一種火木層孔菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，尤其涉及一種火木層孔菌株及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]桑黃，學(xué)名鮑氏層孔菌，又稱火木層孔菌、桑耳、桑哦、桑臣等。寄生原始森林桑樹之上，隸屬擔(dān)子菌亞門。桑樹桑黃是指寄生于桑樹之上的尤地木層孔菌。多年生，木質(zhì)，耳形或馬蹄形。顏色鮮黃是其一大特點(diǎn)。野生桑黃是近幾年來開發(fā)的提高免疫力最好的藥用真菌。桑黃是一種具有很高藥用價值及廣泛應(yīng)用前景的真菌，目前所知桑黃中的主要活性成分為桑黃多糖。桑黃多糖能夠提高人體的免疫力，抵制癌細(xì)胞，而且還具有其它的食療作用。關(guān)于其效用，整理敘述如下:抑制癌細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移、并用抗癌劑，能夠增強(qiáng)抗癌效果，同時減輕抗癌劑的副作用；緩和疼痛、食欲不振、體重減輕及疲勞倦怠等癌癥特有的癥狀，提尚生活品質(zhì)；可以防癌，避免癌癥復(fù)發(fā);能夠預(yù)防及改善免疫力減退引起的感染癥等各種疾病，有很好的護(hù)肝作用，可用于防治肝硬化、肝腹水。直到近幾十年，這些藥理作用才漸漸得到科學(xué)的解釋，桑黃多糖有刺激體液免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性，因而釋放出很多的免疫刺激產(chǎn)物。另外在桑黃抗炎癥作用方面，桑黃提取物還具有鎮(zhèn)痛作。
[0003]然而當(dāng)今桑黃多糖的生產(chǎn)過程，存在著投入較大，成本較高，桑黃多糖的收率較低，經(jīng)濟(jì)效益不高等問題，阻礙了產(chǎn)品的發(fā)展。專利號為CN101463093公布了一種桑黃多糖的提取方法，用桑黃切片、高壓水煮提取、提取液高溫殺菌的方式提取桑黃多糖，這樣粗放式的提取工藝原料來源困難，提取收率很低。公開號為CN103319618專利提到一種固體發(fā)酵的方式獲得桑黃多糖的方法，但是固體發(fā)酵對場地要求高、而且生產(chǎn)周期長，不合適于大生產(chǎn)工藝、且專利里的提取工藝簡單，難獲得高質(zhì)量的桑黃多糖。
[0004]綜上所述，提供一種能大規(guī)模生產(chǎn)桑黃多糖的工藝是目前市場上非常必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的一個目的是解決至少上述問題，并提供至少后面將說明的優(yōu)點(diǎn)。
[0006]為了實(shí)現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的這些目的和其它優(yōu)點(diǎn)，提供了一種產(chǎn)率高的火木層孔菌株及其在生產(chǎn)桑黃多糖中的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明提供了一種火木層孔菌株(Phellinus igniarius)，其保藏號為:CGMCCN0.11737。
[0008]本發(fā)明還提供了所述火木層孔菌株在生產(chǎn)桑黃多糖中的應(yīng)用。
[0009]優(yōu)選的是，所述火木層孔菌株在生產(chǎn)桑黃多糖中的應(yīng)用，包括以下步驟:
[0010]步驟(I)將所述火木層孔菌株的菌絲體加入水中，菌絲體和水的質(zhì)量比為1:10-50，然后將溫度升到50_90°C，提取l_4h得到提取液；
[0011]步驟(2)對提取液進(jìn)行超濾分離，超濾分離采用用4020PS中空纖維膜，流速為3?5L/h，壓力為0.10?0.15MPa，得到透過液；
[0012 ]步驟(3)取桑黃發(fā)酵液加入2-3倍體積的乙醇，沉淀9?12h;離心去掉上清液，沉淀物溶解于蒸餾水中，放入透析袋中透析2d，每10?12h換水一次;將透析物于50°C干燥20?24h制得胞外多糖；
[0013]步驟(4)將所述胞外多糖與所述透過液混合后經(jīng)過Sevag法脫蛋白以及Sephadex如G-75或G-100等型號進(jìn)行凝膠層析進(jìn)一步純化制得桑黃多糖。
[0014]優(yōu)選的是，所述步驟(4)中，所述Sevag法脫蛋白的具體過程為:于所述胞外多糖與所述透過液的混合液中加入Sevag溶液，混合液和Sevag溶液的體積比為I: I，振蕩時間為15min，用4?5倍體積95%乙醇沉淀24h，液體離心1min，棄去上清液;其中所述Sevag溶液中氯仿和正丁醇的體積比為10:3，。
[0015]優(yōu)選的是，所述Sephadex G-100凝膠層析的具體過程為:取Sephadex G-75或G-100等型號，加10ml蒸餾水室溫溶脹72?78h;待溶脹平衡后，傾去上層清液，包括細(xì)顆粒，然后再放些蒸餾水?dāng)噥y，靜置使凝膠下沉，再傾去上層清液，至無細(xì)顆粒為止，溶脹平衡和漂洗凈的凝膠除去氣泡，取2.6x100cm層析柱裝柱，柱中洗脫加入少量洗脫液，使高出床表面3-5cm，接上恒壓洗脫瓶，調(diào)節(jié)操作壓在30cmH20以內(nèi)；收集洗脫流出液，烘干后得桑黃多糖。
[0016]優(yōu)選的是，所述步驟(I)中，培養(yǎng)所述火木層孔菌株以制備得到菌絲體，培養(yǎng)過程中，種子培養(yǎng)基的各組分按重量百分比計:葡萄糖1_2%，酵母浸粉1-2%，蛋白胨1-2%，麥芽糖0.5-1%,硫酸鎂0.05-0.1%,磷酸二氫鉀0.05%, PH值為5.0-5.5；發(fā)酵培養(yǎng)基配方:麥麩濃度35-45g/L，葡糖糖30-40g/L，蛋白胨I.0_2.0g/L，硫酸鎂0.5-1.5g/L，磷酸二氫鉀
0.1-0.3g/L，PH值為 4.5-5.5。
[0017]優(yōu)選的是，所述步驟(I)中，培養(yǎng)所述火木層孔菌株的具體過程為:
[0018]步驟①對所述火木層孔菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)基為所述種子培養(yǎng)基，在24-26°C，120rpm振蕩培養(yǎng)72-90h，得到搖瓶菌種；
[0019]步驟②對搖瓶菌種進(jìn)行搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)，搖瓶擴(kuò)大培養(yǎng)基為所述種子培養(yǎng)基，在24-26°C，120rpm振蕩培養(yǎng)24-36h，得到擴(kuò)大搖瓶菌種；
[0020]步驟③對擴(kuò)大搖瓶菌種進(jìn)行一級種子培養(yǎng)，一級種子培養(yǎng)基為所述種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為24_26°C，通氣量與一級種子培養(yǎng)基的體積比為I: 0.3-0.8，通氣壓力為0.6-
1.0kPa，轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)36_45h，得到一級種子；
[0021 ]步驟④對一級種子進(jìn)行二級種子培養(yǎng)，二級種子培養(yǎng)基為所述種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為24-26°C，通氣量與二級種子培養(yǎng)基的體積比為1:0.3-0.8，通氣壓力為0.6-1.0kPa，轉(zhuǎn)速為100r/min，培養(yǎng)40-60h，得到二級種子；
[0022]步驟⑤對二級種子進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基為所述發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為24-26°C，通氣量與發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基的體積比為1:0.3-0.8,通氣壓力為0.3?
0.8kPa，初始轉(zhuǎn)速為100r/min，通過調(diào)整轉(zhuǎn)速控制溶氧值在60%，培養(yǎng)90_120h。
[0023]本發(fā)明至少包括以下有益效果:本發(fā)明所述的火木層孔菌株具有更高的桑黃多糖產(chǎn)率，發(fā)酵液中菌絲體干重不低于24.0g/L。在應(yīng)用火木層孔菌株生產(chǎn)桑黃多糖的過程中，采用熱水浸提法和乙醇分級沉淀法分別對菌絲體多糖和胞外多糖進(jìn)行提取，桑黃多糖的提取率不低于5.43 %。通過Sevag法和凝膠法對桑黃多糖進(jìn)行去蛋白純化，獲得的桑黃多糖中多糖含量不低于90 %，蛋白含量控制在15 %-23 %。采用紫外誘變篩選獲得桑黃多糖高產(chǎn)菌株L093，通過最佳培養(yǎng)基配方和最佳發(fā)酵條件，獲得的火木層孔菌株菌絲體干重不低于24.5g/L；
[0024]采用發(fā)酵罐控制技術(shù)，制備的5000-10000L發(fā)酵罐桑黃多糖具有產(chǎn)量高、產(chǎn)品單一性強(qiáng)、污染小等特點(diǎn)，技術(shù)上處于國內(nèi)領(lǐng)先水平，改變了我國桑黃發(fā)酵生產(chǎn)水平低的格局，提供一種高產(chǎn)桑黃多糖產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)化方法；
[0025]采用熱水浸提法提取桑黃菌多糖粗體，并采用超濾分離、乙醇沉淀、真空干燥后得到桑黃多糖產(chǎn)品，提取率不低于5.43 %。純度不低于90 %以上。
[0026]本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)、目標(biāo)和特征將部分通過下面的說明體現(xiàn)，部分還將通過對本發(fā)明的研究和實(shí)踐而為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明其中一個實(shí)施例中所述桑黃多糖的生產(chǎn)工藝流程圖。
[0028]生物保藏說明
[0029]高產(chǎn)菌株L093:分類命名:火木層孔菌株(Phell inus igniarius)，保藏號為:CGMCC N0.11737，保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期:2015年11月25日；
[0030]出發(fā)菌株:分類命名:火木層孔菌株(Phellinus igniarius)，保藏號為:CGMCCN0.11737，該菌株購自于北京安泰達(dá)山基因技術(shù)有限公司。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0032]應(yīng)當(dāng)理解，本文所使用的諸如“具有”、“包含”以及“包括”術(shù)語并不配出一個或多個其它元件或其組合的存在或添加。
[0033]實(shí)施例1利用出發(fā)菌株誘變得到突變菌株L093
[0034]用組織分離法得到火木層孔菌株，接種在麥芽汁固定斜面培養(yǎng)基上，在20_30°C恒溫培養(yǎng)3-5天，然后冰箱中4°C保存?zhèn)溆?。取SmL孢子懸液于9cm平皿中，磁力攪拌，30w紫外燈20cm處照射5?10秒，進(jìn)行第一輪照射，經(jīng)搖瓶復(fù)篩后，獲得高產(chǎn)桑黃多糖的第一突變菌株，然后該第一突變菌株置于30w紫外燈下30cm處，照射30秒進(jìn)行第2輪紫外線照射誘變處理，經(jīng)初、復(fù)篩，獲得生長良好的高產(chǎn)桑黃多糖的突變菌株L093。
[0035]斜面培養(yǎng)基中含有按重量百分比計的以下各組分:葡萄糖1%，酵母浸粉1%，蛋白胨0.5 %，硫酸鎂0.05 %，磷酸二氫鉀0.05%,瓊脂粉0.5%, PH值為4.5-5.5。
[0036]通過培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)后，火木層孔菌株菌絲體干重為24.2g/L。
[0037]實(shí)施例2
[0038]改變斜面培養(yǎng)基的組成，分別對高產(chǎn)菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行培養(yǎng)。斜面培養(yǎng)基的中各組分按重量百分比計設(shè)計為:葡萄糖2%，酵母浸粉2%，蛋白胨I%，硫酸鎂0.1%，磷酸二氫鉀0.05%,瓊脂粉1.5%, PH值為4.5-5.5。通過培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)后，誘變后的火木層孔菌株菌絲體干重為25.lg/L。高產(chǎn)菌株的產(chǎn)糖量相比于出發(fā)菌株提高15%。
[0039]實(shí)施例3
[0040]圖1提供了在一個實(shí)施例中生產(chǎn)桑黃多糖的工藝流程。[0041 ] 步驟1，從母種試管中挑取80mL高產(chǎn)菌種L093種子培養(yǎng)基裝于500mL三角瓶中，24°C，120rpm振蕩培養(yǎng)75小時。200mL種子培養(yǎng)基裝于100mL三角瓶中，接入一級種子50mL，24°C，120rpm振蕩培養(yǎng)28小時后接入一級種子罐進(jìn)行培養(yǎng)。
[0042]步驟2，將步驟I制得的菌種接入裝有一級種子培養(yǎng)基的100