鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌，它是從蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)鑒定為Pestalotiopsis sp. DO14。該菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC M 2015180。本發(fā)明還通過(guò)與鐵皮石斛組培苗共培養(yǎng)，促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長(zhǎng)與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類(lèi)成分的改變，是與鐵皮石斛生長(zhǎng)與代謝產(chǎn)物密切相關(guān)的重要微生物，具有促使鐵皮石斛生長(zhǎng)和代謝成分變化的應(yīng)用潛力。CCTCC M201518020150331
【專(zhuān)利說(shuō)明】
鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鐵皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(蘭科石斛屬植物)，是我國(guó)名貴中藥材，具有滋陰清熱、益胃生津、潤(rùn)肺明目、抗癌防老等功效，位列“中華九大仙草”之首。2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》將鐵皮石斛從石斛類(lèi)藥材中劃出，單獨(dú)收錄。隨著鐵皮石斛栽培技術(shù)的突破，產(chǎn)業(yè)得到了快速的發(fā)展，全國(guó)鐵皮石斛現(xiàn)有種植面積突破4萬(wàn)畝，產(chǎn)值突破50億元，成為我國(guó)產(chǎn)銷(xiāo)量最大、發(fā)展最快的中藥材之一。提高栽培藥材的品質(zhì)和保持質(zhì)量穩(wěn)定性成為了當(dāng)前鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重點(diǎn)，而明確其品質(zhì)形成的作用機(jī)制是關(guān)鍵。
[0003]鐵皮石斛作為蘭科植物有其生長(zhǎng)的特殊性，在自然生境中部分或全部依靠與其共生的菌根真菌為其提供營(yíng)養(yǎng)才能促使種子萌發(fā)及后繼的生長(zhǎng)發(fā)育。近年來(lái)，另一個(gè)重要群體一非菌根內(nèi)生真菌因其多種生態(tài)作用得到了越來(lái)越多的關(guān)注。大量的研究發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌作為微生物生態(tài)的一個(gè)重要組成部分，不僅能促進(jìn)宿主生長(zhǎng)、提高宿主對(duì)生物脅迫或非生物脅迫的抗性，還引起宿主次生代謝產(chǎn)物的變化，甚至能夠誘導(dǎo)和促進(jìn)藥用植物有效成分的合成或積累，一些藥用植物內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)。與根關(guān)聯(lián)的非菌根內(nèi)生真菌逐漸被人們認(rèn)識(shí)和發(fā)現(xiàn)。一些證據(jù)證明與葉和根部相關(guān)的內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的有利作用被低估。然而藥用蘭科植物，尤其是石斛屬植物內(nèi)生真菌研究缺乏，近年來(lái)石斛屬植物與其真菌的關(guān)系研究也多集中在石斛菌根真菌的作用方面，僅有極少數(shù)關(guān)于石斛屬非菌根內(nèi)生真菌的報(bào)道，仍有大量的石斛屬植物內(nèi)生真菌以及它們對(duì)宿主植物的影響作用有待于探究。
[0004]我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)不同種質(zhì)的鐵皮石斛具有極其豐富的內(nèi)生真菌資源，將從鐵皮石斛葉、莖、根中分離得到的內(nèi)生真菌逐一與鐵皮石斛無(wú)菌組培苗共培養(yǎng)，從中篩選出了對(duì)鐵皮石斛生長(zhǎng)、代謝成分變化有明顯作用的優(yōu)良菌株。這項(xiàng)工作為鐵皮石斛內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的影響研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，為鐵皮石斛品質(zhì)改良開(kāi)辟新的途徑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，并提出其用途，即能夠通過(guò)與鐵皮石斛組培苗共培養(yǎng)，促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長(zhǎng)與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類(lèi)成分的改變，在于有效地促進(jìn)鐵皮石斛苗的生長(zhǎng)，提高活性代謝成分的含量，為鐵皮石斛內(nèi)生真菌對(duì)宿主植物的影響研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)，為鐵皮石斛品質(zhì)改良開(kāi)辟新的途徑。
[0006]本發(fā)明提供了一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌，命名為Pestalot1psissp.D014。本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌是從蘭科石斛屬植物鐵皮石斛(Dendrobium officinale Kimuraet Migo)植物活體中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類(lèi)學(xué)鑒定為Pestalot1psissp.D014。該菌株已保藏，保藏日期為2015年03月31日，保藏號(hào)為CCTCC M2015180，保藏單位為中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072。
[0007]本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌的固體培養(yǎng)特征為:在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上26 °C培養(yǎng)，菌落白色絮狀。
[0008]本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌顯微特征為:分生孢子具有5個(gè)細(xì)胞，中間細(xì)胞著色，頂孢和尾孢均為三角形。
[0009]本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌的ITS和5.8S rDNA堿基序列如SEQ ID N0.1所示為:
CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCG
GCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCT
TATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAA
GTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCAT
GCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCT
GAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCC
AGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo
[0010]本發(fā)明還提供了鐵皮石斛內(nèi)生真菌的應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，與鐵皮石斛組培苗共培養(yǎng)，促進(jìn)鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)，促使鐵皮石斛組培苗中代謝成分改變，其實(shí)施步驟如下:
菌種活化—與組培苗共培養(yǎng)—共培養(yǎng)組培苗生長(zhǎng)狀況觀察—組培苗莖、葉中主要代謝成分提取—組培苗莖、葉中主要代謝成分分析；
其中菌種活化采用平板固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為PDA;內(nèi)生真菌與組培苗共培養(yǎng)培養(yǎng)基為香蕉培養(yǎng)基(大量50 mL/L，微量10 mL/L，有機(jī)10 mL/L，鐵鹽10mL/L，NAA I mL/L，瓊脂4.2g/L，白糖30g/L，香蕉150/L，花寶1.0 g/L，pH=7.09)。培養(yǎng)時(shí)間:菌種平板培養(yǎng)活化7_14天，內(nèi)生真菌與組培苗共培養(yǎng)I個(gè)月。培養(yǎng)溫度:菌種活化為26 ± I °C，共培養(yǎng)為25 ± TC。共培養(yǎng)光照時(shí)間為8?12小時(shí)/天，光強(qiáng)為1000?20001X。組培苗莖中多糖含量測(cè)定:參照《2010版中國(guó)藥典一部》中的苯酚-硫酸比色法。
[0012]莖中醇溶性成分提取:精密稱(chēng)定1.0g莖粉末，置250mL圓底燒瓶中，精密加入10mL甲醇，80°C水浴回流lh，過(guò)濾，濾液旋干，甲醇溶解并定容至2mL，0.45ym微孔濾膜過(guò)濾，SP得。
[0013]葉中黃酮類(lèi)成分提取:精密稱(chēng)定0.4g葉粉末，置50mL具塞三角瓶中，精密加入20mL80%甲醇，密塞，20°C超聲30π?η，0.45μπι微孔濾膜過(guò)濾，即得。利用HPLC指紋圖譜技術(shù)分析組培苗莖中醇溶性成分與葉中黃酮類(lèi)成分。
[0014]本發(fā)明所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，通過(guò)與鐵皮石斛組培苗共培養(yǎng)，促進(jìn)鐵皮石斛組培苗的莖加粗、加長(zhǎng)與莖、葉的顏色加深，促使莖中多糖含量的提高、莖中醇溶性成分與葉中黃酮類(lèi)成分的改變，具有較大的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1本發(fā)明所述鐵皮石斛內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基上的形態(tài)圖；
圖2本發(fā)明所述鐵皮石斛內(nèi)生真菌的顯微鏡(1000Χ)觀察圖； 圖3本發(fā)明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無(wú)菌組培苗形態(tài)特征比較圖；
圖4本發(fā)明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無(wú)菌組培苗莖中多糖含量比較圖；
圖5本發(fā)明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無(wú)菌組培苗葉中黃酮類(lèi)成分對(duì)比指紋圖譜；
圖6本發(fā)明所述鐵皮石斛接菌組培苗與無(wú)菌組培苗葉莖中醇溶性成分對(duì)比指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。
[0017]本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生真菌是從浙江省樂(lè)清市雁蕩山鐵皮石斛葉、莖、根中均能得到的菌株。本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生真菌按以下步驟分離獲得:將采集的新鮮健康的鐵皮石斛莖、葉與根在自來(lái)水下沖洗干凈，用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，將根和莖切成3cm長(zhǎng)的小段，葉片切成3cmX3cm的小塊，進(jìn)行75%乙醇I min—2.5%次氯酸鈉3 min—75%乙醇30 s三步表面消毒處理。消毒后，材料表面用無(wú)菌水沖洗3次再用無(wú)菌濾紙吸干，用消毒后的剪刀分別將根和莖剪成小段(1.0 cm)、葉片剪成小塊(0.5 cmX0.5 cm)，置于含有50 mg/L青霉素的PDA(土豆200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂15g/L)培養(yǎng)基上26±2°C培養(yǎng)。每天觀察樣品真菌生長(zhǎng)的情況。5-7天后有菌絲長(zhǎng)出，挑取菌絲尖端轉(zhuǎn)移到新的TOA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，并按形態(tài)合并，最終得到本發(fā)明的鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌株。
[0018]在無(wú)菌條件下用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體TOA培養(yǎng)基平板，于26土TC活化培養(yǎng)14，鐵皮石斛內(nèi)生真菌在PDA平板培養(yǎng)基上的形態(tài)特征及顯微特征如圖1、圖2所示。
[0019]準(zhǔn)備鐵皮石斛無(wú)菌組培苗，用打孔器將覆蓋培養(yǎng)基表面的菌絲打成大小相同的菌片(直徑為0.5cm)，接種在距離鐵皮石斛無(wú)菌組培苗1.5cm處，25 °C每天光照12h條件下培養(yǎng)I個(gè)月，期間對(duì)組培苗生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察。與鐵皮石斛內(nèi)生真菌共培養(yǎng)I個(gè)月的鐵皮石斛組培苗以及鐵皮石斛未接菌組培苗的形態(tài)特征如圖3所示。
[0020]為檢測(cè)鐵皮石斛內(nèi)生真菌接種后的效果，可從鐵皮石斛內(nèi)生真菌與組培苗共培養(yǎng)的組培瓶中，取出鐵皮石斛組培苗，將其進(jìn)行清洗，烘干，再進(jìn)行鐵皮石斛組培苗莖的多糖含量測(cè)定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類(lèi)成分指紋圖譜檢測(cè)。與鐵皮石斛內(nèi)生真菌共培養(yǎng)I個(gè)月的鐵皮石斛組培苗以及鐵皮石斛未接菌組培苗莖中多糖含量比較如圖4所示，莖中醇溶性成分、葉中醇溶性成分比較如圖5、6所示。
[0021]多糖含量測(cè)定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類(lèi)成分指紋圖譜檢測(cè)結(jié)果表明，接種后，鐵皮石斛小苗與內(nèi)生真菌形成了共生關(guān)系，不僅促進(jìn)了鐵皮石斛小苗的生長(zhǎng)速度，同時(shí)也使鐵皮石斛植株植體內(nèi)多糖和醇溶性成分大幅度提高，有效地提高了鐵皮石斛的品質(zhì)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種鐵皮石斛內(nèi)生真菌，其特征在于，它的命名為擬盤(pán)多毛孢屬Pestalot1psissp.D014，其保藏登記號(hào)為CCTCC M 2015180。2.如權(quán)利要求1所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，其特征在于，它的ITS和5.8SrDNA堿基序列如SEQ ID N0.1所示為: CCTCTGTACGCGGAGGGACATTATAGAGTTTTCTAAACTCCCAACCCATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAACTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTGTTGGGAATCTACTTCTCTTAGGAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGTAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATAAo3.如權(quán)利要求1或2所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，其特征在于，它的顯微形態(tài)為:分生孢子具有5個(gè)細(xì)胞，中間細(xì)胞著色，頂孢和尾孢均為三角形。4.如權(quán)利要求1或2所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌，其特征在于，它的固體培養(yǎng)為T(mén)OA培養(yǎng)基上26 °C培養(yǎng)，菌落白色絮狀。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述的鐵皮石斛內(nèi)生真菌在促使鐵皮石斛組培苗生長(zhǎng)和代謝成分變化中的應(yīng)用。6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，鐵皮石斛內(nèi)生真菌與鐵皮石斛無(wú)菌組培苗共培養(yǎng)包括下列步驟: (1)取鐵皮石斛內(nèi)生真菌菌種，在無(wú)菌條件下，用接種針挑取少量菌絲，接入已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基平板，于26 ± I °(:活化培養(yǎng)14天； (2)準(zhǔn)備好鐵皮石斛無(wú)菌組培苗，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)平板，用打孔器將覆蓋培養(yǎng)基表面的菌絲打成大小相同的菌片，接種在距離鐵皮石斛無(wú)菌組培苗1.5cm處，25°C每天光照12h條件下培養(yǎng)I個(gè)月，期間對(duì)組培苗生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察； (3)從鐵皮石斛內(nèi)生真菌與組培苗共培養(yǎng)的組培瓶中，取鐵皮石斛組培苗，將其進(jìn)行清洗，進(jìn)行鐵皮石斛組培苗莖的多糖含量測(cè)定、莖中醇溶性成分指紋圖譜與葉中黃酮類(lèi)成分指紋圖譜檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】A01P21/00GK105886405SQ201510288283
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2015年6月1日
【發(fā)明人】吳令上, 斯金平, 董洪秀, 韓婷, 朱波
【申請(qǐng)人】浙江農(nóng)林大學(xué)