行分離 純化得到的一株能降解多種醬體化合物的放線菌。對菌株IBkl4全基因組測序和數(shù)據(jù)庫分 析發(fā)現(xiàn),菌株IBkl4中存在CRISPR-Cas I-SV14B型系統(tǒng)。應(yīng)用維吉尼亞鏈霉菌IBkl4自身 的化S I-SV14B型系統(tǒng)對其生產(chǎn)青霉素的相關(guān)基因進(jìn)行編輯,得到生產(chǎn)青霉素重組菌株未 見報(bào)道。此外,該方法的建立對其他抗生素的生產(chǎn)也具有指導(dǎo)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的 構(gòu)建方法,通過祀向基因與基因編輯模板的設(shè)計(jì)與質(zhì)粒構(gòu)建及祀向基因與基因編輯模板重 組質(zhì)粒在鏈霉菌中的轉(zhuǎn)化操作,對染色體中與產(chǎn)青霉素相關(guān)的基因進(jìn)行編輯。本發(fā)明通過 敲除青霉素水解酶、青霉素酷胺酶及異青霉素-N異構(gòu)酶的基因,從而實(shí)現(xiàn)提高青霉素產(chǎn)量 之目的。
[0009] 采用如下技術(shù)方案:
[0010] -種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法,其特征在于:包括W下 步驟;
[0011] (1)根據(jù)維吉尼亞鏈霉菌IBL14基因組測序數(shù)據(jù),確定β-內(nèi)酷胺酶、青霉素酷胺酶 及異青霉素-Ν異構(gòu)酶Ξ個(gè)祀向基因的DNA序列;
[001引(2)使用Pfu DNA聚合酶通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增得到末端帶削良制性內(nèi)切酶識別切 割位點(diǎn)的,且具有overlap PCR互補(bǔ)序列的祀向基因上、下同源臂的PCR片段;
[0013] (3)利用overlap PCR反應(yīng)將上、下兩個(gè)同源臂結(jié)合構(gòu)建編輯基因模板;
[0014] (4)直接合成首、尾分別包含啟動子J23119和RNA終止子的祀向基因片段;
[001引(5)利刷良制性酶切位點(diǎn)上的粘性末端和連接酶將步驟(3)、步驟(4)獲得的DNA片 段連接到地C1139上得到基因編輯質(zhì)粒;
[0016] (6)在含鏈霉菌的高滲溶液中添加溶菌酶制備維吉尼亞鏈霉菌IBL14原生質(zhì)體;
[0017] (7)將步驟巧)中得到基因編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到維吉尼亞鏈霉菌IBL14原生質(zhì)體中得到 基因編輯后的重組子;
[0018] (8)對重組子染色體進(jìn)行PCR和基因測序分析,確證重組子為基因編輯后的目的重 組菌株,并根據(jù)抑菌圈實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選抗性能力強(qiáng)的目的重組菌株。
[0019] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法,其特征在于:維 吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中β-內(nèi)酷胺酶基因及產(chǎn)青霉素基因具有如表1所描述的核巧酸 序列,其青霉素合成途徑中的異青霉素-Ν異構(gòu)酶的功能缺失導(dǎo)致異青霉素-Ν不能轉(zhuǎn)化為青 霉素 Ν,β-內(nèi)酷胺酶和青霉素酷胺酶的功能缺失導(dǎo)致青霉素不能分別轉(zhuǎn)化為青霉酸和6氨基 青霉燒酸,進(jìn)而共同導(dǎo)致青霉素的積累。
[0020] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法,其特征在于:所 述的構(gòu)建青霉素重組菌株是應(yīng)用維吉尼亞鏈霉菌IBL14中自身的CRISPR-化S I-SV14B型系 統(tǒng)對維吉尼亞鏈霉菌IBL14中主要影響青霉素生產(chǎn)的β-內(nèi)酷胺酶基因、青霉素酷胺酶基因 及異青霉素 -Ν異構(gòu)酶基因進(jìn)行敲除、插入、無痕點(diǎn)突變及任意組合。
[0021] 所述的一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法,其特征在于:該 方法構(gòu)建所得到的維吉尼亞鏈霉菌IBL14重組菌株可直接用于青霉素及其衍生物生產(chǎn)。
[0022] 一種維吉尼亞鏈霉菌IBL14產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法,其特征在于:維吉尼亞 鏈霉菌IBL14染色體中含有水解青霉素的β-內(nèi)酷胺酶(β-lactamase)基因和產(chǎn)青霉素基因 簇、及因此而建立的一種產(chǎn)青霉素重組菌株的構(gòu)建方法。本發(fā)明目的通過W下技術(shù)方案來 實(shí)現(xiàn):
[0023] 所述的維吉尼亞鏈霉菌IBL14染色體中水解青霉素的基因和產(chǎn)青霉素基因簇具有 如表1所描述的核巧酸序列、且酶生產(chǎn)青霉素過程具有如附圖1所示的代謝途徑。
[0024] 有益效果:
[00巧]本發(fā)明首創(chuàng)了維吉尼亞鏈霉菌生產(chǎn)青霉素的途徑;提供了CRISPR-CAS I-SV14B型 系統(tǒng)在鏈霉菌抗生素生產(chǎn)中的應(yīng)用;為CRISPR-CAS I-SV14B型系統(tǒng)在其它抗生素生產(chǎn)菌株 研究中提供了新的方法和技術(shù)選擇。應(yīng)用維吉尼亞鏈霉菌IBL14中的CRISPR-Cas I-SV14B 型基因編輯系統(tǒng)對鏈霉菌遺傳基因進(jìn)行編輯可方便、快速、高效地改變生物體的遺傳特征。 該基因編輯的方法可應(yīng)用于生物制藥、食品、農(nóng)業(yè)及其它生物應(yīng)用領(lǐng)域中。
[0026] 說明書附圖
[0027] 圖1維吉尼亞鏈霉菌IBL14青霉素代謝途徑;異青霉素 -N異構(gòu)酶/EC 5.1.1.17的功 能缺失導(dǎo)致異青霉素 -N不能轉(zhuǎn)化為青霉素 N(penicillin N),β-內(nèi)酷胺酶/EC3.5.2.6的功 能缺失導(dǎo)致青霉素不能轉(zhuǎn)化為青霉酸(penicilloic acid),青霉素酷胺酶/EC3.5.1.11的 功能缺失導(dǎo)致青霉素不能轉(zhuǎn)化為6氨基青霉燒酸
[002引 (6-aminopenicillanic acid),進(jìn)而共同導(dǎo)致青霉素(penicillin)的積累;注:紅 色虛線代表被敲除基因;
[0029] 圖2抑菌圈抗性檢測,其中A表明野生型I化14對大腸桿菌D冊α無抑制;B表明敲除 后的重組子對大腸桿菌Μ15α有抑制。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 為了更充分理解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容,下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作 進(jìn)一步介紹和說明,旨在更好的解釋本發(fā)明的內(nèi)容,W下實(shí)施例不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。 此外,在所列實(shí)施例中如無特別說明均采用如下材料:
[003。 1)菌種
[0032] 宿主為Str邱tom
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