一種新型的脂肪酶的制作方法
【專利說明】-種新型的脂肪酶 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體地，涉及具有脂肪酶活性的多膚、其編 碼核酸，W及包含所述編碼核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明還涉及上述多膚的制備方 法及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可W催化Η醜甘油醋水解為甘油和游離 脂肪酸，還可W催化其他醋類的水解和轉(zhuǎn)醋化W及醋類的合成反應(yīng)。此外，脂肪酶還表 現(xiàn)出對底物的對映選擇性。W上特性賦予了脂肪酶在食品油脂加工、洗涂劑、生物柴油、 醋鍵化合物的合成和手性藥物合成等工業(yè)的廣泛應(yīng)用（AbhishekKumarSin曲，Mausumi Muldiopadhyay.OverviewofF^mgalLipase:AReview. 2012, 166(2):486-520)0
[0004] 例如，在油脂加工方面，由于脂肪酶的引入，油脂水解可在常溫常壓下進(jìn)行，因此 不會使高度不飽和脂肪酸和生育酪等生物物質(zhì)變性。在乳品加工方面，應(yīng)用脂肪酶在乳品 中進(jìn)行乳脂水解，可增強(qiáng)干酪、奶粉、奶油的風(fēng)味，促進(jìn)干酪的成熟，改善乳制品的品質(zhì)。在 面食加工方面，添加脂肪酶，使面食彈性提高，改善食感，提高面包的保鮮能力（王自社，張 繼，馬君義，史春.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué).2011，39 (7): 3798-3800)。在醫(yī)療方面，脂肪酶作為診 斷工具，可預(yù)測疾病，如血清中脂肪酶可用于檢測急性膜腺炎和膜腺損傷。脂肪酶在藥物生 產(chǎn)、減輕體重等方面也有應(yīng)用。在生物柴油合成方面，酶法具有提取純化工藝簡單、設(shè)備投 資少、耗能低、污染小等優(yōu)點(diǎn)，日益引起人們的普遍關(guān)注，其中織物膜固定化的Novozym435 和Candidasp. 99-125是生產(chǎn)生物柴油的常用酶。在洗涂工業(yè)方面，1988年，諾維信公司首 先將含脂肪酶且能有效除去油污的洗涂劑推向市場，應(yīng)用遺傳工程開發(fā)出洗涂劑用脂肪酶 更是現(xiàn)代生物技術(shù)大規(guī)模工業(yè)化最成功的應(yīng)用之一。在紙漿和造紙工業(yè)，脂肪酶被用來除 去紙漿中的"洽脂"，日本Nippon紙業(yè)研制了一種"洽脂"控制方法，即用Candidarugasa 脂肪酶水解甘Η醋，水解度達(dá)90 %。
[0005] 脂肪酶廣泛存在于動植物和微生物中，由于微生物不但種類多、繁殖快、易發(fā)生遺 傳變異，而且具有比動物更廣泛的抑值、溫度范圍W及底物專一性，因此微生物脂肪酶是 工業(yè)用脂肪酶的重要來源。據(jù)統(tǒng)計(jì)，產(chǎn)脂肪酶的微生物有65個屬，主要集中在黑曲霉、假絲 酵母、根霉、假單胞菌、鏈霉菌和堿假單胞菌等菌株（王自社，張繼，馬君義，史春.安徽 農(nóng)業(yè)科學(xué).2011，39(7) :3798-3800)。
[0006] 脂肪酶在乳制品中使用可W產(chǎn)生香味，因此可W應(yīng)用在乳酪制造中。傳統(tǒng)上，使用 來自山羊或小牛等反白動物脂肪酶制劑。送些制劑來自送些動物的前胃組織，也被稱作為 前胃脂肪酶。市場上存在商業(yè)試劑PiccaMase'K^LKGandK值SMFoodSpecialties, 荷蘭）。送些脂肪酶被用于多種意大利、西班牙、希臘和法國乳酪制備中，送些類型乳酪熟化 期間特定香味譜的產(chǎn)生很大程度上歸因于脂肪酶對乳脂肪的作用。脂肪酶催化乳脂肪的水 解，產(chǎn)生游離脂肪酸。所述脂肪酸可W具有短鏈（C4-Q脂肪酸，即了酸、己酸）和中到長鏈 (Ci2-Cis)脂肪酸。隨后游離脂肪酸可參與化學(xué)反應(yīng)，例如香味化合物，如己酸己醋、目-麗 酸、甲基麗、醋和內(nèi)醋的形成。香味組分中的脂肪酸的轉(zhuǎn)化可W由來自乳酪中的微生物種群 中的酶催化。
[0007] 使用的脂肪酶可W影響乳酪中釋放的游離脂肪酸的類型，例如，辛辣的、強(qiáng)烈的香 味主要產(chǎn)生于釋放短鏈脂肪酸（C4-Ce)的脂肪酶，而中長鏈脂肪酸則會產(chǎn)生肥皂樣的口味。 所W許多研究致力于將脂肪酶改造為短鏈偏好型，W應(yīng)用于乳酪制造。
[000引發(fā)明概述
[0009] 第一方面，提供了具有脂肪酶活性的多膚，其包含選自W下的序列或由選自W下 的序列組成：
[0010] (a)如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，W及
[0011] 化）由（a)所述的序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，其中 由化）獲得的多膚變體仍保持脂肪酶活性。
[0012] 在任選的實(shí)施方案中，上述多膚與異源多膚融合。
[0013] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多膚包含SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。在優(yōu)選的 實(shí)施方案中，上述多膚由SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列組成。在本文中，由SEQIDNO: 1 所示的氨基酸序列組成的多膚被命名為化2。
[0014] 第二方面，提供了編碼本發(fā)明的多膚的多核巧酸，其包含選自W下的序列或由選 自W下的序列組成：
[0015] (a)核巧酸序列，其編碼SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列或在上述序列中包含至少 一個氨基酸取代、缺失或添加的序列；W及
[0016] 化）在嚴(yán)格條件下與a)中的核巧酸序列雜交的核巧酸序列。
[0017] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸其包含SEQIDN0:2所示的核巧酸序列。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，上述多核巧酸由SEQIDN0:2所示的核巧酸序列組成。
[0018] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明的多核巧酸是通過人工合成產(chǎn)生的或是通過重組產(chǎn)生 的，優(yōu)選為合成產(chǎn)生的。
[0019] 第Η方面，提供了表達(dá)載體，其包含至少一種上述的多核巧酸。
[0020] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的表達(dá)載體還包含調(diào)節(jié)多核巧酸表達(dá)的調(diào)控序列，其 中多核巧酸與調(diào)控序列可操作地連接。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體為祀T24a(+)。
[0021] 第四方面，提供了包含本發(fā)明的多核巧酸或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。在優(yōu)選的實(shí)施 方案中，宿主細(xì)胞為大腸桿菌化21 0E3)。
[0022] 第五方面，提供了制備本發(fā)明的多膚的方法，其包括：
[0023] 1)將權(quán)利要求3-5中任一項(xiàng)所述的多核巧酸克隆在表達(dá)載體上，
[0024] 2)將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)至合適的宿主細(xì)胞中，
[00巧]3)在合適的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，
[0026] 4)從所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基中分離并純化所述多膚。
[0027] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提供了制備由SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列組成的多膚 的方法，其包括；將編碼SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列的核巧酸序列克隆在質(zhì)粒表達(dá)載體 中，W及將帶有該多核巧酸序列的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，然后從大 腸桿菌中分離并純化FL2多膚。
[0028] 第六方面，提供了本發(fā)明的多膚在制備乳制品中的用途。在一實(shí)施方案中，上述乳 制品為乳酪。
[0029] 本發(fā)明的多膚具有短鏈偏好性和/或W下的一種或多種特性：在廣泛的抑范圍內(nèi) 具有很好的酶活性和穩(wěn)定性，具有一定的表面活性劑耐受性，W及在鐘離子存在下表現(xiàn)出 高的脂肪酶活性。
[0030] 附圖簡要說明
[003。圖1顯示了FL2多膚的凝膠電泳圖。第1泳道為分子量標(biāo)志物，第2泳道為化2 多膚。
[003引圖2顯示了分別WpNPP和pNPB為底物時，F(xiàn)L2在不同溫度下的酶活力。
[003引圖3顯示了WpNPP為底物時，F(xiàn)L2在不同抑下的酶活力。
[0034] 圖4顯示了WpNPP為底物時，F(xiàn)L2在不同抑下的脂肪酶活性的穩(wěn)定性。
[0035] 圖5顯示了分別W4-硝基苯基了酸醋（pNPB)、4-硝基苯基辛酸醋（pNPO)、4-硝 基苯基月桂酸醋（pNPD)、4-硝基苯基肉豆護(hù)酸醋（pNPM)、4-硝基苯基蹤擱酸醋（pNP巧和 4-硝基苯基硬脂酸醋（pNP巧作為底物時，F(xiàn)L2作為脂肪酶的催化水解活性。
[0036] 圖6顯示了分別WpNPP和pWB作為底物時，金屬離子對FL2脂肪酶活力的影響。 對照組是在反應(yīng)體系中添加水，其余組在反應(yīng)體系中分別添加化S〇4、MnClz、C0CI2、化〇2、 Μ拆〇4、CuS〇4、KC1、（NH4)2S04、NaCl、NiS04、FeCls和EDTA無機(jī)鹽膽存液。
[0037] 圖7顯示了分別WpNPP和pWB作為底物時，表面活性劑對于FL2脂肪酶活力的 影響。對照組在反應(yīng)體系中添加水，其余組在反應(yīng)體系中分別添加0.5%的陽離子表面活性 CTAB、陰離子表面活性劑SDS、非離子表面活性劑TweenSO、AE0-9和TritonX-100。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 本發(fā)明的《化
[0039] 本申請?zhí)峁┝司哂兄久富钚缘亩嗄w，其包含選自W下的序列或由選自W下的序 列組成：
[0040] (a)如SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列，W及
[0041] 化）由（a)所述的序列經(jīng)過取代、缺失或添加至少一個氨基酸后得到的序列，其中 由化）獲得的多膚變體仍保持脂肪酶活性。
[0042] 在某些實(shí)施方案中，上述氨基酸取代、缺失或添加的數(shù)目為1-30個，優(yōu)選為1-20 個，更優(yōu)選為1-10個，其中獲得的多膚變體基本上保持未改變的蛋白的脂肪酶活性。在優(yōu) 選的實(shí)施方案中，上述多膚變體與S