一株產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)的真菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，具體涉及一株代謝產(chǎn)物具有抗植物病毒活性的真菌菌株 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物病毒病具有危害大、防治難的特點(diǎn)，煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)是正單鏈植物病毒的模式病毒，是植物病毒抑制物篩選最常用的靶標(biāo)。目前，生產(chǎn)上對(duì) 植物病毒病防治效果好的藥物還很少，因此，以TMV為靶標(biāo)，從自然界中篩選出天然抗病毒 活性物質(zhì)，進(jìn)而研制出安全、高效的新型抗病毒劑具有廣闊的應(yīng)用前景。細(xì)交鏈孢菌酮酸 (tenuazonic acid)是鏈格孢菌產(chǎn)生的一種小分子活性物質(zhì)，研究表明細(xì)交鏈孢菌酮酸具 有抗腫瘤、抗細(xì)菌和抗人體病毒等多種生物活性，其在低濃度時(shí)，還具有誘導(dǎo)植物對(duì)蚜蟲(chóng)的 抵抗作用。本發(fā)明采用組織塊分離法，從臭椿的葉片中分離到1株發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)TMV具有較好 抑制效果的內(nèi)生真菌菌株FJA14,該菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為鏈格孢菌，通過(guò)對(duì)該 菌的大量發(fā)酵培養(yǎng)，我們從發(fā)酵液中分離到對(duì)TMV具有抑制作用的活性物質(zhì)細(xì)交鏈孢菌酮 酸。發(fā)酵工程可為具有潛在價(jià)值的微生物創(chuàng)造良好的生長(zhǎng)、繁殖條件，并能進(jìn)行大規(guī)模的培 養(yǎng)，其在生物制藥領(lǐng)域顯現(xiàn)出了巨大的潛力，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益、社會(huì)效益和生態(tài)效益。 綜上所述，篩選可產(chǎn)抗病毒活性代謝物質(zhì)的真菌，通過(guò)發(fā)酵工程大量生產(chǎn)抗病毒活性物質(zhì)， 是新型、安全、高效抗病毒劑研制最經(jīng)濟(jì)有效的途徑，具有很好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一株代謝產(chǎn)物具有抗植物病毒活性的真菌菌株及其應(yīng)用， 通過(guò)從菌株發(fā)酵液中提取分離抗病毒活性物質(zhì)，并將其研制成天然源抗植物病毒劑，具有 很好的應(yīng)用前景。
[0004] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 本發(fā)明首先提供了一株具有抗植物病毒活性的菌株，該菌株為鏈格孢(Altemaria altemata)FJA14,已于2015年06月05日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 登記保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 10902,地址為北京朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院。
[0005] 其次，本發(fā)明還保護(hù)了所述的具有抗植物病毒活性的菌株在制備病毒病防治制劑 中的應(yīng)用。
[0006] 更詳細(xì)地，所述的病毒病是由煙草花葉病毒引起的植物病毒病。將所述菌株培養(yǎng) 發(fā)酵后，獲取發(fā)酵液提取物，從中進(jìn)一步分離提取到抗病毒活性物質(zhì)，用于制備植物病毒病 的防治制劑。
[0007] 所述抗病毒活性物質(zhì)的制備方法，具體步驟如下： (1)將鏈格孢(Altemaria altemata)FJA14純菌種接種于PDA平板培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)5 ~7 d; (2)用直徑4 mm的無(wú)菌打孔器于培養(yǎng)的菌落邊緣打取菌餅，取4~6片菌餅置于裝有100 mL PDB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，28 °C、130~150 r/min搖床振蕩培養(yǎng)4~5 d作為種子 液；（3)將種子液按5%~10%的接種量接入裝有培養(yǎng)基的三角瓶中，28 °C、110~130 r/ min搖床振蕩培養(yǎng)15~25 d，得到發(fā)酵液。
[0008] (4)將發(fā)酵液過(guò)濾后的濾液經(jīng)D101大孔樹(shù)脂柱層析吸附，先用3~4個(gè)柱體積的水 洗脫，再用2~4個(gè)柱體積的甲醇洗脫，收集醇洗脫液，減壓濃縮至膏狀，得膏狀物。
[0009] (5 )膏狀物用質(zhì)量體積比為1:10~15的蒸餾水充分懸浮，懸浮液用乙酸乙酯萃取4 ~5次，合并乙酸乙酯萃取液，減壓濃縮去除溶劑即為FJA14發(fā)酵液提取物。
[0010] (6)發(fā)酵液提取物用少量甲醇充分溶解，溶解后的溶液經(jīng)Sephadex LH-20柱層析 分離，以甲醇為洗脫劑，對(duì)分離得到的各組分進(jìn)行薄層層析分析和抗病毒活性跟蹤指導(dǎo)，取 抗病毒活性最好的組分以氯仿-甲醇(8:2)為洗脫劑進(jìn)行硅膠柱層析分離，對(duì)分離得到的各 組分進(jìn)行薄層層析分析和抗病毒活性跟蹤指導(dǎo)，可分離出抗病毒活性物質(zhì)。
[0011] 本發(fā)明中制備的抗病毒活性物質(zhì)細(xì)交鏈孢菌酮酸可用于防治由TMV引起的植物病 毒病，試驗(yàn)結(jié)果表明細(xì)交鏈孢菌酮酸對(duì)TMV有很好的抑制效果。該活性物質(zhì)與目前生產(chǎn)上使 用的多數(shù)植物病毒抑制劑的有效化學(xué)成分相比有很大的優(yōu)點(diǎn)： 抗病毒效果好； 與環(huán)境友好。細(xì)交鏈孢菌酮酸是植物內(nèi)生真菌鏈格孢菌的代謝產(chǎn)物，來(lái)源于自然界，與 自然環(huán)境相容性好，在自然界中易降解，不污染環(huán)境。
[0012] 細(xì)交鏈孢菌酮酸可通過(guò)微生物發(fā)酵工程大量生產(chǎn)，生產(chǎn)和制備工藝簡(jiǎn)單，便于推 廣應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 為了更好了解本發(fā)明，以下通過(guò)實(shí)施例作進(jìn)一步說(shuō)明，但其絕不對(duì)本發(fā)明的范圍 構(gòu)成限制。
[0014] 實(shí)施例1 一種分離臭椿內(nèi)生鏈格孢菌FJA14的方法 (1)將新鮮的臭椿葉切成0.5 cm X 0.5 cm的小方塊，無(wú)菌水洗凈，用75 %乙醇處理2 min，5.6%的次氯酸鈉溶液處理0.5 min，無(wú)菌水充分沖洗。將小方塊接種于固體PDA培養(yǎng)基 上，22°C下培養(yǎng)7 d; (2)挑取尖端菌絲，于TOA培養(yǎng)基平板上劃線(xiàn)純化分離，置于22°C培養(yǎng)7 d; (3)將純化的菌株轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上28 °C培養(yǎng)5 d，菌落用打孔器打成直徑4 mm的 菌餅，挑起3個(gè)菌餅接種于液體培養(yǎng)基中，于搖床上25 °C，120 rpm振蕩培養(yǎng)8 d后， 發(fā)酵液過(guò)濾后的濾液經(jīng)減壓濃縮制得發(fā)酵液提取物。分別采用半葉枯斑法和葉圓盤(pán)法對(duì)發(fā) 酵液提取物的抗病毒活性進(jìn)行測(cè)定，從中選擇具有抗病毒活性的菌株，鑒定并保存活性菌 株。
[0015]鏈格孢FJA14具有如下生物學(xué)特征： 1.菌落形態(tài)特征:在PDA培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)良好，菌落呈灰白色至暗青褐色，邊緣整齊， 正面和背面均有同心輪紋。
[0016] 2.菌體形態(tài)特征:氣生菌絲初期為淡色，后逐漸變?yōu)榍嗪稚?。分生孢子梗單生或?生，直立或略彎曲，淡褐色，分隔，常分枝。分生孢子呈倒梨形、倒棍棒形、卵形或近橢圓形， 單生或鏈生，深褐色，具有3-8個(gè)橫膈膜，1 -4個(gè)縱、斜膈膜。
[0017] 3.遺傳學(xué)特征:該鏈格孢菌FJA14的ITS序列(570 bp)已提交到美國(guó)國(guó)家生物技術(shù) 信息中心（NCBI)的Genbank基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)