攜帶pd-l1阻斷劑的嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫治療領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明設(shè)及攜帶PD-L1阻斷劑的嵌合抗原 受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 免疫效應(yīng)細(xì)胞（如T淋己細(xì)胞）在腫瘤免疫應(yīng)答中的作用日益受到重視。目前， 基于T淋己細(xì)胞的過繼性免疫治療在部分腫瘤中取得了一定的效果，并且該種免疫治療方 法可W克服抗體治療的缺陷，但在大多數(shù)腫瘤的療效仍不能令人滿意。近年來，根據(jù)CTL對(duì) 祀細(xì)胞的識(shí)別特異性依賴于T淋己細(xì)胞受體燈CellReceptor,TCR)的發(fā)現(xiàn)，將針對(duì)腫瘤 細(xì)胞相關(guān)抗原的抗體的scFv與T淋己細(xì)胞受體的CD3ζ或FcεRI丫等胞內(nèi)信號(hào)激活基序 融合成嵌合抗原受體煙limericantigenreceiptor,CAR),并將其通過如慢病毒感染等方 式基因修飾在T淋己細(xì)胞表面。運(yùn)種CART淋己細(xì)胞能夠W主要組織相容性復(fù)合物（Major HistocompatibilityComplex,MHC)非限制性方式選擇性地將T淋己細(xì)胞定向到腫瘤細(xì)胞 并特異性地殺傷腫瘤。
[0003] 嵌合抗原受體包括胞外結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。通常胞外區(qū)包含能夠識(shí)別 腫瘤相關(guān)抗原的scFv，跨膜區(qū)采用CD8，CD28等分子的跨膜區(qū)，胞內(nèi)信號(hào)區(qū)采用免疫受體酪 氨酸活化基序（ITAM)CD3ζ或化εRI丫及共刺激信號(hào)分子CD28、CD27、CD137、CD134等的 胞內(nèi)信號(hào)區(qū)。
[0004] 胞內(nèi)信號(hào)區(qū)僅包含ΙΤΑΜ的為第一代CARΤ淋己細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分按 如下形式連接：scFv-TM-ITAM。該種CART可W激發(fā)抗腫瘤的細(xì)胞毒性效應(yīng)，但是細(xì)胞因子 分泌比較少，并且在體內(nèi)不能激發(fā)持久的抗腫瘤效應(yīng)。
[0005] 隨后發(fā)展的第二代CART淋己細(xì)胞加入了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞內(nèi) 信號(hào)區(qū)，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接：SCFV-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-/ CD137-ITAM。胞內(nèi)信號(hào)區(qū)發(fā)生的B7/CD28或4-1B化/CD137共刺激作用引起T淋己細(xì)胞的 持續(xù)增殖，并能夠提高T淋己細(xì)胞分泌IL-2和IFN- 丫等細(xì)胞因子的水平，同時(shí)提高CART 在體內(nèi)的存活周期和抗腫瘤效果。
[0006] 近些年發(fā)展的第Ξ代CART淋己細(xì)胞，其中嵌合抗原受體各部分按如下形式連接： scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或scFv-TM-CD28-CD134-ITAM，進(jìn)一步提高了CART在體內(nèi)的存 活周期和其抗腫瘤效果。
[0007] 盡管免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤免疫治療中具有誘人的前景，但是其在實(shí)體瘤中的療效 仍不顯著，免疫效應(yīng)細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的存活率較差、活性不高。因此，本領(lǐng)域仍然需要進(jìn) 行進(jìn)一步的研究，W期進(jìn)一步提高免疫效應(yīng)細(xì)胞對(duì)于腫瘤免疫治療的療效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供攜帶PD-L1阻斷劑的嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0009] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞，它攜帶或表 達(dá)PD-Ll(程序性死亡配體1)阻斷劑度locker)。
[0010] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的PD-L1阻斷劑包括（但不限于）：
[0011]可溶性PD-l(sPD-l);
[0012] 可溶性PD-1與hIgG4el-Fc的C冊(cè)結(jié)構(gòu)域的融合膚；
[0013] 可溶性PD-1與hIgG4el-Fc的融合膚；或
[0014] 特異性抗PD-L1抗體。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述的可溶性PD-1包括：信號(hào)膚和胞外區(qū)；較佳地，所述的信 號(hào)膚是如SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列編碼而成的；較佳地，所述的胞外區(qū)是如SEQID N0:2所示的核巧酸序列編碼而成的。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的hIgG4el-Fc的C冊(cè)結(jié)構(gòu)域是如SEQIDN0:2所示的核巧 酸序列編碼而成的；和/或
[0017] 所述的hIgG4el-Fc的序列是第288位由Ser突變?yōu)镻ro的。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的嵌合抗原受體包括：胞外抗原結(jié)合區(qū)，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào) 區(qū)，其中所述胞外抗原結(jié)合區(qū)是特異性結(jié)合腫瘤高表達(dá)的抗原的抗體。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)包括（但不限于）：CD3C，F(xiàn)ceRI丫，CD27， CD28,4-1BB(CD137)，CD134,CD40的胞內(nèi)信號(hào)區(qū)序列或Myd88,或其組合。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的跨膜區(qū)包括（但不限于）：CD8(如CD8α)跨膜區(qū)，CD28 跨膜區(qū)。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述的胞外抗原結(jié)合區(qū)和跨膜區(qū)之間，還包括較鏈區(qū)；較佳地， 該較鏈區(qū)包括：CD8(如CD8α)較鏈區(qū)。
[002引在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤高表達(dá)的抗原包括（但不限于）：EGFR，GPC3,肥R2，E；pM2,ClaudinlS. 1，ClaudinlS. 2,Claudin6,GD2,lipCAM，mesothelin，CD19,CD20,ASGPR1， EGFRvIII，de4EGFR，CD19,CD33,IL13R，LMPl，PLACl，NY-ESO-1，MAGE4,MUCl，MUC16,LeY， CEA，CAIX，CD123。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述的特異性結(jié)合腫瘤高表達(dá)的抗原的抗體是：單鏈抗體或結(jié) 構(gòu)域抗體。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞包括：Τ淋己細(xì)胞，NK細(xì)胞或NKT細(xì)胞，Treg 細(xì)胞。
[00巧]在本發(fā)明的另一方面，提供一種核酸構(gòu)建物，其編碼用于修飾免疫效應(yīng)細(xì)胞的融 合多膚，所述的核酸構(gòu)建物包括順序連接的：PD-L1阻斷劑編碼序列，胞外抗原結(jié)合區(qū)編碼 序列，跨膜區(qū)和胞內(nèi)信號(hào)區(qū)編碼序列；其中所述胞外抗原結(jié)合區(qū)是特異性結(jié)合腫瘤高表達(dá) 的抗原的抗體。
[0026] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的PD-L1阻斷劑編碼序列和胞外抗原結(jié)合區(qū)編碼序列之 間，W連接膚編碼序列連接；和/或。
[0027] 所述的PD-L1阻斷劑編碼序列和胞外抗原結(jié)合區(qū)編碼序列之間，還包括核糖體跳 躍序列（F2A)。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的連接膚是（GlyGlyGlyGlySe;r)3。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，其包含編碼所述的核酸構(gòu)建物。
[0030] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種病毒，所述的病毒包含所述的表達(dá)載體。
[0031] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的核酸構(gòu)建物、或包含該核酸構(gòu)建物的表達(dá)載體 或病毒的用途，用于制備祀向腫瘤的嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0032] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的免疫效應(yīng)細(xì)胞是表達(dá)PD-1的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的用途，用 于制備抑制腫瘤的藥物組合物。
[0034] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于抑制腫瘤的藥物組合物，其包括：所述的嵌合 受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供PD-L1阻斷劑的用途，用于制備嵌合抗原受體修飾的 免疫效應(yīng)細(xì)胞，增加免疫效應(yīng)細(xì)胞的抗腫瘤作用。
[0036] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的PD-L1阻斷劑包括（但不限于）：
[0037]可溶性PD-1;
[003引可溶性PD-1與hIgG4el-Fc的C冊(cè)結(jié)構(gòu)域的融合膚；
[003引可溶性PD-1與hIgG4el-Fc的融合膚；或[0040] 特異性抗PD-L1抗體。
[00川在另一優(yōu)選例中，所述的腫瘤是表達(dá)（或高表達(dá)）PD-L1的腫瘤。
[0042] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備嵌合抗原受體修飾的免疫效應(yīng)細(xì)胞的方法， 所述的方法包括：將所述的核酸構(gòu)建物轉(zhuǎn)入免疫效應(yīng)細(xì)胞中。
[0043] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0044]圖1、人源可溶性PD-1 (sPD-1)、sPD-1-C冊(cè)、sPD-1-Fc融合蛋白示意圖。
[0045] 圖2、sPD-1-Fc與M27-CAR融合蛋白示意圖。其中，化和VH分別表示單鏈抗體 M27 (即Y022單鏈抗體，它可特異性識(shí)別抗原EGFRvIII及過量表達(dá)的EGFR，參見中國專利 【申請(qǐng)?zhí)枴?01510431481.6)的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)。CAR區(qū)中，4-lBB-CD3C簡稱為BBZ， CD28-CD3ζ簡稱為 28Z，CD28-4-1BB-CD3ζ簡稱為 28BBZ。
[0046]圖 3、sPD-1-C冊(cè)/sPD-l-Fc-F2A-M27CARΤ細(xì)胞的陽性率。
[0047] 圖4、sPD-l-C冊(cè)/sPD-l-Fc在感染T細(xì)胞&上清中的表達(dá)。其中，lysis表示裂解 液，supernatant表示上清液。
[004引圖5、腫瘤細(xì)胞系中EGFR2S7 3°2表位的暴露情況。
[0049] 圖6、PD-L1W及EGFR在各種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)情況分析。
[0050]圖 7、SPD-1-FC-F2A-M27CART細(xì)胞對(duì)U87-EGFR、U87-EGFRVIII、A431、CAL27 的殺傷效果。圖中，M27-28Z、M27-BBZ、M27-28BBZ表示轉(zhuǎn)入了僅表達(dá)M27-28Z、M27-BBZ、 M27-28BBZ的T淋己細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；FC-28Z、FC-BBZ、FC-28BBZ表示轉(zhuǎn)入了表達(dá) SPD-1-FC-F2A-M27-28Z