β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物工程的技術領域，具體說是一種β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法。
【背景技術】
[0002] β-胡蘿卜素分子式為C4QH55,是合成維生素 Α的前體物質，是一種抗氧化劑，具有解 毒作用，是維護人體健康不可缺少的營養(yǎng)，在抗癌、預防心血管疾病、白內(nèi)障及抗氧化上具 有顯著的功能，并進而防止老化和衰老引起的多種退化性疾病。
[0003] 目前生產(chǎn)β_胡蘿卜素的方法主要有植物提取法，化學合成法，微生物發(fā)酵法。植物 提取法是指從胡蘿卜等富含胡蘿卜素的植物中提取胡蘿卜素，化學合成法是以化學原料 化學法合成胡蘿卜素。微生物發(fā)酵法是指以三孢布拉氏霉，杜氏海藻，酵母等微生物發(fā)酵 生產(chǎn)β-胡蘿卜素。其中，以三孢布拉氏霉發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素最具工業(yè)應用前景。
[0004] 三孢布拉氏霉屬于霜霉目，白銹科，拉丁名是Blakeselea trispora，有性無性繁 殖，有(+)()兩種接合型，即正負兩種菌株，單獨的(+)或（）菌發(fā)酵產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力很低， 低于45!^/1。（+)、（）菌株在PDA平板上形成白色菌落，沒有明顯的產(chǎn)色素能力。
[0005] 正負菌株按不同比例混合后發(fā)酵，會產(chǎn)生較多的β-胡蘿卜素。其中，正負菌株按1:4 混合后產(chǎn)量最高，達到了 350mg/L。
[0006] 三孢布拉氏霉在平板上生長呈蔓延狀，菌絲生長快，較難挑取純菌落。在培養(yǎng)基中 添加0.05%的0P乳化劑，限制菌絲蔓延，獲得較規(guī)則的菌落，便于挑取得到較純菌株。
[0007] US7252965B2公開了一種利用六十細胞儀來篩選β-胡蘿卜素高產(chǎn)菌種的方法。將 孢子懸液經(jīng)紫外線照射后，用流式細胞儀來處理誘變后的孢子液。通過分析孢子產(chǎn)生的特 定熒光強弱，來判斷其產(chǎn)β-胡蘿卜素能力的大小。熒光越強，生產(chǎn)能力越強。利用這種方法， 篩選到了 一株高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量達到9g/L。
[0008] CN104805167A公開了一種生產(chǎn)β-胡蘿卜素的方法及其基因工程菌。其中包括以下 步驟:培養(yǎng)大腸桿菌基因工程菌，從發(fā)酵液中獲得β-胡蘿卜素，所述的大腸桿菌基因工程菌 是含有外源的含四個胡蘿卜素合成基因的表達載體的大腸桿菌，該四個胡蘿卜素合成基 因分別是：crtE、crtI、crtB和crtY，并且，所述的大腸桿菌基因工程菌還含有含四個ΜΕΡ途 徑基因的表達載體，該四個MEP途徑基因分別是:dxs、i d i、i spD和i spF。本發(fā)明過表達MEP途 徑中的4個酶，構建不同強度啟動子的ΜΕΡ途徑，從而提高β-胡蘿卜素的產(chǎn)量。
[0009] CN101096355-種從胡蘿卜中提取天然β-胡蘿卜素的方法，公開了一種從新鮮胡蘿卜 中提取天然β-胡蘿卜素的工藝。所述的方法是新鮮胡蘿卜經(jīng)過絞汁以后，倒入高壓均質機中 均質，均質后的胡蘿卜濃汁中加入沉淀劑CaC12 · 2Η20和穩(wěn)定劑氨水/乙醇，經(jīng)過離心，棄去 上清液，得到橙紅色沉淀;將沉淀經(jīng)過冷凍干燥機冷凍干燥，得到粉末狀干燥的沉淀，在沉 淀中加入有機溶劑石油醚萃取其中的β-胡蘿卜素，之后旋轉蒸發(fā)濃縮，回收有機溶劑，得到 胡蘿卜素油狀物。所提得的胡蘿卜素純度達90%，提取量達180mg/100g，提取率可達80% 以上。該法具有工藝新穎，操作簡單，成本低等特點，對研究開發(fā)從新鮮胡蘿卜中提取天然β-胡蘿卜素具有很高的參考價值。
[0010] CN1558953公開了三孢布拉霉的β-胡蘿卜素的生物合成基因，其編碼番茄紅素環(huán) 化酶/八氫番茄紅素合酶（carRP)和八氫番茄紅素脫氫酶（carBhcarRP基因，其特征在于 DNA序列SEQ ID N0:1，編碼氨基酸序列SEQ IDN0:3,其具有番茄紅素環(huán)化酶/八氫番茄紅素 合酶活性。carB基因，其特征在于DNA序列SEQ ID N0:2,編碼氨基酸序列SEQ ID N0:4,其具 有八氫番茄紅素脫氫酶活性。本發(fā)明還涉及（i)構建表達附加拷貝的所述基因的質粒的方 法和（ii)在所述基因的啟動子控制下表達異源基因的方法。
[0011] CN103951600A-種提取鹽藻中β-胡蘿卜素的方法，公開了一種提取鹽藻中的β-胡 蘿卜素的方法，包括步驟有：（1)將鹽藻泥或鹽藻粉與蒸餾水以質量比1:5的比例充分混合， 以鹽酸調節(jié)pH值至5-6.5;(2)將蛋白酶與上述鹽藻液按質量比1:33.3~54.5混合后充分溶 解，保溫、鈍化；（3)將提取液經(jīng)離心后取沉淀；（4)將沉淀與植物油以質量比1:5的比例混合 后加熱、保持、靜置冷卻，過濾得油溶液。本發(fā)明方法采用添加少量的蛋白酶即可以起到破 壞細胞膜的作用，操作簡便，節(jié)省了成本，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，同時省去了提純后需 要再用油懸浮的工藝，本方法環(huán)境友好，可大規(guī)模推廣使用。
[0012]上述方法中，植物法提取具有消耗原材料多，成本高，受原料影響較大等缺點。化 學合成法會合成對人體有害的中間產(chǎn)物，且不易分離。因此，微生物發(fā)酵法具有更廣闊的應 用前景。而三孢布拉氏霉具有菌體生長快，生長條件要求低，胡蘿卜素含量較高等優(yōu)點，最 具前景。三孢布拉氏霉因其菌種的特殊性，用基因工程技術改造菌株難度較大，因此，較好 的改造方法還是選用誘變篩選的方法。一般的篩選方法盲目性較大，原理模糊，篩選工作量 大，效率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013 ]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種β_胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法。
[0014] 本發(fā)明為解決公知技術中存在的技術問題所采取的技術方案是： 本發(fā)明的胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法，在PDA培養(yǎng)基中添加三孢酸，生成篩選培養(yǎng) 基;將三孢布拉氏霉的菌株制備為孢子懸液，并對孢子懸液進行紫外誘變;將誘變后的孢子 于篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)并形成菌落，挑取顏色深于出發(fā)菌株的菌落即為目的菌落。
[0015] 本發(fā)明還可以采用以下技術措施： 按篩選培養(yǎng)基質量的〇. 05%向篩選培養(yǎng)基中加入0P乳化劑。
[0016] PDA培養(yǎng)基內(nèi)加入的三孢酸為三孢酸粗提物溶液，其制備過程為:將三孢布拉霉出 發(fā)菌株的正負菌株按1:4比例混合，在發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵6天，得到發(fā)酵液;取100ML發(fā)酵液 并用稀鹽酸調至pH2.0,然后7000r/min，離心10min后，留取上清溶液;在上述上清溶液中， 加入等體積氯仿，震蕩萃取，分液，保留氯仿層；向氯仿層中加入相同體積的4%NaHC0 3溶液 萃取，留取NaHC03層;再將上述溶液的pH用稀鹽酸調至2.0，加入相同體積氯仿，充分震蕩， 萃取;將氯仿層旋轉蒸干，得到三孢酸粗提物;三孢酸粗提物溶于100ML蒸餾水中，-20°C保 藏。
[0017] 發(fā)酵培養(yǎng)基中按質量百分比包括以下組分：玉米淀粉3.0%，黃豆餅粉2.0%， KH2PO4 0.25%，MgS〇4.7H20 0.02%，，豆油 3.0%，工業(yè)玉米漿 2.0%，VBi0.005%，檸檬酸三鈉 0.3%，曲拉通100 0.1%，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚0.05%卬!1值自然。
[0018] 按PDA培養(yǎng)基質量的1%向PDA培養(yǎng)基內(nèi)添加三孢酸粗提物溶液。
[0019] 按PDA培養(yǎng)基質量的2%向篩選培養(yǎng)基中添加瓊脂粉，并于121°C滅菌20min。
[0020] PDA培養(yǎng)基的制備方法為，將土豆去皮，切成丁狀，稱取200g加入適量水中，煮沸 20min，用8層濾布過濾取清液，定容至1L，加入20g葡萄糖，瓊脂粉20g，加熱融化后，分裝至 試管中，每只試管裝液6-8mL，121°C滅菌20min后，即得PDA培養(yǎng)基。
[0021 ]將保藏的三孢布拉霉正負菌株取出，挑取少量菌體，涂于PDA培養(yǎng)中，27°C培養(yǎng)6-8 天，待孢子成熟后，保藏于4°C ;將正負菌孢子用無菌生理鹽水洗下，用血球計數(shù)板計數(shù)后， 稀釋至106個/mL;正負菌株按照1:4的比例，相對發(fā)酵培養(yǎng)基體積10%的比例接種于100mL發(fā) 酵培養(yǎng)基中，27 °C，220r/min，6天，獲得菌體及發(fā)酵液;制備孢子液，取5mL孢子液于放有轉 子的平板中，將平板置于磁力攪拌器上，轉動中紫外照射4min，取O.lmL的處理后孢子液涂 布于篩選培養(yǎng)基上，生長2-4天，挑取目的菌落。
[0022] 本發(fā)明具有的優(yōu)點和積極效果是： 本發(fā)明的胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法中，在PDA培養(yǎng)基中添加三孢酸，刺激菌體生 產(chǎn)胡蘿卜素，從而使菌落在篩選培養(yǎng)基上形成黃色菌落。經(jīng)過誘變處理后的菌體，會因為 生產(chǎn)β-胡蘿卜素能力不同而形成顏色深淺不一的菌落。菌落的黃色越深，代表其生產(chǎn)β-胡蘿 卜素能力越強。從黃色較深的菌落中挑選菌落為高產(chǎn)胡蘿卜素菌株，目的性強，可以大大提 高篩選效率，減少篩選所用時間及工作量。
【具體實施方式】
[0023] 以下通過實施例對本發(fā)明的技術方案進行詳細說明。
[0024]本發(fā)明的β_胡蘿卜素高產(chǎn)菌株的篩選方法，在PDA培養(yǎng)基中添加三