海洋裂褶菌菌株的篩選及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一株來(lái)源于海洋近海灘涂的大型真菌白參，經(jīng)過(guò)鑒定該大型海洋真菌為裂褶菌，能夠在高鹽培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，并能夠產(chǎn)生裂褶菌素。本發(fā)明采用沿海及濱海濕地腐木為樣本，利用天然海水配制限制性培養(yǎng)基進(jìn)行海洋裂褶菌的篩選；并通過(guò)對(duì)裂褶菌的液體發(fā)酵，獲得了海洋裂褶菌素。本發(fā)明所生產(chǎn)的裂褶菌素化學(xué)成分為β?1,3/1,6?葡聚糖，來(lái)源于海洋裂褶菌，可應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有極大的應(yīng)用推廣價(jià)值。CCTCC NO: M 201605520160118
【專利說(shuō)明】
海洋裂褶菌菌株的篩選及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及海洋微生物及其天然產(chǎn)物領(lǐng)域，具體涉及海洋白參真菌的篩選和培 養(yǎng)，及其所產(chǎn)裂褶菌素的提取純化，裂褶菌素的定性定量分析。
【背景技術(shù)】
[0002] 海洋生物資源由于深海中水體壓力更大，缺氧甚至無(wú)氧，持續(xù)低溫，偶有高溫或冷 泉，其中的極地海洋環(huán)境更是具有異常極端，寒冷、高鹽和強(qiáng)輻射的特征。在如此極端的海 洋環(huán)境中生存繁衍的海洋生物，必須具備適應(yīng)極端生存環(huán)境的生命系統(tǒng)。因此，極端環(huán)境海 洋生物不僅種類獨(dú)特，而且含有很多極具潛力的活性物質(zhì)和基因資源，具有巨大的科研和 商業(yè)開發(fā)前景。海洋生物活性物質(zhì)是指海洋生物體內(nèi)所含有的對(duì)生命現(xiàn)象具有影響的微量 或少量物質(zhì)，主要包括海洋藥用物質(zhì)、生物信息物質(zhì)、海洋生物毒素產(chǎn)生物和功能材料等海 洋生物體內(nèi)的天然產(chǎn)物，以萜類、皂苷、留類、多肽、多糖、蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)類型存在。
[0003]白參又稱為樹花，分類命名為裂裙菌（Schizophyllum commune)，屬于真菌門，擔(dān) 子菌亞門，層菌綱，非褶菌目，裂褶菌科，裂褶菌屬。廣泛分布于世界各地，主要腐生在土壤、 腐木、枯枝落葉層上，大多在闊葉林下生長(zhǎng)，少數(shù)在針葉及竹葉林下生長(zhǎng)。目前還沒(méi)有在海 洋資源中發(fā)現(xiàn)裂褶菌菌株生長(zhǎng)的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明從海洋灘涂腐朽樹木雜草為海洋微生物資源，進(jìn)行了海洋大型真菌的篩 選，獲得了一株能夠在高鹽濃度條件下生長(zhǎng)，并且隨著鹽濃度降低，能夠高產(chǎn)裂褶菌素的海 洋來(lái)源的裂褶菌菌株。
[0005] -種海洋裂裙菌，其分類命名為裂裙菌（Schizophylum commune.)，此菌株已于 2016年1月18日保存在位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號(hào)為:CCTCC Μ 2016055。本發(fā)明海洋裂褶菌屬真菌門、層菌綱、傘菌目、裂褶菌科、裂褶菌屬。
[0006] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述利用篩選得到的海洋裂褶菌生產(chǎn)裂褶菌素的方法，該方法 包括以下步驟：以5~10%的接種比例將裂褶菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，23-27°C，160-180rpm 下?lián)u瓶培養(yǎng)24~36小時(shí);然后對(duì)裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行提取、純化，得裂褶菌素。
[0007] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:葡萄糖30.0 g/L，酵母粉5. Og/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸 鎂0.3g/L。
[0008] 經(jīng)過(guò)鑒定，本發(fā)明生產(chǎn)得到的裂褶菌素為β-l，3/1，6-葡聚糖，分子量在60-120KD 之間，結(jié)構(gòu)式如下：
[0010] 本發(fā)明得到的裂褶菌素分子量在60-120KD之間，能夠完全水溶，對(duì)人體皮膚吸收 來(lái)說(shuō)非常好，保濕性能突出，可應(yīng)用于食品、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有極大 的應(yīng)用推廣價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖1所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中rDNA-ITS擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0012]圖2所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中所得裂褶菌素的凝膠層析洗脫液吸收峰圖；
[0013] 圖3所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中所得裂褶菌素的高效液相色譜圖；
[0014] 圖4所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中所得裂褶菌素的紫外吸收光譜圖；
[0015] 圖5所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中所得裂褶菌素的紅外吸收光譜圖；
[0016] 圖6所示的是本發(fā)明實(shí)施例3中所得裂褶菌素的凝膠滲透色譜洗脫曲線；
[0017] 圖7所示的是本發(fā)明實(shí)施例2中裂褶菌菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說(shuō)明都是例示 性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有說(shuō)明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ) 具有與本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域人員通常理解的相同含義。
[0019] 實(shí)施例1:海洋來(lái)源的白參菌株的篩選
[0020] 1.培養(yǎng)基的配制
[0021] 利用自然海水或人工配制的海水配制改良PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200克，葡萄糖20 克，瓊脂15~20克，海水或人造海水1000毫升，自然PH。其做法是先洗凈去皮，再稱取200g馬 鈴薯切成小塊，加海水煮爛(煮沸20~30分鐘，能被玻璃棒戳破即煮馬鈴薯塊），用八層紗布 過(guò)濾，加熱，再據(jù)實(shí)際實(shí)驗(yàn)需要加 l_20g瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，待瓊脂溶解完后，加入葡 萄糖，攪拌均勻，稍冷卻后再補(bǔ)足海水或人造海水分至1000毫升，分裝錐形瓶，加塞、包扎， (121°C )滅菌20分鐘左右后取出搖勻，冷卻到60°C左右，配制平板，凝固后4°C冰箱貯存?zhèn)?用。
[0022] 2.白參菌株的篩選
[0023] 將從浙江省寧波市象山縣周圍海洋灘涂所取腐木樣品用無(wú)菌海水或人造海水?dāng)?拌3-6h后，取樣涂布于改良TOA平板。26°C倒置培養(yǎng)3-7天。在獲得單菌落后，提取單菌落接 種于液體改良PDA培養(yǎng)基，26°C，180rpm/min培養(yǎng)。
[0024] 實(shí)施例2:白參菌株的鑒定
[0025] 1.真菌DNA基因組提取
[0026] 取實(shí)施例1得到的菌株培養(yǎng)液，離心后沉淀加適量dH20充分研磨破碎，選用TaKaRa 的商品化真菌核酸提取試劑盒進(jìn)行DNA提取。
[0027] 2.核酸純度與濃度測(cè)定
[0028] 取一定量的DNA提取液進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋后，在260、280與320nm下分別測(cè)定0D 值，以（0D260-0D320)/(0D280-0D320)計(jì)算核酸純度，自然界核酸純度范圍為116~210, 一 般以118±012為宜；核酸濃度(ng/yL)~50X(0D260-0D320)/LXD(L為光徑長(zhǎng)度cm，D為稀 釋倍數(shù)），據(jù)結(jié)果將核酸濃度稀釋至適合的PCR用模板濃度100~300ngAiL。
[0029] 3.rDNA-ITS 擴(kuò)增
[0030] 以表 1 所示的 PCR 反應(yīng)組成，按反應(yīng)條件（94°C2min;94°C30s，59°C30s，72°C90s， 35Cycles;72°C7min)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的ITS。將PCR產(chǎn)物用1%凝膠進(jìn)行電泳30min(100V)，使 用015yg/MlEB或3XGelRed進(jìn)行后染30min，然后在凝膠成像儀上進(jìn)行顯影成像，觀察是否 擴(kuò)增出目的條帶，結(jié)果如圖1所示。
[0031] 表 1
[0034] 4.rDNA-ITS 測(cè)序與分析
[0035] 將擴(kuò)增出來(lái)的目的核酸片段送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司純化后進(jìn)行 測(cè)序，基因序列如SEQ ID NO: 1所示。將測(cè)得的序列提交美國(guó)NCBI的GENBANK獲取對(duì)比指標(biāo) 靠前的20個(gè)相似序列，通過(guò)BLAST工具和DNAMAN軟件進(jìn)行比對(duì)分析并以Neighbor-Joining 方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖7所示。
[0036] 通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)該菌株與Schizophyllum commune DP61等具有極高的親緣 性，因此可確定為一株海洋來(lái)源的裂褶菌，能夠在高鹽環(huán)境條件下生長(zhǎng)，我們將其命名為 Schizophyllum commune XNY-20151228。
[0037] 實(shí)施例3:裂褶菌素的生產(chǎn)
[0038] 1.裂褶菌的發(fā)酵培養(yǎng)
[0039]以5~10%的接種比例將裂褶菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，25-27°(：，160-180印111下?lián)u瓶 培養(yǎng)24~36小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30.0g/L，酵母粉5.0g/L，磷酸二氫鉀0.5g/L， 硫酸鎂〇.3g/L。
[0040] 2.裂褶菌素的提取與純化
[00411以裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)物為材料，收集發(fā)酵液，8 000r/min離心20min，棄沉淀。上清液 中加入粉末狀活性炭，水浴，加熱攪拌15min，抽濾得粘稠、透明狀液體。脫色后的發(fā)酵液用 Sevag法除蛋白，重復(fù)5次后，向已脫蛋白的發(fā)酵液中加入2.5倍體積的95%乙醇，出現(xiàn)大量 白色絮狀沉淀，搖勻，4°C靜置過(guò)夜，6 000r/min離心20min，收集沉淀，冷凍干燥，得裂褶菌 素粗品。
[0042] SephadexG-ΙΟΟ凝膠柱層析對(duì)裂裙菌素粗品進(jìn)行柱層析分離、純化。選取Sephadex G-100為填料裝填于1.6cm X 100cm層析柱中，0.9 %氯化鈉溶液洗脫，流速控制在大約 0. 3mL/min，每管收集3mL，分步收集，每管取少量收集液，苯酚-硫酸法檢測(cè)，490nm測(cè)其0D 值。將最大峰處的洗脫液合并，減壓濃縮，冷凍干燥，得到多糖純品。
[0043] 3.所得裂褶菌素純品的結(jié)構(gòu)分析
[0044] 3.1酶解反應(yīng):淀粉酶0. lmL溶于30mL蒸餾水中。蝸牛酶以pH7.4磷酸緩沖液配制， 終濃度為3%。兩者中均加入裂褶菌素30mg，40°C，反應(yīng)3d，用DNS法測(cè)定水解產(chǎn)物。
[0045] 3.2高碘酸氧化:20011^裂褶菌素溶于1001^0.25111〇1/1他104中于暗處，12°(：，間 隔12h取樣，稀釋，在223nm測(cè)定高碘酸消耗量，將溶液中加入乙二醇放置lOmin，以終止反 應(yīng)，還原剩余的高碘酸，用溴甲酚紫為指示劑，用0.0 lmol/LNaOH滴定甲酸釋放量。
[0046] 結(jié)果顯示:該裂褶菌素不能被α-淀粉酶，纖維素酶水解，提示無(wú) α-(1~4)及β_(1~ 4)連接的糖苷鍵。但能被蝸牛酶水解，表明含有有β_( 1-3)糖苷鍵。
[0047] 經(jīng)高碘酸鈉氧化，108h反應(yīng)完成，平均每摩示已糖消耗高碘酸鹽1.05mol，產(chǎn)生甲 酸0.47mol，高碘酸的消耗是甲酸生成的2倍，說(shuō)明多糖中只有(1~6)糖苷鍵。
[0048]采用上述方法進(jìn)一步測(cè)定發(fā)現(xiàn)該裂褶菌素以β-1、3糖苷鍵為主鏈(66%)，少量β- 1、 6糖苷鍵為側(cè)鏈(33%)。
[0049] 3.3高效液相色譜:1&仏^244型高效液相色譜儀，糖柱，1&仏^410視差檢測(cè)器，流 動(dòng)相為水，流速〇. 9，柱溫50°C。SPG水解液的Rf (9.808)與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的Rf (9.835) -致， 表明該裂褶菌素是一種葡萄糖多聚物，即為葡聚糖。高效液相圖譜如圖3所示。
[0050] 3.4紫外吸收光譜：
[00511裂褶菌素溶液從200nm~600nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，分析其末端吸收峰。
[0052]紫外掃描在260nm和280nm未見特征吸收峰，說(shuō)明SPG中不含蛋白成分。
[0053]紫外吸收光譜圖如圖4所示。
[0054] 3.5紅外光譜分析：
[0055] 2mg干燥的裂褶菌素樣品，與100~200mg經(jīng)干燥的KBr粉末在瑙研缽中研磨均勻， 壓片機(jī)壓成薄片后在4000~500CHT1進(jìn)行掃描。紅外吸收光譜圖如圖5所示。
[0056] SPG在3600~3200〇!^的寬峰是0-H的伸縮振動(dòng)。沒(méi)有氫鍵的二級(jí)0-H其吸收峰一般 在3630cm-1附近，分子內(nèi)的氫鍵在3560cm-1附近，分子間的氫鍵在3400cm- 1以下。3395cm-1的 強(qiáng)吸收峰說(shuō)明存在分子間的氫鍵。3000~2800CHT 1的一組較弱的峰是糖類C-H的伸縮振動(dòng)， 該區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰。1400~1200CHT1的弱吸收帶是C-H的面外彎曲振動(dòng)。 1200~lOOOcnf 1的強(qiáng)吸收峰由兩種C-0伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生，其中一種屬于C-0-H，另外一種是糖 環(huán)的C-O-CdgOcnf 1處吸收峰是吡喃糖β型C 一 Η面內(nèi)彎曲振動(dòng)的特征吸收峰。紅外光譜進(jìn)一 步表明SPG是一種β型葡聚糖。
[0057] 3.6分子量測(cè)定：
[0058] 凝膠珠色譜分析經(jīng)過(guò)精制的樹花多糖在GPC上的洗脫曲線見圖6,利用隨機(jī)的 13代626軟件計(jì)算得數(shù)均分子量]\&1 = 0.8\107，重均分子量]\^=1.6\107。]\^/]\&1 = 2.0，表明 樣品分子量分布較分散。
[0059]綜合以上分析，可以確定該裂褶菌素為來(lái)源于海洋裂褶菌的β-1，3/1，6_葡聚糖。 相對(duì)于傳統(tǒng)酵母，燕麥來(lái)源的β-葡聚糖以β_1、4糖苷鍵為主，水溶性不足的缺點(diǎn)，該海洋白 參所產(chǎn)裂褶菌素完全水溶，保濕性能更突出，更適合作為化妝品添加劑。
[0060] 本發(fā)明實(shí)施例涉及到的材料、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備，如無(wú)特別說(shuō)明，均為符合微生物領(lǐng) 域的市售產(chǎn)品。
[0061] 以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都 應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
[0062] SEQ ID N0:1：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海洋裂褶菌，其特征在于：它的保藏編號(hào)為CCTCC M 2016055,分類命名為裂褶 菌。2. 利用權(quán)利要求1所述的海洋裂褶菌生產(chǎn)裂褶菌素的方法，其特征在于包括以下步驟： 以5~10%的接種比例將裂褶菌接種到發(fā)酵培養(yǎng)基，23-27°C，160-180rpm下?lián)u瓶培養(yǎng)24~ 36小時(shí);然后對(duì)裂褶菌發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行提取、純化，得裂褶菌素。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用海洋裂褶菌生產(chǎn)裂褶菌素的方法，其特征在于:所述發(fā)酵 培養(yǎng)基配方為:葡萄糖30.0 g/L，酵母粉5. Og/L，磷酸二氫鉀0.5g/L，硫酸鎂0.3g/L。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的利用海洋裂褶菌生產(chǎn)裂褶菌素的方法，其特征在于:所述得到 的裂糟菌素為β_1，3/1，6-葡? ?丨印_姑敕1式為：5. 權(quán)利要求2得到的裂褶菌素在食品、化妝品和藥品中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K8/60GK105886408SQ201610079964
【公開日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年2月4日
【發(fā)明人】田 健, 諸輝
【申請(qǐng)人】寧波希諾亞海洋生物科技有限公司