本公開(kāi)涉及至少對(duì)抗原CD22和CD79是雙特異性的分子，包含所述分子的制劑，以及其中任一種在治療中用途。本公開(kāi)還擴(kuò)展至制備所述分子和所述制劑的方法。在獨(dú)立的方面，本公開(kāi)還擴(kuò)展至本文所描述的新的抗體序列和片段。發(fā)明背景體內(nèi)生物學(xué)機(jī)制是極其復(fù)雜的信號(hào)級(jí)聯(lián)，其難以解卷積和理解。此類信號(hào)傳導(dǎo)的一個(gè)實(shí)例是激活B細(xì)胞所需的信號(hào)傳導(dǎo)。B細(xì)胞抗原受體(BCR)由膜免疫球蛋白(mIg)分子和締合的Igα/Igβ(CD79a/CD79b)異二聚體(α/β)組成。mIg亞單位結(jié)合抗原，導(dǎo)致受體聚集，而α/β亞單位將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi)部。BCR聚集快速激活Src家族激酶Lyn、Blk和Fyn以及Syk和Btk酪氨酸激酶。這啟動(dòng)由BCR、上述酪氨酸激酶、銜接體蛋白質(zhì)(諸如CD19和BLNK)以及信號(hào)傳導(dǎo)酶(諸如PLCγ2、PI3K和Vav)組成的“信號(hào)體”的形成。從信號(hào)體發(fā)出的信號(hào)激活涉及激酶、GTP酶和轉(zhuǎn)錄因子的多個(gè)信號(hào)級(jí)聯(lián)。這導(dǎo)致細(xì)胞代謝、基因表達(dá)和細(xì)胞骨架組構(gòu)的變化。BCR信號(hào)傳導(dǎo)的復(fù)雜性允許許多不同的結(jié)果，包括存活、耐受性(無(wú)反應(yīng)性)或凋亡、增殖和分化為抗體產(chǎn)生細(xì)胞或記憶B細(xì)胞。應(yīng)答的結(jié)果由細(xì)胞的成熟狀態(tài)、抗原的性質(zhì)、BCR信號(hào)傳導(dǎo)的幅度和持續(xù)時(shí)間以及來(lái)自其它受體(諸如CD40、IL-21受體和BAFF-R)的信號(hào)確定。許多其它跨膜蛋白質(zhì)(其中一些是受體)調(diào)節(jié)BCR信號(hào)傳導(dǎo)的特定元件。其中一些，包括CD45、CD19、CD22、PIR-B和FcγRIIB1(CD32)。BCR信號(hào)傳導(dǎo)的幅度和持續(xù)時(shí)間受包括涉及Lyn/CD22/SHP-1途徑、Cbp/Csk途徑、SHIP、Cbl、Dok-1、Dok-3、FcγRIIB1、PIR-B的負(fù)反饋環(huán)和BCR的內(nèi)化限制。在體內(nèi)，B細(xì)胞通常由捕獲抗原并在其細(xì)胞表面上展示它們的抗原呈遞細(xì)胞激活。通過(guò)此類膜相關(guān)抗原激活B細(xì)胞需要BCR誘導(dǎo)的細(xì)胞骨架重構(gòu)。自身反應(yīng)性B細(xì)胞負(fù)責(zé)產(chǎn)生可直接或間接引起或加重自身免疫病癥的致病性自身抗體。CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的耗盡已經(jīng)用于成功治療許多自身免疫病癥，并因此結(jié)論性地確定B細(xì)胞在引起或維持許多自身免疫性疾病中起重要作用。盡管B細(xì)胞耗盡已經(jīng)是成功的治療選擇，但也存在控制B細(xì)胞生長(zhǎng)和激活狀態(tài)也可以是調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能的有效方式的證據(jù)。因此，需要不耗盡B細(xì)胞并提供控制B細(xì)胞而沒(méi)有已被證明與一些副作用相關(guān)的長(zhǎng)期抑制B細(xì)胞免疫性的靈活性的替代策略。此外，并非所有B細(xì)胞應(yīng)答或活性都是有害的，并且證據(jù)表明維持調(diào)節(jié)性B細(xì)胞群可能是保護(hù)性的。這樣的方法應(yīng)該在由不適當(dāng)或過(guò)量的BcR信號(hào)傳導(dǎo)引起的具有異常B細(xì)胞功能的疾病中有效。實(shí)例包括但不限于炎癥、自身免疫和癌癥。特別感興趣的是對(duì)BcR信號(hào)傳導(dǎo)具有直接需求或需要抑制或刺激體液免疫應(yīng)答的疾病。雙特異性抗體被廣泛預(yù)期在下一代生物治療劑中起主要作用(D.Holmes,NatureRevDrugDiscNov2011:10；798)。它們具有在更大比例的患者中提供優(yōu)異的、長(zhǎng)期的、廣泛的功效的潛力。這可以通過(guò)在共同疾病途徑中同時(shí)共同接合不同的抗原從而減少冗余來(lái)實(shí)現(xiàn)；或通過(guò)靶向來(lái)自獨(dú)立途徑的抗原以提供累加或協(xié)同效應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。迄今為止，抑制B細(xì)胞功能而不缺失B細(xì)胞的策略已經(jīng)集中在利用CD32b(FcgRIIB)的天然調(diào)節(jié)機(jī)制。這些包括針對(duì)CD79b/CD32b(Veri等人，Arthritis&Rheumatism2010621933-1943)、CD19/CD32b(Karnell等人，J.Immunol20141921480-1490)的雙特異性抗體和具有增強(qiáng)的CD32b結(jié)合的具有Fc的CD19抗體(Chu等人，Arthritis&Rheumatology2014661153-1164)。發(fā)生Fcγ受體IIb(CD32b)與B細(xì)胞受體的共連接以天然地調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)，特別是當(dāng)抗原與小的免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合時(shí)。然后CD32b募集拮抗BcR激活的磷酸酶SHP-1和SHIP-1。盡管這種天然調(diào)節(jié)機(jī)制可以控制B細(xì)胞功能，但是由CD32b的蛋白質(zhì)序列變異引起的CD32b功能的破壞可以導(dǎo)致自身免疫疾病，并且該受體可以在自身免疫疾病中下調(diào)，例如在SLE的情況下。因此，阻斷B細(xì)胞活性的替代方式是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兲峁┱{(diào)節(jié)BcR功能的替代的、非天然的方式。當(dāng)天然機(jī)制在給定疾病中失去功能時(shí)，這些替代機(jī)制可能是特別重要的。雙特異性抗體有助于獲得新型生物學(xué)，諸如：1)如果合適的話，細(xì)胞上的交聯(lián)受體，2)誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的效應(yīng)，3)將細(xì)胞因子定位于細(xì)胞以調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)或局部阻斷細(xì)胞因子功能，4)同時(shí)接合多個(gè)表位以產(chǎn)生“新活性”、增加功能或特異性，其可能不會(huì)由單一單克隆抗體表現(xiàn)或?qū)嶋H上是未連接的抗體的混合物(“聚-單克隆”)，包括涉及不同抗原的混合物。本發(fā)明人已經(jīng)出乎意料地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用雙特異性抗體將BcR(CD79)偶聯(lián)到陰性調(diào)節(jié)分子CD22(在正常生理?xiàng)l件下CD22將被從復(fù)合物中排除)上可以抑制BcR信號(hào)傳導(dǎo)。CD22負(fù)責(zé)在不存在抗原結(jié)合的情況下通過(guò)BcR調(diào)節(jié)補(bǔ)充性(tonic)信號(hào)傳導(dǎo)。然而，一旦抗原結(jié)合，CD22通常被從BcR復(fù)合物中排除。通過(guò)使用雙特異性抗體物理連接BcR與CD22信號(hào)傳導(dǎo)，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)可抑制B細(xì)胞中的激活。因此，本發(fā)明人已經(jīng)鑒定了至少針對(duì)CD22和CD79是雙特異性的分子的協(xié)同功能。當(dāng)以雙特異性(多特異性)形式提供具有特異性組合的結(jié)合區(qū)而不是簡(jiǎn)單地作為例如單克隆抗體或其結(jié)合片段的混合物提供時(shí)，這種功能似乎是初始可檢測(cè)的。因此，本發(fā)明的多特異性分子可用于控制與某些疾病諸如自身免疫和癌癥相關(guān)的異常B細(xì)胞功能。本公開(kāi)內(nèi)容的概述因此提供了包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性分子。根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性形式的組合在功能性體外測(cè)定中顯示出令人感興趣的生物活性，例如抑制B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，如通過(guò)以下任一測(cè)量而得：除了在B細(xì)胞上抑制CD86、CD71和/或CD40的表達(dá)外，抑制AktS473的磷酸化、抑制P38和PLCγ2Y759的磷酸化、抑制IkB。單獨(dú)的組分或混合物中提供的組分的相同水平的活性不明顯。然而，當(dāng)提供具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的雙特異性構(gòu)建體時(shí)，活性明顯。在這些測(cè)定中觀察到的抑制表明包含特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的本發(fā)明的多特異性分子可用于改變B細(xì)胞功能并提供B細(xì)胞耗盡的治療性替代物。B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)是B細(xì)胞的關(guān)鍵功能并且是B細(xì)胞的抗原特異性激活所必需的。BcR信號(hào)傳導(dǎo)從B細(xì)胞發(fā)展的早期到記憶B細(xì)胞應(yīng)答的激活和發(fā)展是關(guān)鍵的。B細(xì)胞受體由與CD79a和CD79b的異二聚體復(fù)合物締合的表面免疫球蛋白(Ig)分子組成。當(dāng)表面Ig識(shí)別抗原時(shí)，據(jù)認(rèn)為這導(dǎo)致CD79a/b復(fù)合物的聚集，其導(dǎo)致包括Src家族激酶以及Syk和Btk酪氨酸激酶的即時(shí)信號(hào)級(jí)聯(lián)的下游激活。然后，該信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物可以募集銜接體蛋白質(zhì)諸如CD19和BLNK，并導(dǎo)致PLCγ2和PI3K的激活，其繼而可以激活進(jìn)一步的下游途徑，諸如控制B細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和分化的那些途徑。該信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物可以通過(guò)經(jīng)由BAFF-R、IL-21R和CD40的信號(hào)傳導(dǎo)的其它第二信號(hào)進(jìn)一步調(diào)節(jié)，并且還可以通過(guò)其他信號(hào)傳導(dǎo)分子諸如CD19、CD21、CD83、CD22、CD32b和CD45等調(diào)節(jié)。在通過(guò)BcR識(shí)別抗原時(shí)，激活的第一應(yīng)答之一是表面受體諸如共刺激分子CD80和CD86的上調(diào)。這些分子結(jié)合T細(xì)胞上的相應(yīng)受體，其提供進(jìn)一步的存活和激活信號(hào)，所述信號(hào)允許在MHCII類的背景中識(shí)別抗原的T細(xì)胞的存活和擴(kuò)增。通過(guò)B細(xì)胞在II類MHC的背景下將抗原呈遞回釋放諸如IL-2和IL-21的因子的T細(xì)胞的能力，該應(yīng)答得到進(jìn)一步放大。這些細(xì)胞因子又大大擴(kuò)增了B細(xì)胞的數(shù)量。因此，CD86在細(xì)胞表面上的下調(diào)可以指示B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的抑制。此外，B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)的抑制可導(dǎo)致下游功能的抑制。一個(gè)這樣的結(jié)果是抑制共刺激分子諸如CD86(或其表達(dá)降低)，這將導(dǎo)致T細(xì)胞功能、存活和分化的抑制。因此，B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)的抑制可有益于控制與自身免疫和癌癥相關(guān)的異常B細(xì)胞功能。B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)是自身免疫疾病中B細(xì)胞增殖、分化、抗原呈遞和細(xì)胞因子釋放所必需的。因此，抑制BcR活性可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞功能，諸如免疫球蛋白分泌、T細(xì)胞激活和控制與例如自身免疫病癥相關(guān)的不適當(dāng)?shù)腂細(xì)胞活性。此外，還有一些B細(xì)胞白血病和淋巴瘤需要B細(xì)胞受體信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)存活和生長(zhǎng)，這可以通過(guò)B細(xì)胞受體激活的抑制劑來(lái)控制。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域各自獨(dú)立地包含特異性針對(duì)相關(guān)抗原(諸如CD22或CD79或如果是三特異性則為另外的抗原分子)的一個(gè)或兩個(gè)(諸如兩個(gè))抗體可變結(jié)構(gòu)域。本文所用的CD79是指由CD79a和CD79b組成的復(fù)合物。因此，結(jié)合CD79的抗體或結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合CD79a和/或CD79b。本文所用的結(jié)合CD79a和/或CD79b是指特異性針對(duì)CD79a、特異性針對(duì)CD79b和既特異性針對(duì)CD79a又特異性針對(duì)CD79b(即識(shí)別CD79a上的表位并且相同的抗體或結(jié)合結(jié)構(gòu)域也識(shí)別CD79b上的表位，即泛(pan)特異性)或特異性針對(duì)CD79a和CD79b的復(fù)合物(即識(shí)別以復(fù)合物形式的CD79a和CD79b的相互作用形成的表位，并且這能夠區(qū)分復(fù)合物與個(gè)體成分)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的分子中使用的抗體或其結(jié)合片段特異性針對(duì)CD79a。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的分子中使用的抗體或其結(jié)合片段特異性針對(duì)CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的分子中使用的抗體或其結(jié)合片段特異性針對(duì)CD79復(fù)合物，即它識(shí)別存在于復(fù)合物中并且特異性針對(duì)例如包含CD79a和CD79b之間相互作用的表位。在一個(gè)實(shí)施方案中，甚至在結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)CD79a或CD79b的情況下，應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)處于復(fù)合物形式時(shí)，結(jié)合結(jié)構(gòu)域優(yōu)選仍結(jié)合CD79a或CD79b，因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)在細(xì)胞表面上天然共表達(dá)。當(dāng)在一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或在每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中存在兩個(gè)可變區(qū)時(shí)，則兩個(gè)可變區(qū)通常協(xié)同工作以提供對(duì)相關(guān)抗原的特異性，例如它們是同源對(duì)或親和力成熟以提供足夠的親和力，使得所述結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)特定抗原。通常它們是重鏈和輕鏈可變區(qū)對(duì)(VH/VL對(duì))。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子是雙特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子是三特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子對(duì)CD79是單特異性的，對(duì)CD22是單特異性的，即該分子僅包含一個(gè)結(jié)合CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)結(jié)合CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子是單鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子包含重鏈以及輕鏈。在一個(gè)實(shí)例中，本文所用的重鏈和輕鏈對(duì)不被稱為二聚體，特別是在一個(gè)實(shí)施方案中本公開(kāi)的分子不包含多聚體，諸如抗體、單位/片段或成分的二聚體。在一個(gè)方面，提供了多特異性抗體分子，其包含或由以下組成：a)式(I)的多肽鏈：VH-CH1-X-(V1)p；b)式(II)的多肽鏈：VL-CL-Y-(V2)q；其中：VH表示重鏈可變結(jié)構(gòu)域；CH1表示重鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，例如其結(jié)構(gòu)域1；X表示鍵或接頭，例如氨基酸接頭；Y表示鍵或接頭，例如氨基酸接頭；V1表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；VL表示可變結(jié)構(gòu)域，例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；CL表示來(lái)自恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，例如輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，諸如Cκ；V2表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；p是0或1；q是0或1；以及當(dāng)p是1時(shí)q是0或1并且當(dāng)q是1時(shí)p是0或1，即p和q不同時(shí)為0。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述分子包含針對(duì)CD22的不超過(guò)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和針對(duì)CD79的不超過(guò)一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。上述形式對(duì)于篩選可變區(qū)的組合特別有用，例如在長(zhǎng)期測(cè)定中和用于治療用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，q是0并且p是1。在一個(gè)實(shí)施方案中，q是1并且p是1。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是dab并且V2是dab，并且它們一起形成可操作的可變區(qū)對(duì)、諸如同源VH/VL對(duì)的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH和VL特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V2特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1和V2一起(例如作為一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH和VL特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V2特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1和V2一起(例如作為一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子是或包含融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子，其是具有式A-X:Y-B的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中：A-X是第一融合蛋白；Y-B是第二融合蛋白；X:Y是異二聚體系鏈；A包含特異性針對(duì)CD22或CD79的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域；B包含特異性針對(duì)CD22或CD79的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；X是結(jié)合對(duì)的第一結(jié)合伴侶；Y是該結(jié)合對(duì)的第二結(jié)合伴侶；以及:是X和Y之間的相互作用(諸如結(jié)合相互作用)，以及其中A或B中的至少一個(gè)特異性針對(duì)CD22而另一個(gè)特異性針對(duì)CD79。上述形式是方便的形式，因?yàn)槠涮峁┝私M裝雙特異性形式的快速和有效的方式，例如可以在功能測(cè)定中進(jìn)行體外測(cè)試。這可以促進(jìn)優(yōu)選的可變區(qū)對(duì)的選擇，其隨后可以并入替代的、治療性多特異性抗體形式中。雖然不希望受理論束縛，但是特異性針對(duì)CD22的可變區(qū)的不同排列與一系列特異性針對(duì)CD79的可變區(qū)組合可以獲得生物功能中的不同細(xì)微差別。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的多特異性分子或摻入任何其它合適的抗體形式的新型CD22抗體。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明的多特異性分子或摻入任何其它合適的抗體形式的新型CD79抗體。附圖說(shuō)明圖1是具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制磷酸化Akt的相對(duì)效力的條形圖。圖2是具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制磷酸化PLCγ2的相對(duì)效力的條形圖。圖3是具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制CD86表達(dá)的相對(duì)效力的條形圖。圖4是具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的雙特異性抗體、二價(jià)抗體或抗體混合物抑制磷酸化Akt的相對(duì)效力的條形圖。圖5是具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的雙特異性抗體、二價(jià)抗體或抗體混合物抑制磷酸化PLCγ2的相對(duì)效力的條形圖。圖6是顯示CD22和CD79b的雙特異性組合對(duì)抗IgM刺激的B細(xì)胞中的總IkB水平的影響的滴定的圖。圖7是顯示CD22和CD79b的雙特異性組合對(duì)抗IgM刺激的B細(xì)胞上CD86表達(dá)的作用的滴定的圖。圖8是具有針對(duì)具有不同V區(qū)的CD22和CD79b的特異性的雙特異性蛋白抑制磷酸化PLCγ2的圖。圖9是提取自Chan和Carter,NatureReviewsImmunologyvol10,May2010,301的圖，其顯示某些抗體形式。圖10是顯示抗原網(wǎng)格交叉特異性的數(shù)據(jù)的表?？乖?＝CD79b，抗原3＝CD22。值是Syk的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)(激活則為負(fù)值)并且代表所評(píng)估的多個(gè)V區(qū)組合的平均值。圖11是顯示抗原網(wǎng)格交叉特異性的數(shù)據(jù)的表?？乖?＝CD79b，抗原3＝CD22。值是PLCγ2的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)(激活則為負(fù)值)并且代表所評(píng)估的多個(gè)V區(qū)組合的平均值。圖12是顯示抗原網(wǎng)格交叉特異性的數(shù)據(jù)的表?？乖?＝CD79b，抗原3＝CD22。值是AKT的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)(激活則為負(fù)值)并且代表所評(píng)估的多個(gè)V區(qū)組合的平均值。圖13是顯示與Fab-Y中CD22特異性的組合的Fab-X中CD79b特異性的每個(gè)V區(qū)組合的Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)的圖圖14是顯示與Fab-Y中CD79b特異性的組合的Fab-X中CD22特異性的每個(gè)V區(qū)組合的Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)的圖。圖15顯示了通過(guò)CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞中抗IgM誘導(dǎo)的磷酸化PLCγ2的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖16顯示了通過(guò)CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞中抗IgM誘導(dǎo)的磷酸化P38的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖17顯示了CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞中抗IgM誘導(dǎo)的磷酸化Akt的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖18顯示了CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞上抗IgM誘導(dǎo)的CD71表達(dá)的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖19顯示了CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞上抗IgM誘導(dǎo)的CD40表達(dá)的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖20顯示了CD79b和CD22特異性Fab-Kd-Fab或BYbe對(duì)B細(xì)胞上抗IgM誘導(dǎo)的CD86表達(dá)的抑制百分?jǐn)?shù)的數(shù)據(jù)。圖21顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD27表達(dá)的抑制。圖22顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD71表達(dá)的抑制。圖23顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD86表達(dá)的抑制。圖24顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4130Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD27表達(dá)的抑制。圖25顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4130Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD71表達(dá)的抑制。圖26顯示CD79b和CD22特異性VR4447/VR4130Bybe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白對(duì)B細(xì)胞上的CD86表達(dá)的抑制。圖27顯示來(lái)自用VR4447/VR4126BYbe、VR4447/VR4127BYbe和VR4447/VR4130BYbe培養(yǎng)的PBMC的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。數(shù)據(jù)表示來(lái)自3個(gè)供體的合并數(shù)據(jù)。圖28顯示來(lái)自用VR4447/VR4126BYbe、VR4447/VR4127BYbe和VR4447/VR4130BYbe培養(yǎng)的純化B細(xì)胞的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。數(shù)據(jù)表示來(lái)自2個(gè)供體的合并數(shù)據(jù)。圖29顯示來(lái)自用VR4447/VR4126BYbe、VR4447/VR4127BYbe、VR4447/VR4130BYbe、VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白培養(yǎng)的PBMC或純化B細(xì)胞的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。數(shù)據(jù)來(lái)自單個(gè)供體。圖30顯示來(lái)自12個(gè)健康者和12個(gè)SLE患者樣品的未刺激的B細(xì)胞中磷酸化的基線水平。圖31顯示CD79b+CD22特異性VR4447/VR4130BYbe對(duì)抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞的NFkB磷酸化的作用，來(lái)自12個(gè)健康志愿者(HV)和12個(gè)SLE供體。圖32顯示CD79b+CD22特異性VR4447/VR4130BYbe對(duì)抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞的Akt磷酸化的作用，來(lái)自12個(gè)健康志愿者(HV)和12個(gè)SLE供體。圖33顯示CD79b+CD22特異性VR4447/VR4130BYbe對(duì)抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞的Syk磷酸化的作用，來(lái)自12個(gè)健康志愿者(HV)和12個(gè)SLE供體。圖34顯示CD79b+CD22特異性VR4447/VR4130BYbe對(duì)抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞的Erk1&2磷酸化的作用，來(lái)自12個(gè)健康志愿者(HV)和12個(gè)SLE供體。本公開(kāi)內(nèi)容的詳述本文所用的“多特異性分子”是指具有特異性結(jié)合至少兩種獨(dú)特抗原(例如不同抗原)的能力的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性分子是雙特異性、三特異性或四特異性分子，特別是雙特異性或三特異性分子。在一個(gè)方面，本公開(kāi)擴(kuò)展至對(duì)至少CD22和CD79a特異的合適形式的分子，以及在多特異性分子(諸如雙特異性或三特異性形式)中對(duì)CD22和CD79a特異的抗體/片段或其組合的用途。在一個(gè)方面，本公開(kāi)擴(kuò)展至對(duì)至少CD22和CD79b特異的合適形式的分子，以及在多特異性分子(諸如雙特異性或三特異性形式)中針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體/片段或其組合的用途。在一個(gè)方面，本公開(kāi)擴(kuò)展至對(duì)至少CD22和CD79a/b復(fù)合物特異的合適形式的分子，以及在多特異性分子(諸如雙特異性或三特異性形式)中對(duì)CD22和CD79a/b復(fù)合物特異性的抗體/片段或其組合的用途。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子是三特異性的，例如其中第三結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠延長(zhǎng)分子的半衰期，例如通過(guò)結(jié)合血清載體蛋白。血漿中存在各種蛋白質(zhì)，包括甲狀腺素結(jié)合蛋白，甲狀腺素視黃質(zhì)運(yùn)載蛋白，α1-酸性糖蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白，血纖蛋白原和白蛋白，或其任何片段(Bartalena&Robbins,1993,ClinicsinLab.Med.13:583-598；Bree等人,1986,Clin.Pharmacokin.11:336-342；Gitlin等人.1964,J.Clin.Invest.10:1938-1951；Peters,1985,AdvProteinChem.37:161-245；Waldeman&Strober,1969,Progr.Allergy,13:1-110)。在一個(gè)實(shí)例中，第三結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ρ灏椎鞍住⒗缛搜灏椎鞍资翘禺愋缘?。多特異性分子形式合適的多特異性分子的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，例如在以下綜述中公開(kāi)的：“ThecomingofAgeofEngineeredMultivalentAntibodies,Nunez-Prado等人DrugDiscoveryTodayVol20Number5Mar2015,page588-594，D.Holmes,NatureRevDrugDiscNov2011:10；798，Chan和Carter,NatureReviewsImmunologyvol10,May2010,301”，通過(guò)引用并入本文。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性形式包括本領(lǐng)域已知的那些和本文所述的那些，諸如其中分子形式選自包含或由以下組成的組：·串聯(lián)sdAb、串聯(lián)sdAb-sdAb(三個(gè)sdAb)；·(scFv)2(也稱為串聯(lián)scFv)、scFv-dsFv、dsscFv-dsFv(dsFv)2；·雙抗體(diabody)、ds雙抗體、dids雙抗體；·sc雙抗體、dssc雙抗體、didssc雙抗體；·Dart抗體，即VL1接頭VH2接頭和VH1接頭VL2，其中VH1和VH2的C末端通過(guò)二硫鍵連接；·dsBiTE,didsBiTE；·di雙抗體(參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第25號(hào)分子)、dsdi雙抗體、didsdi雙抗體；·三抗體、ds三抗體、dids三抗體、trids三抗體；·；·四抗體、ds四抗體、dids四抗體、trids四抗體、tetrads四抗體；·tandab(參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第22號(hào)分子)、dstandab、didstandab、tridstandab、tetradstandab；·[sc(Fv)2]2(參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第22號(hào)分子)、ds[sc(Fv)2]2、dids[sc(Fv)2]2、trids[sc(Fv)2]2、tetrads[sc(Fv)2]2；·五抗體(參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第27號(hào)分子)；·Fab-scFv(也稱為雙靶向抗體(bibody))、Fab’scFv、FabdsscFv(或BYbe)、Fab’dsscFv；·三體(tribody)、ds三體、dids三體(也稱為FabdidsscFv或TrYbe或Fab-(dsscFv)2)、Fab’didsscFv；·Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv；·Fab單接頭Fv(本文中也稱為如WO2014/096390中所公開(kāi)的FabdsFv)、Fab’單接頭Fv(本文中也稱為Fab’dsFv)；·FabscFv單接頭Fv、Fab’scFv單接頭Fv；·FabdsscFv單接頭Fv、Fab’dsscFv單接頭Fv；·FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv，·FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv，·diFab、diFab’包括化學(xué)綴合的diFab’，·(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2，·(Fab’scFv)2、(Fab’)2scFvdsFv、(Fab’)2dsscFvdsFv、(Fab’dscFv)2，·VHHCK(參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第6號(hào)分子)；·微型抗體(minibody)、ds微型抗體、dids微型抗體，·微抗體(miniantibody)(ZIP)[參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第7號(hào)分子]、ds微抗體(ZIP)和dids微抗體(ZIP)；·tribi微型抗體[參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第15號(hào)分子]、dstribi微型抗體、didstribi微型抗體、tridstribi微型抗體；·雙抗體-CH3、ds雙抗體-CH3、dids雙抗體-CH3、sc雙抗體-CH3、dssc雙抗體-CH3、didssc雙抗體-CH3，·串聯(lián)scFv-CH3、串聯(lián)dsscFv-CH3、串聯(lián)didsscFv-CH3、串聯(lián)tridsscFv-CH3、串聯(lián)tetradsscFv-CH3，·scFv-Fc(本文中也稱為如WO2008/012543中所述的(scFvCH2CH3)2)及其單鏈形式、dsscFvscFv-Fc、dsscFv-Fc(本文中也稱為(dsscFvCH2CH3)2)、scFv-dsFv-Fc、dsscFv-dsFv-Fc、dsFv-Fc(本文中也稱為(dsFvCH2CH3)2)，·蝎型分子(Trubion)即結(jié)合結(jié)構(gòu)域、接頭-CH2CH3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如US8,409,577中所述；·SMIP(Trubion)即(scFv-CH2CH3)2；·(dsFvCH2CH3)2、串聯(lián)scFv-Fc、串聯(lián)dsscFvscFv-Fc、串聯(lián)dsscFv-Fc，·scFv-Fc-scFv、dsscFv-Fc-scFv、scFv-Fc-dsscFv，·雙抗體-Fc、ds雙抗體-Fc、dids雙抗體-Fc、三抗體-Fc、ds三抗體-Fc、dids三抗體-Fc、trids三抗體-Fc、四抗體-Fc、ds四抗體-Fc、dids四抗體-Fc、trids四抗體-Fc、tetrads四抗體-Fc、ds四抗體-Fc、dids四抗體-Fc、trids四抗體-Fc、tetrads四抗體-Fc、sc雙抗體-Fc、dssc雙抗體、didssc雙抗體；·雙功能或三功能抗體，例如具有不同重鏈可變區(qū)和共同的輕鏈例如Merus雙特異性抗體形式其具有固定序列的共同輕鏈和不同重鏈(包括不同CDR)和改造的CH3結(jié)構(gòu)域以驅(qū)動(dòng)不同重鏈的二聚化，·Duobody(即其中抗體中的一條全長(zhǎng)鏈相對(duì)于抗體中另一條全長(zhǎng)鏈具有不同的特異性)；·全長(zhǎng)抗體，其中已經(jīng)使用Fab臂交換來(lái)產(chǎn)生雙特異性形式；·雙功能或三功能抗體，其中全長(zhǎng)抗體具有共同的重鏈和不同的輕鏈，也稱為κ/λ體，參見(jiàn)WO2012/023053；·從重鏈或輕鏈的C末端的一、二、三或四個(gè)Ig-scFv、從重鏈或輕鏈的N末端的一、二、三或四個(gè)scFv-Ig、單接頭Ig-Fv、從重鏈或輕鏈的C末端的一、二、三或四個(gè)Ig-dsscFv(具有一、二、三或四個(gè)二硫鍵)；·從重鏈或輕鏈的N末端的一、二、三或四個(gè)Ig-dsscFv(具有一、二、三或四個(gè)二硫鍵)，·Ig單接頭Fv(參見(jiàn)PCT/EP2015/064450)，·Ig-dab、dab-Ig、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V，·scFabFvFc、scFabdsFvFc(單接頭形式的scFavFv)、(FabFvFc)2、(FabdsFvFc)2、scFab’FvFc、scFab’dsFvFc、(Fab’FvFc)2、(Fab’dsFvFc)2和·DVDIg，這些將在下面進(jìn)行更詳細(xì)地討論。在一個(gè)實(shí)施方案中，多特異性分子形式包括本領(lǐng)域已知的那些和本文所述的那些，諸如其中分子形式選自包含以下或者由以下組成的組：雙抗體、sc雙抗體、三抗體、四抗體、串聯(lián)scFv、FabFv、Fab’Fv、FabdsFv、Fab-scFv、Fab-dsscFv、Fab-(dsscFv)2、diFab、diFab’、串聯(lián)scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、sc雙抗體-Fc、sc雙抗體-CH3、Ig-scFv、scFv-Ig、V-Ig、Ig-V、Duobody和DVDIg，這些將在下面進(jìn)行更詳細(xì)地討論。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性抗體分子不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域，即不包含CH2和CH3結(jié)構(gòu)域，例如分子選自：串聯(lián)scFv、scFv-dsFv、dsscFv-dsFvdidsFv、雙抗體、ds雙抗體、dids雙抗體、sc雙抗體(也稱為(scFv)2)、dssc雙抗體、三抗體、ds三抗體、dids三抗體、trids三抗體、四抗體、ds四抗體、dids四抗體、trids四抗體、tetrads四抗體、三體、ds三體、dids三體、Fabdab、FabFv、Fab’dab、Fab’Fv、Fab單接頭Fv(如WO2014/096390中所公開(kāi)的)、Fab’單接頭Fv、FabdsFv、Fab’dsFv、Fab-scFv(也稱為雙靶向抗體)、Fab’scFv、FabdsscFv、Fab’dsscFv、FabdidsscFv、Fab’didsscFv、FabscFv單接頭Fv、Fab’scFv單接頭Fv、FabdsscFvs單接頭Fv、Fab’dsscFv單接頭Fv、FvFabFv、FvFab’Fv、dsFvFabFv、dsFvFab’Fv、FvFabdsFv、FvFab’dsFv、dsFvFabdsFv、dsFvFab’dsFv、FabFvFv、Fab’FvFv、FabdsFvFv、Fab’dsFvFv、FabFvdsFv、Fab’FvdsFv、FabdsFvdsFv、Fab’dsFvdsFv、diFab、diFab’，包括化學(xué)綴合的diFab’、(FabscFv)2、(Fab)2scFvdsFv、(Fab)2dsscFvdsFv、(FabdscFv)2、微型抗體、ds微型抗體、dids微型抗體、雙抗體-CH3、ds雙抗體-CH3、dids雙抗體-CH3、sc雙抗體-CH3、dssc雙抗體-CH3、didssc雙抗體-CH3、串聯(lián)scFv-CH3、串聯(lián)dsscFv-CH3、串聯(lián)didsscFv-CH3、串聯(lián)tridsscFv-CH3和串聯(lián)tetradsscFv-CH3。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子不包含F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子包含如下文所述的改變的Fc結(jié)構(gòu)域。除非上下文明確指明，否則本文中所使用的Fc結(jié)構(gòu)域一般是指–(CH2CH3)2。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子不包含-CH2CH3片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子不包含CH2結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子不包含CH3結(jié)構(gòu)域。如本文以生物化學(xué)意義使用的分子，是指形成有機(jī)、特別是蛋白質(zhì)物質(zhì)的一組原子，其包括適合在合適的條件下一旦形成復(fù)合物就作為單一實(shí)體處理的復(fù)合物，例如由兩條或多條多肽鏈形成的復(fù)合物。除非上下文另有說(shuō)明，否則分子和構(gòu)建體在本文中可互換使用。雖然，構(gòu)建體可以更經(jīng)常地用于指多核苷酸分子，而分子可以更經(jīng)常地用于指主要包含氨基酸序列的實(shí)體。本文使用的特異性(或特異性的)是指其中相互作用中的伴侶僅相互識(shí)別或相對(duì)于非伴侶彼此具有顯著更高的親和力，例如是例如背景結(jié)合水平或結(jié)合另一種無(wú)關(guān)蛋白的親和力的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍。本文使用的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”是指能夠結(jié)合靶抗原的結(jié)合區(qū)，通常是多肽，例如具有足夠的親和力以表征對(duì)抗原特異的結(jié)構(gòu)域。任何合適的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以用于本發(fā)明的多特異性分子中。這些可以源自任何合適的來(lái)源。在一個(gè)實(shí)施方案中，生物相容性框架結(jié)構(gòu)用于本公開(kāi)的分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域中，并且這樣的結(jié)構(gòu)基于除免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域之外的蛋白質(zhì)支架或骨架。例如，可以使用基于纖連蛋白、錨蛋白、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白、新制癌菌素(neocarzinostain)、細(xì)胞色素b、CP1鋅指、PST1、卷曲螺旋、LACI-D1、Z結(jié)構(gòu)域和tendramisat的那些(參見(jiàn)例如Nygren和Uhlen,1997,CurrentOpinioninStructuralBiology,7,463-469)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“多特異性分子”還可以包括基于生物支架的結(jié)合劑，包括Adnectins、Affibodies、Darpins、Phylomers、Avimers、適體、Anticalins、Tetranectins、微體、Affilins和Kunitz結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的多特異性分子通常是多特異性抗體分子，即所述多特異性分子的至少一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自抗體或其片段。當(dāng)結(jié)合結(jié)構(gòu)域衍生自抗體時(shí)，本文所用的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域或位點(diǎn)”是與抗原接觸的抗體部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有至少一個(gè)可變結(jié)構(gòu)域或其衍生物，例如可變結(jié)構(gòu)域?qū)蚱溲苌?，諸如可變結(jié)構(gòu)域的同源對(duì)或其衍生物。通常這是VH/VL對(duì)?？勺儏^(qū)(本文中也稱為可變結(jié)構(gòu)域)通常包含3個(gè)CDR和合適的框架。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含兩個(gè)可變區(qū)，一個(gè)輕鏈可變區(qū)和一個(gè)重鏈可變區(qū)，并且這些元件一起有助于抗體或結(jié)合片段的結(jié)合相互作用的特異性。本文使用的“同源對(duì)”是指作為預(yù)先形成的對(duì)的從宿主分離的可變結(jié)構(gòu)域的重鏈和輕鏈對(duì)(或其衍生物，諸如其人源化形式)。該定義不包括從文庫(kù)中分離的可變結(jié)構(gòu)域，其中不保留來(lái)自宿主的原始配對(duì)。同源對(duì)可能是有利的，因?yàn)樗鼈兺ǔＴ谒拗髦杏H和成熟，并且因此可以比選自文庫(kù)諸如噬菌體文庫(kù)的可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ慕M合對(duì)它們特異性針對(duì)的抗原具有更高的親和力。本文所用的“天然存在結(jié)構(gòu)域的衍生物”意指其中天然存在序列中的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸已經(jīng)被替換或缺失，例如以優(yōu)化結(jié)構(gòu)域的性質(zhì)，諸如通過(guò)消除不期望的性質(zhì)但是其中保留了結(jié)構(gòu)域的表征特征。修飾的實(shí)例是去除糖基化位點(diǎn)、GPI錨或溶劑暴露的賴氨酸的那些。這些修飾可以通過(guò)用保守氨基酸取代替換相關(guān)的氨基酸殘基來(lái)實(shí)現(xiàn)。CDR中的修飾可以例如包括用例如絲氨酸殘基取代一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸。Asn可以是用于脫氨的基質(zhì)，并且可以通過(guò)用替代氨基酸(諸如保守取代)替換Asn和/或相鄰氨基酸來(lái)降低這種傾向。CDR中的氨基酸Asp可以進(jìn)行異構(gòu)化?？梢酝ㄟ^(guò)用替代氨基酸(例如保守取代)替換Asp或相鄰氨基酸來(lái)最小化后者。在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，可變區(qū)的人源化形式也是其衍生物。人源化可包括非人構(gòu)架替換為人框架和任選地一個(gè)或多個(gè)殘基的回復(fù)突變?yōu)椤肮w殘基”。本文使用的供體殘基是指在從宿主分離的原始可變區(qū)中發(fā)現(xiàn)的殘基，特別是用供體框架中相應(yīng)位置中的氨基酸替換人框架中的給定氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域或每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是抗體或抗體片段的一部分(被包括或摻入于抗體或抗體片段中)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域在免疫球蛋白/抗體分子中。本文所用的“抗體分子”包括抗體及其結(jié)合片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所用的術(shù)語(yǔ)“抗體”是指能夠通過(guò)位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)中的至少一個(gè)抗原識(shí)別位點(diǎn)(本文中也稱為結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性結(jié)合靶抗原(諸如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽、肽等)的免疫球蛋白分子。本文使用的“抗體片段”是指抗體結(jié)合片段，包括但不限于Fab、修飾的Fab、Fab'、修飾的Fab'、F(ab')2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體、scFv、Fv、二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)抗體、Bis-scFv、雙抗體、三抗體、四抗體和上述任何的表位結(jié)合片段(參見(jiàn)例如Holliger和Hudson,2005,NatureBiotech.23(9):1126-1136；Adair和Lawson,2005,DrugDesignReviews-Online2(3),209-217)。本文所用的“結(jié)合片段”是指能夠以足夠親和力結(jié)合靶肽或抗原以表征對(duì)肽或抗原具有特異性的片段的片段。用于產(chǎn)生和制造這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)例如Verma等人,1998,JournalofImmunologicalMethods,216:165-181)。用于本公開(kāi)的其它抗體片段包括WO05/003169、WO05/003170和WO05/003171中所述的Fab和Fab’片段。多價(jià)抗體可以包含多種特異性，例如雙特異性或可以是單特異性的(參見(jiàn)例如WO92/22853、WO05/113605、WO2009/040562和WO2010/035012)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Fab片段”是指包含輕鏈的VL(輕鏈可變)結(jié)構(gòu)域和恒定結(jié)構(gòu)域(CL)的輕鏈片段和重鏈的VH(重鏈可變)結(jié)構(gòu)域和第一恒定結(jié)構(gòu)域(CH1)的抗體片段。Fv是指兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域，例如協(xié)作的可變結(jié)構(gòu)域，諸如同源對(duì)或親和成熟的可變結(jié)構(gòu)域，即VH和VL對(duì)。本文所使用的協(xié)作的可變結(jié)構(gòu)域是彼此互補(bǔ)和/或兩者有助于抗原結(jié)合以使得Fv(VH/VL對(duì))特異性針對(duì)所述抗原的可變結(jié)構(gòu)域。本文所用的“單結(jié)構(gòu)域抗體”(本文中也稱為dab和sdAb)是指由單個(gè)單體可變抗體結(jié)構(gòu)域組成的抗體片段。單結(jié)構(gòu)域抗體的實(shí)例包括VH或VL或VHH。本文所用的串聯(lián)sdAb是指通過(guò)接頭(例如肽接頭)連接的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體，特別是其中結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)不同抗原具有特異性。本文所用的串聯(lián)sdAb-sdAb是指通過(guò)兩個(gè)接頭(例如肽接頭)串聯(lián)連接的三個(gè)結(jié)構(gòu)域抗體，特別是其中結(jié)構(gòu)域抗體對(duì)不同抗原具有特異性。本文所用的dsFv是指具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的Fv。dsFv可以是較大分子的成分，例如可變結(jié)構(gòu)域之一可以例如通過(guò)氨基酸接頭連接到另一抗體片段/成分。本文所用的(dsFv)2是指具有一個(gè)結(jié)構(gòu)域的dsFv，例如通過(guò)肽接頭或二硫鍵(例如，兩個(gè)VH的C末端之間)與第二dsFv中的結(jié)構(gòu)域連接，形式類似于下述的(scFv)2，但每對(duì)可變區(qū)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的成分是指本公開(kāi)的多特異性分子的構(gòu)建單元或部分，特別是其中該成分是抗體片段，諸如scFv、Fab或其他片段，特別是如本文所述的。本文所用的單鏈Fv或縮寫(xiě)為“scFv”是指包含被連接(例如通過(guò)肽接頭)以形成單個(gè)多肽鏈的VH和VL抗體結(jié)構(gòu)域的抗體片段。在該形式中省略了重鏈和輕鏈的恒定區(qū)。本文所用的dsscFv是指具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的scFv。本文所用的串聯(lián)scFv(本文中也稱為discFv或(scFv)2)是指經(jīng)由單接頭連接的兩個(gè)scFv，使得存在單個(gè)Fv間接頭，例如圖9b所示。本文所用的串聯(lián)dsscFv(本文中也稱為scFvdsscFv或dsscFvscFv)是指經(jīng)由單接頭連接的兩個(gè)scFv，使得存在單個(gè)Fv間接頭，例如圖9b所示，并且其中scFv之一具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的串聯(lián)didsscFv(本文中也稱為didsscFv)是指通過(guò)單接頭連接的兩個(gè)scFv，使得存在單個(gè)Fv間接頭，例如圖9b所示，并且其中每個(gè)scFv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的scFv-dsFv是例如通過(guò)肽接頭連接到Fv結(jié)構(gòu)域的scFv，所述Fv結(jié)構(gòu)域由通過(guò)二硫鍵連接以形成dsFv的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域組成。在該形式中，scFv的VH或VL可以連接到dsFv的VH或VL。本文所用的dsscFv-dsFv是例如通過(guò)肽接頭連接到Fv結(jié)構(gòu)域的dsscFv，所述Fv結(jié)構(gòu)域由通過(guò)二硫鍵連接以形成dsFv的兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域組成。在該形式中，dsscFv的VH或VL可以連接到dsFv的VH或VL。本文所用的雙抗體指具有兩個(gè)Fv間接頭的兩個(gè)Fv對(duì)VH/VL，使得第一Fv的VH連接到第二Fv的VL，并且第一Fv的VL連接到第二Fv的VH。本文所用的ds雙抗體是指包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的雙抗體。本文所用的dids雙抗體是指包含兩個(gè)可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的雙抗體，即每對(duì)可變區(qū)之間的一個(gè)ds。本文所用的sc雙抗體是指包含F(xiàn)v內(nèi)接頭的雙抗體，使得所述分子包含三個(gè)接頭并形成兩個(gè)正常scFv，例如VH1接頭VL1接頭VH2接頭VL2。本文所用的dssc雙抗體是指具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的sc雙抗體。本文所用的didssc雙抗體是指在每對(duì)可變區(qū)之間具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的sc雙抗體。本文所用的Dart是指VL1接頭VH2接頭和VH1接頭VL2，其中VH1和VH2的C末端通過(guò)二硫鍵連接，PaulA.Moore等人，Blood,2011；117(17):4542-4551。本文所用的是指包含以下形式的兩對(duì)可變結(jié)構(gòu)域的分子：來(lái)自對(duì)1的結(jié)構(gòu)域(例如VH1)經(jīng)由接頭連接至來(lái)自對(duì)2的結(jié)構(gòu)域(例如VH2或VL2)，所述第二結(jié)構(gòu)域經(jīng)由接頭連接至來(lái)自對(duì)1的其它結(jié)構(gòu)域(例如VL1)進(jìn)而連接至來(lái)自對(duì)2的剩余結(jié)構(gòu)域(即VL2或VH2)。di雙抗體，參見(jiàn)Nunez-Prado等人，特別是其中的圖1里的第25號(hào)分子。本文所用的dsdi雙抗體是具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的di雙抗體。本文所用的didsdi雙抗體是在每對(duì)可變區(qū)之間具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的di雙抗體。本文所用的三抗體是指與雙抗體類似包含三個(gè)Fv和三個(gè)Fv間接頭的形式。本文所用的ds三抗體是指在可變結(jié)構(gòu)域?qū)χ兄恢g包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的三抗體。本文所用的dids三抗體是指包含兩個(gè)變區(qū)內(nèi)二硫鍵的三抗體，即在兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域?qū)χ械拿恳粋€(gè)之間一個(gè)ds。本文所用的trids三抗體是指包含三個(gè)變區(qū)內(nèi)二硫鍵的三抗體，即在每對(duì)可變區(qū)之間一個(gè)ds。本文所用的四抗體是指與雙抗體類似包含四個(gè)Fv和四個(gè)Fv間接頭的形式。本文所用的ds四抗體是指在可變結(jié)構(gòu)域?qū)χ兄恢g包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的四抗體。本文所用的dids四抗體是指包含兩個(gè)變區(qū)內(nèi)二硫鍵的四抗體，即在兩個(gè)可變結(jié)構(gòu)域?qū)Φ拿恳粋€(gè)之間一個(gè)ds。本文所用的trids四抗體是指包含三個(gè)變區(qū)內(nèi)二硫鍵的四抗體，即在三對(duì)可變區(qū)的每一對(duì)之間一個(gè)ds。本文所用的tetrads四抗體是指包含四個(gè)變區(qū)內(nèi)二硫鍵的四抗體，即在每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域之間一個(gè)ds。本文所用的三體(也稱為Fab(scFv)2)是指具有附加到輕鏈的C端的第一scFv和附加到重鏈的C端的第二scFv的Fab片段。本文所用的ds三體是指在兩個(gè)位置中之一包含dsscFv的三體。本文所用的dids三體或TrYbe是指包含兩個(gè)dsscFv的三體。本文所用的dsFab是指具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的Fab。本文所用的dsFab’是指具有可變區(qū)內(nèi)二硫鍵的Fab’。scFab是單鏈Fab片段。scFab’是單鏈Fab’片段。dsscFab是為單鏈的dsFab。dsscFab’是為單鏈的dsFab’。本文所用的Fabdab是指具有任選地經(jīng)由接頭附加至其重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab片段。本文所用的Fab’dab是指具有任選地經(jīng)由接頭附加至其重鏈或輕鏈的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab’片段。本文所用的FabFv是指具有附加至以下中每一個(gè)的C末端的另外的可變區(qū)的Fab片段：重鏈的CH1和輕鏈的CL，參見(jiàn)例如WO2009/040562。該形式可以提供為其聚乙二醇化的形式，參見(jiàn)例如WO2011/061492。本文所用的Fab’Fv與FabFv類似，其中Fab部分被Fab’替換。該形式可以提供為其聚乙二醇化的形式。本文所用的FabdsFv是指FabFv，其中Fv內(nèi)二硫鍵穩(wěn)定化所附加的C末端可變區(qū)，參見(jiàn)例如WO2010/035012。該形式可以提供為其聚乙二醇化的形式。本文所用的Fab單接頭Fv和Fab’單接頭是指連接至可變結(jié)構(gòu)域的Fab或Fab’(例如通過(guò)肽接頭)，并且所述可變結(jié)構(gòu)域經(jīng)由可變結(jié)構(gòu)域內(nèi)二硫鍵連接至第二可變區(qū)從而形成dsFv，參見(jiàn)例如WO2014/096390。本文所用的Fab-scFv(也稱為雙靶向抗體)是具有任選地經(jīng)由接頭附加至輕鏈或重鏈的C末端上的scFv的Fab分子。本文所用的Fab’-scFv是具有任選地經(jīng)由接頭附加至輕鏈或重鏈的C末端上的scFv的Fab’分子。本文所用的FabdsscFv或BYbe是在單鏈Fv的可變區(qū)之間具有二硫鍵的Fab-scFv。本文所用的Fab’dsscFv是在單鏈Fv的可變區(qū)之間具有二硫鍵的Fab’scFv。本文所用的FabscFv-dab是指具有附加至一條鏈的C末端的scFv和附加至另一條鏈的C末端的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab。本文所用的Fab’scFv-dab是指具有附加至一條鏈的C末端的scFv和附加至另一條鏈的C末端的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab’。本文所用的FabdsscFv-dab是指具有附加至一條鏈的C末端的dsscFv和附加至另一條鏈的C末端的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab。本文所用的Fab’dsscFv-dab是指具有附加至一條鏈的C末端的dsscFv和附加至另一條鏈的C末端的結(jié)構(gòu)域抗體的Fab’。本文所用的FabscFv單接頭Fv是指一種Fab單接頭Fv，其中Fv的結(jié)構(gòu)域連接至Fab的重鏈或輕鏈并且scFv連接至其它Fab鏈并且Fv的結(jié)構(gòu)域通過(guò)可變區(qū)內(nèi)二硫鍵連接。本文所用的FabdsscFv單接頭Fv是指一種FabscFv單接頭Fv，其中scFv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵連接。本文所用的Fab’scFv單接頭Fv是指一種Fab’單接頭Fv，其中Fv的結(jié)構(gòu)域連接至Fab的重鏈或輕鏈并且scFv連接至其它Fab鏈并且Fv的結(jié)構(gòu)域通過(guò)可變區(qū)內(nèi)二硫鍵連接。本文所用的Fab’dsscFv單接頭Fv是指一種Fab’scFv單接頭Fv，其中scFv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵連接。本文所用的FvFabFv是指具有附加至Fab的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab。本文所用的FvFab’Fv是指具有附加至Fab’的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab’。本文所用的dsFvFabFv是指具有附加至Fab的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab，其中第一Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的FvFabdsFv是指具有附加至Fab的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab，其中第二Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的dsFvFab’Fv是指具有附加至Fab’的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab’，其中第一Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的FvFab’dsFv是指具有附加至Fab’的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab’，其中第二Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的dsFvFabdsFv是指具有附加至Fab的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab，其中第一Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵，其中第二Fv也包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的dsFvFab’dsFv是指具有附加至Fab’的重鏈和輕鏈的N末端的第一Fv的結(jié)構(gòu)域和附加至重鏈和輕鏈的C末端的第二Fv的結(jié)構(gòu)域的Fab’，其中第一Fv包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵，其中第二Fv也包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的FabFvFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab片段，參見(jiàn)例如WO2011/086091。本文所用的Fab’FvFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab’片段，參見(jiàn)例如WO2011/086091。本文所用的FabdsFvFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab片段，參見(jiàn)例如WO2011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的Fab’dsFvFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab’片段，參見(jiàn)例如WO2011/086091，其中直接附接至C末端的第一Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的FabFvdsFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab片段，其中分子“C”末端的第二Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的Fab’FvdsFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab’片段，其中分子“C”末端的第二Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的FabdsFvdsFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab片段，其中第一和第二Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的Fab’dsFvdsFv是指具有串聯(lián)附加至重鏈和輕鏈的C末端的兩對(duì)Fv的Fab’片段，其中第一和第二Fv對(duì)包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的diFab是指經(jīng)由它們的重鏈C末端連接的兩個(gè)Fab分子。本文所用的diFab’是指經(jīng)由其鉸鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵連接的兩個(gè)Fab’分子。diFab和diFab’分子包括其化學(xué)綴合形式。本文所用的(FabscFv)2是指具有附加至其的兩個(gè)scFv的diFab分子，例如附加至重鏈或輕鏈(諸如重鏈)的C末端。本文所用的(Fab’scFv)2是指具有附加至其的兩個(gè)scFv的diFab’分子，例如附加至重鏈或輕鏈(諸如重鏈)的C末端。本文所用的(Fab)2scFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab，例如來(lái)自重鏈C末端中每一個(gè)的一個(gè)的。本文所用的(Fab’)2scFvdsFv是指具有附加的scFv和dsFv的diFab’，例如來(lái)自重鏈C末端中每一個(gè)的一個(gè)的。本文所用的(Fab)2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab，例如來(lái)自重鏈C末端的。本文所用的(Fab’)2dsscFvdsFv是指具有附加的dsscFv和dsFv的diFab’，例如來(lái)自重鏈C末端的。本文所用的微型抗體是指(VL/VH-CH3)2。本文所用的ds微型抗體是指(VL/VH-CH3)2，其中一個(gè)VL/VH包含可變區(qū)內(nèi)二硫鍵。本文所用的dids微型抗體是指(dsFv-CH3)2。κ/λ體是具有兩條重鏈和兩條輕鏈的正常IgG形式，其中兩條輕鏈彼此不同，一條是λ輕鏈(VL-CL)而另一條是κ輕鏈(VK-CK)。如WO2012/023053中所述，重鏈(即使在CDR)是相同的。本文所用的scFv-Fc是指例如經(jīng)由鉸鏈附加至恒定區(qū)片段–(CH2CH3)的CH2結(jié)構(gòu)域的N末端的scFv，使得該分子具有2個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文所用的dsscFv-Fc是指例如經(jīng)由鉸鏈附加至恒定區(qū)片段–(CH2CH3)2的CH2結(jié)構(gòu)域的N末端的dsscFv和附加至恒定區(qū)片段–(CH2CH3)2的第二CH2結(jié)構(gòu)域的N末端的scFv，使得該分子具有2個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文所用的didsscFv-Fc是指例如經(jīng)由鉸鏈附加至恒定區(qū)片段–(CH2CH3)2的CH2結(jié)構(gòu)域的N末端的scFv，使得該分子具有2個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文所用的串聯(lián)scFv-Fc是指兩個(gè)串聯(lián)的scFv，其中每一個(gè)例如經(jīng)由鉸鏈串聯(lián)附加至恒定區(qū)片段–(CH2CH3)的CH2結(jié)構(gòu)域的N末端，使得該分子具有4個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本文所用的sc雙抗體-Fc是兩個(gè)sc雙抗體，其中每一個(gè)例如經(jīng)由鉸鏈串聯(lián)附加至恒定區(qū)片段–CH2CH3的CH2結(jié)構(gòu)域的N末端。本文所用的scFv-Fc-scFv是指四個(gè)scFv，其中每個(gè)之一附加至CH2CH3片段的重鏈和輕鏈二者的N末端和C末端。本文所用的sc雙抗體-CH3是指各自例如經(jīng)由鉸鏈連接至CH3結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)sc雙抗體分子。本文所用的IgG-scFv是在重鏈中每一條或輕鏈中每一條的C末端上具有scFv的全長(zhǎng)抗體。本文所用的scFv-IgG是在重鏈中每一條或輕鏈中每一條的N末端上具有scFv的全長(zhǎng)抗體。本文所用的V-IgG是在重鏈中每一條或輕鏈中每一條的N末端上具有可變結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)抗體。本文所用的IgG-V是在重鏈中每一條或輕鏈中每一條的C末端上具有可變結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)抗體。DVD-Ig(也稱為雙V結(jié)構(gòu)域IgG)是具有4個(gè)另外的可變結(jié)構(gòu)域的全長(zhǎng)抗體，每個(gè)可變結(jié)構(gòu)域在每條重鏈和每條輕鏈的N末端上。本文所用的Duobody或‘Fab臂交換’是雙特異性IgG形式抗體，其中在混合后兩種不同單克隆抗體的恒定結(jié)構(gòu)域(通常為CH3)中的匹配的和互補(bǔ)的經(jīng)改造的氨基酸改變導(dǎo)致異二聚體的形成。作為殘基改造的結(jié)果，來(lái)自第一抗體的重鏈:輕鏈對(duì)將優(yōu)選與第二抗體的重鏈:輕鏈對(duì)締合。參見(jiàn)例如WO2008/119353、WO2011/131746和WO2013/060867。當(dāng)多特異性抗體分子中的一對(duì)或多對(duì)可變區(qū)包含VH和VL之間的二硫鍵時(shí)，其可以在任何合適的位置，諸如在下面列出的兩個(gè)殘基之間(除非上下文另有說(shuō)明，在下面列表中使用Kabat編號(hào))。無(wú)論在任何提到Kabat編號(hào)的情況下，相關(guān)參考文獻(xiàn)是Kabat等人,1987,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,USDepartmentofHealthandHumanServices,NIH,USA。在一個(gè)實(shí)施方案中，二硫鍵在選自以下的位置：·VH37+VL95C，參見(jiàn)例如ProteinScience6,781-788Zhu等人(1997)；·VH44+VL100，參見(jiàn)例如Biochemistry335451-5459Reiter等人(1994)；或者JournalofBiologicalChemistryVol.269No.28pp.18327-18331Reiter等人(1994)；或者ProteinEngineering,vol.10no.12pp.1453-1459Rajagopal等人(1997)；·VH44+VL105，參見(jiàn)例如JBiochem.118,825-831Luo等人(1995)；·VH45+VL87，參見(jiàn)例如ProteinScience6,781-788Zhu等人(1997)；·VH55+VL101，參見(jiàn)例如FEBSLetters377135-139Young等人(1995)；·VH100+VL50，參見(jiàn)例如Biochemistry291362-1367Glockshuber等人(1990)；·VH100b+VL49；·VH98+VL46，參見(jiàn)例如ProteinScience6,781-788Zhu等人(1997)；·VH101+VL46；·VH105+VL43，參見(jiàn)例如Proc.Natl.Acad.Sci.USAVol.90pp.7538-7542Brinkmann等人(1993)；或者Proteins19,35-47Jung等人(1994)，·VH106+VL57，參見(jiàn)例如FEBSLetters377135-139Young等人(1995)以及對(duì)應(yīng)于其在分子中位于可變區(qū)對(duì)中的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，二硫鍵在位置VH44和VL100之間形成。本文所用的“單特異性”是指僅結(jié)合靶抗原一次的能力。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于每種抗原是單特異性的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單特異性的。這在一些治療應(yīng)用中是有利的，因?yàn)楸竟_(kāi)的分子不能通過(guò)結(jié)合靶抗原多于一次來(lái)交聯(lián)抗原。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的雙特異性或多特異性分子不能通過(guò)在兩個(gè)不同位置、例如在相同細(xì)胞或兩個(gè)不同細(xì)胞上結(jié)合相同靶標(biāo)兩次而交聯(lián)。交聯(lián)、特別是與相同細(xì)胞或不同細(xì)胞上的CD79b相關(guān)的交聯(lián)，可以在體內(nèi)產(chǎn)生信號(hào)，例如其刺激靶抗原的活性。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子含有不超過(guò)一個(gè)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和不超過(guò)一個(gè)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。每個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單特異性的。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子對(duì)于CD22是單價(jià)的并且對(duì)于CD79是單價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子中采用的每個(gè)抗體或抗體片段是單價(jià)的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單價(jià)的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單價(jià)和單特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子由兩個(gè)或更多個(gè)單特異性單價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，諸如Fab、Fab'、scFv、VH、VL、VHH、Fv、dsFv，以任何合適的方式組合或連接以構(gòu)建多特異性分子，例如如本文上述。在另一個(gè)實(shí)施方案中，例如其中本公開(kāi)的分子包含至少三個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，則兩個(gè)或三個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體、片段或抗體和片段的組合)可以具有不同的抗原特異性，例如結(jié)合三種不同的靶抗原。恒定區(qū)如果存在本發(fā)明的多特異性分子的抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，則可考慮所提出的多特異性抗體分子的功能，并且特別是可能需要的效應(yīng)子功能來(lái)選擇本發(fā)明的多特異性分子的抗體恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域可以是人IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的結(jié)構(gòu)域。特別地，當(dāng)抗體分子意欲用于治療用途并且需要抗體效應(yīng)子功能時(shí)，可以使用人IgG恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，特別是IgG1和IgG3同種型的恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域?；蛘?，當(dāng)抗體分子意欲用于治療目的并且不需要抗體效應(yīng)子功能時(shí)，可使用IgG2和IgG4同種型。應(yīng)當(dāng)理解，也可以使用這些恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的序列變體。例如，可使用如Angal等人，1993,MolecularImmunology,1993,30:105-108中所述的其中241位的絲氨酸已經(jīng)改變?yōu)楦彼岬腎gG4分子。因此，在其中抗體是IgG4抗體的實(shí)施方案中，抗體可包括突變S241P。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體重鏈包含CH1結(jié)構(gòu)域，抗體輕鏈包含κ或λ的CL結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體重鏈包含CH1結(jié)構(gòu)域、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，并且抗體輕鏈包含κ或λ的CL結(jié)構(gòu)域。四種人IgG同種型以不同的親和力結(jié)合激活的Fcγ受體(FcγRI，F(xiàn)cγRIIa，F(xiàn)cγRIIIa)，抑制性FcγRIIb受體和補(bǔ)體的第一成分(C1q)，產(chǎn)生非常不同的效應(yīng)子功能(BruhnsP.等人,2009.SpecificityandaffinityofhumanFcgammareceptorsandtheirpolymorphicvariantsforhumanIgGsubclasses.Blood.113(16):3716-25)，還參見(jiàn)JeffreyB.Stavenhagen,等人，CancerResearch2007Sep15；67(18):8882-90。IgG與FcγR或C1q的結(jié)合取決于位于鉸鏈區(qū)和CH2結(jié)構(gòu)域中的殘基。CH2結(jié)構(gòu)域的兩個(gè)區(qū)域?qū)τ贔cγR和C1q結(jié)合是關(guān)鍵的，并且在IgG2和IgG4中具有獨(dú)特的序列。已經(jīng)顯示，在位置233-236處的IgG2殘基和在位置327、330和331處的IgG4殘基對(duì)人IgG1的取代大大降低了ADCC和CDC(ArmourKL.等人,1999.RecombinanthumanIgGmoleculeslackingFcgammareceptorIbindingandmonocytetriggeringactivities.EurJImmunol.29(8):2613-24和ShieldsRL.等人,2001.HighresolutionmappingofthebindingsiteonhumanIgG1forFcgammaRI,FcgammaRII,FcgammaRIII,andFcRnanddesignofIgG1variantswithimprovedbindingtotheFcgammaR.JBiolChem.276(9):6591-604)。此外，Idusogie等人證明在不同位置(包括K322)的丙氨酸取代顯著降低補(bǔ)體激活(IdusogieEE.等人,2000.MappingoftheC1qbindingsiteonrituxan,achimericantibodywithahumanIgG1Fc.JImmunol.164(8):4178-84)。類似地，鼠IgG2A的CH2結(jié)構(gòu)域中的突變顯示降低與FcγRI和C1q的結(jié)合(SteurerW.等人,1995.ExvivocoatingofisletcellallograftswithmurineCTLA4/Fcpromotesgrafttolerance.JImmunol.155(3):1165-74)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的Fc區(qū)是突變的，特別是本文所述的突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，突變是去除結(jié)合和/或效應(yīng)子功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c突變選自：去除Fc區(qū)結(jié)合的突變，增加或去除效應(yīng)子功能的突變，增加半衰期的突變及其組合。在pH6.0、但不是pH7.4選擇性結(jié)合FcRn的一些抗體在各種動(dòng)物模型中表現(xiàn)出較高的半衰期。位于CH2和CH3結(jié)構(gòu)域之間的界面的幾個(gè)突變，諸如T250Q/M428L(HintonPR.等人,2004.EngineeredhumanIgGantibodieswithlongerserumhalf-livesinprimates.JBiolChem.279(8):6213-6)和M252Y/S254T/T256E+H433K/N434F(VaccaroC.等人,2005.EngineeringtheFcregionofimmunoglobulinGtomodulateinvivoantibodylevels.NatBiotechnol.23(10):1283-8)，已經(jīng)顯示在體內(nèi)增加對(duì)FcRn的結(jié)合親和力和IgG1的半衰期。然而，在增加的FcRn結(jié)合和改善的半衰期之間并不總是有直接的關(guān)系(Datta-MannanA.等人,2007.HumanizedIgG1VariantswithDifferentialBindingPropertiestotheNeonatalFcReceptor:RelationshiptoPharmacokineticsinMiceandPrimates.DrugMetab.Dispos.35:86–94)。IgG4亞類顯示降低的Fc受體(FcγRIIIa)結(jié)合，其他IgG亞類的抗體通常顯示強(qiáng)結(jié)合。這些其它IgG亞型中降低的受體結(jié)合可以通過(guò)改變而實(shí)現(xiàn)，例如替換選自Pro238、Asp265、Asp270、Asn270(Fc碳水化合物缺失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434和His435的一個(gè)或多個(gè)氨基酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的分子具有IgG亞類(例如IgG1、IgG2或IgG3)的Fc，其中Fc在一個(gè)、兩個(gè)或所有以下位置S228、L234和/或D265中突變。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)c區(qū)中的突變獨(dú)立選自S228P、L234A、L235A、L235A、L235E及其組合?？赡苄枰獪p少或增加Fc區(qū)的效應(yīng)子功能。需要靶向細(xì)胞表面分子、特別是免疫細(xì)胞上的那些并消除效應(yīng)子功能的抗體。在一些實(shí)施方案中，例如為了治療自身免疫，通過(guò)增加陰性Fc受體(FcgRIIb或CD32b)結(jié)合增強(qiáng)免疫細(xì)胞上的Fc結(jié)合可能是需要的，參見(jiàn)StavenhagenJB,等人，AdvancesinEnzymeRegulation2007December3和VeriMC等人，ArthritisRheum,2010Mar30；62(7):1933-43。相反，對(duì)于預(yù)期用于腫瘤學(xué)使用的抗體，增加效應(yīng)子功能可以改善治療活性。已經(jīng)在人IgG1的CH2結(jié)構(gòu)域中產(chǎn)生了許多突變，并且在體外測(cè)試了它們對(duì)ADCC和CDC的影響(IdusogieEE.等人,2001.Engineeredantibodieswithincreasedactivitytorecruitcomplement.JImmunol.166(4):2571-5)。值得注意的是，據(jù)報(bào)道在位置333處的丙氨酸取代增加ADCC和CDC二者。Lazar等人描述了對(duì)FcγRIIIa具有更高親和力和對(duì)FcγRIIb具有更低親和力從而導(dǎo)致增強(qiáng)的ADCC的三重突變體(S239D/I332E/A330L)(LazarGA.等人,2006.EngineeredantibodyFcvariantswithenhancedeffectorfunction.PNAS103(11):4005–4010)。使用相同的突變產(chǎn)生具有增加的ADCC的抗體(RyanMC.等人,2007.AntibodytargetingofB-cellmaturationantigenonmalignantplasmacells.Mol.CancerTher.,6:3009–3018)。Richards等人研究了具有改善的FcγRIIIa親和力和介導(dǎo)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)的靶細(xì)胞吞噬作用的FcγRIIa/FcγRIIb比率的略微不同的三重突變體(S239D/I332E/G236A)(RichardsJO等人，2008.OptimizationofantibodybindingtoFcgammaRIIaenhancesmacrophagephagocytosisoftumorcells.MolCancerTher.7(8):2517-27)。由于缺乏效應(yīng)子功能，IgG4抗體代表合適的用于受體阻斷而沒(méi)有細(xì)胞耗盡的IgG亞類。IgG4分子可在稱為Fab臂交換的動(dòng)態(tài)過(guò)程中交換半分子。這種現(xiàn)象可以在治療性抗體和內(nèi)源性IgG4之間發(fā)生。已經(jīng)顯示S228P突變防止這種重組過(guò)程，允許設(shè)計(jì)不太不可預(yù)測(cè)的治療性IgG4抗體(LabrijnAF等人，2009.TherapeuticIgG4antibodiesengageinFab-armexchangewithendogenoushumanIgG4invivo.NatBiotechnol.27(8):767-71)。該技術(shù)可用于產(chǎn)生雙特異性抗體分子。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，抗體可經(jīng)歷各種翻譯后修飾。這些修飾的類型和程度常常取決于用于表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞系以及培養(yǎng)條件。此類修飾可以包括糖基化、甲硫氨酸氧化、二酮哌嗪形成、天冬氨酸異構(gòu)化和天冬酰胺脫酰胺中的變化。頻繁的修飾是由于羧肽酶的作用(如Harris,RJ.JournalofChromatography705:129-134,1995中所述的)而導(dǎo)致的羧基末端堿性殘基(諸如賴氨酸或精氨酸)的丟失。因此，抗體重鏈的C末端賴氨酸可以不存在。親和力本發(fā)明的多特異性分子包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD79a和/或CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)CD79a。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中使用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域特異性針對(duì)CD79復(fù)合物，即其識(shí)別存在于復(fù)合物中且對(duì)其具有特異性的表位，例如包含CD79a和CD79b之間相互作用的表位。CD22(也稱為分化群-22)是已知的蛋白質(zhì)。CD22是B細(xì)胞受體(BCR)的抑制性共受體，并且在建立B細(xì)胞激活的信號(hào)傳導(dǎo)閾值中起關(guān)鍵作用。人序列可在UniProt條目號(hào)P20273(SEQIDNO：161和沒(méi)有信號(hào)肽的SEQIDNO：161的氨基酸20-847)中獲得。鼠形式可在UniProt條目號(hào)P35329中獲得。本公開(kāi)涉及來(lái)自任何物種、特別是人和其天然變體的所有形式的CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD22指該蛋白質(zhì)的人形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D22的親和力為約100nM或更強(qiáng)，諸如約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更強(qiáng)、特別是50pM或更強(qiáng)的結(jié)合親和力。CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合CD79a和/或CD79b。CD79a(也稱為免疫球蛋白α和B細(xì)胞抗原受體復(fù)合物相關(guān)蛋白α鏈)是已知的蛋白質(zhì)。CD79a的表達(dá)限于B淋巴細(xì)胞。人序列在UniProt條目號(hào)P11912(SEQIDNO：162和沒(méi)有信號(hào)序列的SEQIDNO：162的氨基酸33-226)下可獲得。鼠形式在UniProt條目號(hào)11911下可獲得。本公開(kāi)涉及來(lái)自任何物種、特別是人和其任何天然變體的所有形式的CD79a。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD79a指該蛋白質(zhì)的人形式。CD79b(也稱為免疫球蛋白相關(guān)β和分化群79B)是已知的蛋白質(zhì)。CD79b的表達(dá)限于B淋巴細(xì)胞。人序列在UniProt條目號(hào)P40259(SEQIDNO：163和沒(méi)有信號(hào)序列的SEQIDNO：163的氨基酸29-229)下可獲得。鼠形式在UniProt條目號(hào)P15530下可獲得。本公開(kāi)涉及來(lái)自任何物種、特別是人和其任何天然變體的所有形式的CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，CD79b指該蛋白質(zhì)的人形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性針對(duì)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合CD79a。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性針對(duì)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，特異性針對(duì)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合CD79a和CD79b的復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D79的親和力為約100nM或更強(qiáng)，諸如約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更強(qiáng)、特別是50pM或更強(qiáng)的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D79a的親和力為約100nM或更強(qiáng)，諸如約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更強(qiáng)、特別是50pM或更強(qiáng)的結(jié)合親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D79b的親和力為約100nM或更強(qiáng)，諸如約50nM、20nM、10nM、1nM、500pM、250pM、200pM、100pM或更強(qiáng)、特別是50pM或更強(qiáng)的結(jié)合親和力。應(yīng)當(dāng)理解，結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D22的親和力可以與結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)D79的親和力相同或不同。在一個(gè)實(shí)施方案中，加工本公開(kāi)的多特異性抗體分子或其抗體/片段成分以提供改善的對(duì)靶抗原的親和力。這樣的變體可以通過(guò)許多親和力成熟操作方案獲得，包括突變CDR(Yang等人,J.Mol.Biol.,254,392-403,1995)，鏈混編(Marks等人,Bio/Technology,10,779-783,1992)，使用大腸桿菌的突變菌株(Low等人，J.Mol.Biol.,250,359-368,1996)，DNA混編(Patten等人，Curr.Opin.Biotechnol.,8,724-733,1997)，噬菌體展示(Thompson等人，J.Mol.Biol.,256,77-88,1996)和有性PCR(Crameri等人，Nature,391,288-291,1998)。Vaughan等人(同上)討論了這些親和成熟方法?？贵w及其產(chǎn)生用于本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何合適的方法產(chǎn)生，例如CDR可以取自非人抗體(包括市售的抗體)并且移植到人框架中，或者可以用非人可變區(qū)和人恒定區(qū)制備嵌合抗體等。通常，用于本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是來(lái)源于結(jié)合所選抗原的抗體的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，諸如結(jié)合CD22、CD79a和/或CD79b的抗體。CD22和CD79抗體的實(shí)例是本領(lǐng)域已知的，并且這些可以直接用于本發(fā)明的分子中，或者使用本文所述的方法篩選適合性，并且隨后如果需要?jiǎng)t使用本文所述的方法進(jìn)行修飾，例如進(jìn)行人源化。臨床中CD22抗體的實(shí)例包括依帕珠單抗和奧英妥珠單抗。本領(lǐng)域已經(jīng)描述了其他治療性抗體，例如US2003202975和WO14011520中公開(kāi)的抗CD22抗體，WO14011521和WO15021089中公開(kāi)的抗CD79b抗體。非人抗CD22抗體包括來(lái)自克隆SP104的兔單克隆抗體LS-C2210357(LSBio)，來(lái)自克隆4C3的小鼠單克隆LS-C174778，小鼠單克隆LS-C4802，來(lái)自克隆1B1的小鼠單克隆LS-B9996，來(lái)自克隆2E6的小鼠單克隆LS-C340404，小鼠單克隆LS-C312263，小鼠單克隆LS-C152867，小鼠單克隆LS-C87523，來(lái)自克隆FRB4的小鼠單克隆LS-C134333，小鼠單克隆LS-C134336，來(lái)自克隆HIB22的小鼠單克隆LS-C40961，小鼠單克隆LS-C134332，來(lái)自SantaCruzBiotechnology的以下抗體：sc-271579，sc-377304，sc-7032，sc-18909，sc-7932，sc-7323，sc-7307，sc-7031，sc-20053，sc-189000，sc-136440，sc-136507，sc-53031，sc-73363，sc-53032，Abcam兔單克隆Ab33859(EP498Y)，小鼠單克隆抗體AA1-687目錄號(hào)ABIN1999423，來(lái)自克隆HIB22的來(lái)自Biolegend車(chē)間號(hào)VCD22.14的小鼠單克隆。市售的抗CD79a抗體包括來(lái)自克隆HM57的小鼠單克隆抗體LS-B4504(LSBio)，小鼠單克隆抗體LS-B8330，小鼠單克隆抗體LS-C44954，兔單克隆抗體LS-B9093，來(lái)自克隆JCB117的小鼠單克隆抗體LS-B8513，來(lái)自克隆SP18的兔單克隆抗體LS-C210607，來(lái)自克隆5E2的小鼠單克隆抗體LS-C175441，來(lái)自克隆3D3的小鼠單克隆抗體LS-C338670，來(lái)自克隆HM47/A9的小鼠單克隆抗體LS-C88120，小鼠單克隆抗體LS-C191714，小鼠單克隆抗體LS-C87592，小鼠單克隆抗體LS-C44955，小鼠單克隆抗體LS-C95934，小鼠單克隆抗體LS-C121584，小鼠單克隆抗體LS-C121585，小鼠單克隆抗體LS-C204347，小鼠單克隆抗體LS-C88122，Abcam小鼠單克隆抗體ab3121[HM47/A9]，兔單克隆抗體ab79414和兔單克隆抗體ab133483。市售的CD79b抗體包括小鼠單克隆Abcam抗體ab33295，大鼠單克隆抗體ab23826，小鼠單克隆抗體ab103422，兔單克隆抗體ab134103，兔單克隆抗體ab134147和兔單克隆抗體ab183343。此類市售的抗體可能是發(fā)現(xiàn)其他治療性抗體的有用工具。技術(shù)人員可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適的方法產(chǎn)生用于本發(fā)明的多特異性分子的抗體。用于產(chǎn)生例如用于免疫宿主或用于淘選諸如用于噬菌體展示的抗體的抗原多肽可以通過(guò)本領(lǐng)域熟知的方法從包含表達(dá)系統(tǒng)的遺傳工程改造的宿主細(xì)胞制備，或者它們可以是從天然生物來(lái)源回收。在本申請(qǐng)中，術(shù)語(yǔ)“多肽”包括肽、多肽和蛋白質(zhì)。除非另有說(shuō)明，否則這些可互換使用。在一些情況下，抗原多肽可以是較大蛋白質(zhì)的一部分，諸如融合蛋白，例如與親和標(biāo)簽或類似物融合。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用轉(zhuǎn)染了相關(guān)蛋白或多肽(例如用CD79a和CD79b共轉(zhuǎn)染)的細(xì)胞(諸如成纖維細(xì)胞)免疫宿主。可以獲得針對(duì)抗原多肽產(chǎn)生的抗體，其中動(dòng)物的免疫是必需的，通過(guò)使用眾所周知的常規(guī)操作方案將多肽施用于動(dòng)物，優(yōu)選非人動(dòng)物，參見(jiàn)例如HandbookofExperimentalImmunology,D.M.Weir(編輯)，Vol4,BlackwellScientificPublishers,Oxford,England,1986)?？梢悦庖咴S多溫血?jiǎng)游?，諸如兔、小鼠、大鼠、羊、牛、駱駝或豬。然而，小鼠、兔、豬和大鼠通常是最合適的。單克隆抗體可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何方法制備，諸如雜交瘤技術(shù)(Kohler&Milstein,1975,Nature,256:495-497)，三源雜交瘤技術(shù)，人B細(xì)胞雜交瘤技術(shù)(Kozbor等人，1983,ImmunologyToday,4:72)和EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等人，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,pp77-96,AlanRLiss,Inc.,1985)。還可以使用單淋巴細(xì)胞抗體方法通過(guò)克隆和表達(dá)由選擇用于產(chǎn)生特異性抗體的單個(gè)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的免疫球蛋白可變區(qū)cDNA來(lái)產(chǎn)生抗體，例如由Babcook,J.等人，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(15):7843-7848l；WO92/02551；WO2004/051268和WO2004/106377所述的方法。還可以使用本領(lǐng)域已知的各種噬菌體展示方法產(chǎn)生用于本公開(kāi)內(nèi)容的抗體，包括以下公開(kāi)的那些：Brinkman等人(于J.Immunol.Methods,1995,182:41-50),Ames等人(J.Immunol.Methods,1995,184:177-186),Kettleborough等人(Eur.J.Immunol.1994,24:952-958),Persic等人(Gene,19971879-18),Burton等人(AdvancesinImmunology,1994,57:191-280)和WO90/02809；WO91/10737；WO92/01047；WO92/18619；WO93/11236；WO95/15982；WO95/20401；和US5,698,426；5,223,409；5,403,484；5,580,717；5,427,908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5,733,743；5,969,108,和WO20011/30305。在一個(gè)實(shí)例中，本公開(kāi)的多特異性分子是完全人的，特別是一個(gè)或多個(gè)可變結(jié)構(gòu)域是完全人的。完全人分子是其中重鏈和輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)(如果存在)都是人源的，或基本上與人源的序列相同，而不必來(lái)自相同抗體的那些。完全人抗體的實(shí)例可以包括例如通過(guò)上述噬菌體展示方法產(chǎn)生的抗體和由小鼠產(chǎn)生的抗體，其中鼠免疫球蛋白可變區(qū)和任選地恒定區(qū)基因已被其對(duì)應(yīng)物例如如EP0546073、US5,545,806、US5,569,825、US5,625,126、US5,633,425、US5,661,016、US5,770,429、EP0438474和EP0463151中一般術(shù)語(yǔ)中所述。在一個(gè)實(shí)例中，根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人源化的。本文使用的人源化(其包括CDR移植抗體)是指具有來(lái)自非人物種的一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和來(lái)自人免疫球蛋白分子的框架區(qū)的分子(參見(jiàn)例如US5,585,089；WO91/09967)。應(yīng)當(dāng)理解，可能僅需要轉(zhuǎn)移CDR的特異性決定殘基而不是整個(gè)CDR(參見(jiàn)例如，Kashmiri等人,2005,Methods,36,25-34)。人源化抗體可任選地進(jìn)一步包含一個(gè)或多個(gè)來(lái)源于CDR所來(lái)源的非人物種的構(gòu)架殘基。本文所用的術(shù)語(yǔ)“人源化抗體分子”是指其中重鏈和/或輕鏈含有來(lái)自供體抗體(例如鼠單克隆抗體抗體)移植到受體抗體(例如人抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)框架中的一個(gè)或多個(gè)CDR(包括，如果需要的話，一個(gè)或多個(gè)修飾的CDR)的抗體分子。有關(guān)綜述，請(qǐng)參閱Vaughan等人,NatureBiotechnology,16,535-539,1998。在一個(gè)實(shí)施方案中，不是轉(zhuǎn)移整個(gè)CDR，而是只有一個(gè)或多個(gè)來(lái)自本文上述任何一個(gè)CDR的特異性決定殘基被轉(zhuǎn)移到人抗體框架(參見(jiàn)例如，Kashmiri等人，2005，Methods，36，25-34)。在一個(gè)實(shí)施方案中，僅將來(lái)自一個(gè)或多個(gè)本文上述CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移到人抗體框架。在另一個(gè)實(shí)施方案中，僅將來(lái)自上文描述的每個(gè)CDR的特異性決定殘基轉(zhuǎn)移至人抗體框架。當(dāng)CDR或特異性決定殘基被移植時(shí)，考慮到CDR來(lái)源的供體抗體的類型/類型，包括小鼠、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人框架區(qū)，可以使用任何合適的受體可變區(qū)框架序列。合適地，根據(jù)本發(fā)明的人源化抗體具有包含人受體構(gòu)架區(qū)以及本文提供的一個(gè)或多個(gè)CDR的可變結(jié)構(gòu)域?？捎糜诒竟_(kāi)的人類框架的實(shí)例是KOL、NEWM、REI、EU、TUR、TEI、LAY和POM(Kabat等人，同上)。例如，KOL和NEWM可以用于重鏈，REI可以用于輕鏈和EU、LAY和POM可以用于重鏈和輕鏈二者?；蛘撸梢允褂萌朔N系序列；這些可在以下網(wǎng)址獲得：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/vbase/list2.php。在本公開(kāi)的人源化抗體分子中，受體重鏈和輕鏈不一定需要衍生自相同的抗體，并且如果需要，可以包含具有衍生自不同鏈的框架區(qū)的復(fù)合鏈?？蚣軈^(qū)不需要具有與受體抗體完全相同的序列。例如，稀有殘基可以改變?yōu)樵撌荏w鏈類或類型的更頻繁存在的殘基。或者，可以改變受體構(gòu)架區(qū)中的選定殘基，使得它們對(duì)應(yīng)于在供體抗體中相同位置處發(fā)現(xiàn)的殘基(參見(jiàn)Reichmann等人，1998,Nature,332,323-324)。這樣的變化應(yīng)保持在恢復(fù)供體抗體親和力所需的最小值。用于在受體構(gòu)架區(qū)中選擇可能需要改變的殘基的操作方案在WO91/09967中闡述?？蚣艿难苌锟删哂杏锰娲被崽鎿Q的1、2、3或4個(gè)氨基酸，例如用供體殘基替換。供體殘基是來(lái)自供體抗體的殘基，即，從其最初衍生CDR的抗體，特別是來(lái)自供體序列所采用的相應(yīng)位置的殘基。供體殘基可以被衍生自人受體框架的合適殘基(受體殘基)替換?？贵w可變結(jié)構(gòu)域中的殘基通常根據(jù)Kabat等人設(shè)計(jì)的系統(tǒng)進(jìn)行編號(hào)。該系統(tǒng)在Kabat等人，1987，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，USDepartmentofHealthandHumanServices，NIH，USA(下文稱為“Kabat等人(同上)”)中闡述。該編號(hào)系統(tǒng)用于本說(shuō)明書(shū)中，除非另有說(shuō)明。Kabat殘基命名并不總是直接對(duì)應(yīng)于氨基酸殘基的線性編號(hào)。實(shí)際的線性氨基酸序列可以含有比嚴(yán)格Kabat編號(hào)更少或額外的氨基酸，其對(duì)應(yīng)于基本可變結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的構(gòu)架或互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)的結(jié)構(gòu)成分的縮短或插入?？梢酝ㄟ^(guò)抗體序列與“標(biāo)準(zhǔn)”Kabat編號(hào)序列中同源性殘基的比對(duì)來(lái)確定給定抗體的正確Kabat編號(hào)殘基。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，重鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR位于殘基31-35(CDR-H1)，殘基50-65(CDR-H2)和殘基95-102(CDR-H3)。然而，根據(jù)Chothia(Chothia,C.和Lesk,A.M.J.Mol.Biol.,196,901-917(1987))，等同于CDR-H1的環(huán)擴(kuò)展為從殘基26至殘基32。因此，除非另有說(shuō)明，本文所用的‘CDR-H1’旨在指殘基26至35，如Kabat編號(hào)系統(tǒng)和Chothia的拓?fù)洵h(huán)定義的組合所述。根據(jù)Kabat編號(hào)系統(tǒng)，輕鏈可變結(jié)構(gòu)域的CDR位于殘基24-34(CDR-L1)，殘基50-56(CDR-L2)和殘基89-97(CDR-L3)。在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含三個(gè)CDR的重鏈可變區(qū)(例如VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中CDRH1具有SEQIDNO：78中給出的序列，CDRH2具有給定的序列在SEQIDNO：79中給出，CDRH3具有在SEQIDNO：80中給出的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(例如VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：88，CDRH2為SEQIDNO：89，CDRH3為SEQIDNO：90。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)(例如VL)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：75，CDRL2為SEQIDNO：76，CDRL3為SEQIDNO：77。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)(例如VL)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：85，CDRL2為SEQIDNO：86，CDRL3為SEQIDNO：87。在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含三個(gè)CDR的重鏈可變區(qū)(VH)和包含三個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)(VL)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中CDRH1具有SEQIDNO：78中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：79中給出的序列，CDRH3具有SEQIDNO：80中給出的序列，其中CDRL1具有SEQIDNO：75中給出的序列，CDRL2具有SEQIDNO：76中給出的序列，并且CDRL3具有SEQIDNO：77中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了包含特異性針對(duì)CD79的包含三個(gè)CDR的重鏈可變區(qū)(VH)和包含三個(gè)CDR的輕鏈可變區(qū)(VL)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中CDRH1具有SEQIDNO：88中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：89中給出的序列，CDRH3具有SEQIDNO：90中給出的序列，其中CDRL1具有SEQIDNO：85中給出的序列，CDRL2具有SEQIDNO：86中給出的序列，并且CDRL3具有SEQIDNO：87中給出的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子包含特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含3個(gè)選自SEQIDNO：98、99、100、108、109、110、118、119、120、128、129、130、138、139、140、148、149和150的重鏈CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子包含特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含3個(gè)選自SEQIDNO：95、96、97、105、106、107、115、116、117、125、126、127、136、137、138、145、146和147的輕鏈CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子包含特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含3個(gè)選自SEQIDNO：98、99、100、108、109、110、118、119、120、128、129、130、138、139、140、148、149和150的重鏈CDR和選自SEQIDNO：95、96、97、105、106、107、115、116、117、125、126、127、136、137、138、145、146和147的3個(gè)輕鏈CDR。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：98，CDRH2為SEQIDNO：99和CDRH3為SEQIDNO：100。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：108，CDRH2為SEQIDNO：109和CDRH3為SEQIDNO：110。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：118，CDRH2為SEQIDNO：119和CDRH3為SEQIDNO：120。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：128，CDRH2為SEQIDNO：129和CDRH3為SEQIDNO：130。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：138，CDRH2為SEQIDNO：139和CDRH3為SEQIDNO：140。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)重鏈CDR的重鏈可變區(qū)(VH)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRH1為SEQIDNO：148，CDRH2為SEQIDNO：149和CDRH3為SEQIDNO：150。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：95，CDRL2為SEQIDNO：96和CDRL3的SEQIDNO：97。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：105，CDRL2為SEQIDNO：106和CDRL3的SEQIDNO：107。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：115，CDRL2為SEQIDNO：116和CDRL3的SEQIDNO：117。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：125，CDRL2為SEQIDNO：126和CDRL3的SEQIDNO：127。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：135，CDRL2為SEQIDNO：136和CDRL3的SEQIDNO：137。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了包含特異性針對(duì)CD22的包含3個(gè)輕鏈CDR的輕鏈可變區(qū)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，CDRL1為SEQIDNO：145，CDRL2為SEQIDNO：146和CDRL3的SEQIDNO：147。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：98中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：99中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：100中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：95中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：96中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：97中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：108中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：109中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：110中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：105中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：106中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：107中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：118中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：119中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：120中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：115中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：116中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：117中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：128中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：129中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：130中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：125中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：126中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：127中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：138中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：139中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：140中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：135中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：136中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：137中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：148中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：149中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：150中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：145中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：146中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：147中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明提供了包含特異性針對(duì)抗原CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性分子，其中這對(duì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含來(lái)自CD79和CD22抗體對(duì)的6個(gè)CDR，所述抗體對(duì)選自以下CD79和CD22抗體對(duì)的列表：4447和4120、4447和4126、4447和4127、4447和4128、4447和4130、4447和4132、4450和4120、4450和4126、4450和4127、4450和4128、4450和4130以及4450和4132。下文提供了這些CD79抗體(抗體4447和抗體4450)的序列，包括VH、VL和CDR序列。下文提供了這些CD22抗體(抗體4120、4126、4127、4128、4130、4132)的序列，包括VH、VL和CDR序列，并且可以組合作為本發(fā)明分子中的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)擴(kuò)展至本文公開(kāi)的抗體序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)白蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)，所述重鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRH1具有SEQIDNO：151中給出的序列，CDRH2具有SEQIDNO：152中給出的序列，并且CDRH3具有SEQIDNO：153中給出的序列，所述輕鏈可變區(qū)包含三個(gè)CDR，其中CDRL1具有SEQIDNO：154中給出的序列，CDRL2具有序列SEQIDNO：155中給出的序列并且CDRL3具有SEQIDNO：156中給出的序列。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)白蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含具有SEQIDNO：157中給出的序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQIDNO：159中給出的序列的輕鏈可變區(qū)(VL)。在一個(gè)實(shí)例中，提供了特異性針對(duì)白蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含具有SEQIDNO：158中給出的序列的重鏈可變區(qū)(VH)和具有SEQIDNO：160中給出的序列的輕鏈可變區(qū)(VL)。在一個(gè)實(shí)例中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域是人源化的。在一個(gè)實(shí)例中，本文提供的一個(gè)或多個(gè)CDR可以被修飾以去除不需要的殘基或位點(diǎn)，諸如半胱氨酸殘基或天冬氨酸(D)異構(gòu)化位點(diǎn)或天冬酰胺(N)脫酰胺位點(diǎn)。例如，任何一個(gè)CDR中的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基可以被另一個(gè)氨基酸取代，諸如絲氨酸。在一個(gè)實(shí)例中，可通過(guò)將天冬酰胺殘基(N)和/或相鄰殘基突變?yōu)槿魏纹渌线m的氨基酸，從一個(gè)或多個(gè)CDR中除去天冬酰胺脫酰胺位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，天冬酰胺脫酰胺位點(diǎn)諸如NG或NS可以突變?yōu)槔鏝A或NT。在一個(gè)實(shí)例中，可通過(guò)將天冬氨酸殘基(D)和/或相鄰殘基突變?yōu)槿魏纹渌线m的氨基酸，從一個(gè)或多個(gè)CDR中除去天冬氨酸異構(gòu)化位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)例中，天冬氨酸異構(gòu)化位點(diǎn)諸如DG或DS可以被突變?yōu)槔鏓G、DA或DT。在一個(gè)實(shí)例中，可以通過(guò)將天冬酰胺殘基(N)突變?yōu)槿魏纹渌线m的氨基酸，例如SLS或QLS，來(lái)除去N-糖基化位點(diǎn)諸如NLS。在一個(gè)實(shí)例中，可以通過(guò)將絲氨酸殘基(S)突變?yōu)槌K氨酸(T)以外的任何其它殘基來(lái)除去N-糖基化位點(diǎn)諸如NLS。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在任何合適的測(cè)定(諸如本文所述的那些)中測(cè)試CDR的變體或人源化序列以確認(rèn)活性得到維持?？梢允褂萌魏魏线m的測(cè)定來(lái)測(cè)試與抗原的特異性結(jié)合，所述測(cè)定包括例如ELISA或表面等離子體共振方法，諸如BIAcore，其中可以測(cè)量與抗原(CD22或CD79)的結(jié)合。這樣的測(cè)定可以使用分離的天然或重組CD22或CD79(a和/或b)或合適的融合蛋白/多肽。在一個(gè)實(shí)例中，使用重組CD22(諸如SEQIDNO：161中提供的序列或SEQIDNO：161的氨基酸20-847)或CD79(諸如SEQIDNO：162和SEQIDNO：163中提供的序列和SEQIDNO：162的氨基酸33-226和SEQIDNO：163的氨基酸29-229)通過(guò)例如表面等離子體共振(諸如BIAcore)測(cè)量結(jié)合?；蛘?，蛋白質(zhì)可以在細(xì)胞上表達(dá)，諸如HEK細(xì)胞，并且使用基于流式細(xì)胞術(shù)的親和力測(cè)定來(lái)測(cè)量親和力。本發(fā)明提供的抗體序列可用于鑒定適合用于本發(fā)明的多特異性分子中的其它抗體和因此的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。交叉阻斷根據(jù)本發(fā)明的抗體分子與CD79特異性結(jié)合的抗體，特別是包含SEQIDNO：73中給出的重鏈序列和SEQIDNO：71中給出的輕鏈序列的抗體分子或包含SEQIDNO：83中給出的重鏈序列和SEQIDNO：81中給出的輕鏈序列的抗體分子可以類似地用于結(jié)合CD79，因此類似地可用于本發(fā)明的多特異性分子。因此，本發(fā)明還提供了包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和對(duì)抗原CD79b特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性分子，其中CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域交叉阻斷本文上述CD79的任何一種抗體分子的結(jié)合和/或通過(guò)這些抗體中的任一種而被交叉阻斷與CD79結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的抗體與本文上述的抗體結(jié)合相同的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交叉阻斷抗體結(jié)合與由本文上述的抗體結(jié)合的表位相鄰和/或重疊的表位。類似地，交叉阻斷根據(jù)本發(fā)明的抗體分子與CD22的結(jié)合的抗體，特別是包含SEQIDNO：93中給出的重鏈序列和SEQIDNO：91中給出的輕鏈序列的抗體分子或包含SEQIDNO：103中給出的重鏈序列和SEQIDNO：101中給出的輕鏈序列的抗體分子或包含SEQIDNO：113中給出的重鏈序列和SEQIDNO：111中給出的輕鏈序列的抗體分子，或包含SEQIDNO：123中給出的重鏈序列和SEQIDNO：121中給出的輕鏈序列的抗體分子，或包含SEQIDNO：133中給出的重鏈序列和SEQIDNO：131中給出的輕鏈序列的抗體分子或包含SEQIDNO：143中給出的重鏈序列和SEQIDNO：141中給出的輕鏈序列的抗體分子可以類似地用于結(jié)合CD22并且因此類似地可用于本發(fā)明的多特異性分子。因此，本發(fā)明還提供了包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性分子，其中CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域交叉阻斷本文上述的任何一種抗體分子與CD22的結(jié)合并且/或者通過(guò)這些抗體中的任一種而被交叉阻斷與CD22結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣的抗體與本文上述的抗體結(jié)合相同的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，交叉阻斷抗體結(jié)合與由本文上述的抗體結(jié)合的表位相鄰和/或重疊的表位。交叉阻斷抗體可以使用本領(lǐng)域任何合適的方法鑒定，例如通過(guò)使用競(jìng)爭(zhēng)ELISA或BIAcore測(cè)定，其中交叉阻斷抗體與抗原(CD22和/或CD79)的結(jié)合阻止本發(fā)明的抗體的結(jié)合或反之亦然。這樣的交叉阻斷測(cè)定可以使用細(xì)胞表達(dá)的、分離的天然或重組CD22或CD79(a和/或b)或合適的融合蛋白/多肽。在一個(gè)實(shí)例中，使用重組CD22或其合適的片段或其天然變體(諸如SEQIDNO：161中提供的序列或SEQIDNO：161的氨基酸20-847中提供的序列)測(cè)量結(jié)合和交叉阻斷，或CD79，諸如SEQIDNO：162中提供的序列或SEQIDNO：162的氨基酸33-226中提供的序列(CD79a)和/或SEQIDNO：163中提供的序列或氨基SEQIDNO：163的氨基酸29-229中提供的序列。或者或另外，根據(jù)本發(fā)明這一方面的抗體可以通過(guò)本文公開(kāi)的以下結(jié)合結(jié)構(gòu)域而被交叉阻斷與抗原(CD22或CD79)的結(jié)合，例如包含衍生自以下中給出的重鏈可變序列和輕鏈序列的CDR：SEQIDNO：71和73、81和83、91和93、101和103、111和113、121和123、131和133以及141和143。因此還提供了多特異性分子，其包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域交叉阻斷本文上述的任一抗體分子與CD79b的結(jié)合和/或通過(guò)這些抗體中的任一種而被交叉阻斷了例如大于80％，例如大于85％，例如大于90％，特別是大于95％的與CD79b結(jié)合，并且任選地其中CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域交叉阻斷本文上述的任何一種抗體分子與CD22的結(jié)合和/或通過(guò)這些抗體中的任一種而被交叉阻斷了大于80％，例如大于85％，例如大于90％，特別是大于95％的與CD22結(jié)合。在一個(gè)方面，提供了多特異性抗體分子，其包含或由以下組成：a)式(I)的多肽鏈：VH-CH1-X-(V1)p；b)式(II)的多肽鏈：VL-CL-Y-(V2)q；其中VH表示重鏈可變結(jié)構(gòu)域；CH1表示重鏈恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，例如其結(jié)構(gòu)域1；X表示鍵或接頭，例如氨基酸接頭；Y表示鍵或接頭，例如氨基酸接頭；V1表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；VL表示可變結(jié)構(gòu)域，例如輕鏈可變結(jié)構(gòu)域；CL表示來(lái)自恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)域，例如輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域，諸如Cκ；V2表示dab、scFv、dsscFv或dsFv；p是0或1；q是0或1；以及當(dāng)p是1時(shí)q是0或1并且當(dāng)q是1時(shí)p是0或1，即p和q不同時(shí)表示0。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多特異性抗體分子包含不超過(guò)一個(gè)針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和不超過(guò)一個(gè)針對(duì)CD79的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，q是0且p是1。在一個(gè)實(shí)施方案中，q是1且p是1。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是dab并且V2是dab，并且它們一起形成可操作的可變區(qū)對(duì)、諸如同源VH/VL對(duì)的單一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，所述可變區(qū)對(duì)任選地由二硫鍵連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH和VL特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V2特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1和V2一起(例如作為結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性針對(duì)CD79，例如CD79a或CD79b并且VH和VL特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V2特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1和V2一起(例如作為一個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域)特異性針對(duì)CD22并且VH和VL特異性針對(duì)CD79。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD22，V2特異性針對(duì)白蛋白并且VH和VL特異性針對(duì)CD79。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)白蛋白，V2特異性針對(duì)CD22并且VH和VL特異性針對(duì)CD79。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)CD79，V2特異性針對(duì)白蛋白并且VH和VL特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1特異性針對(duì)白蛋白，V2特異性針對(duì)CD79并且VH和VL特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是特異性針對(duì)CD22的dsscFv，V2是特異性針對(duì)白蛋白的dsscFv并且VH和VL特異性針對(duì)CD79。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是特異性針對(duì)白蛋白的dsscFv，V2是特異性針對(duì)CD22的dsscFv并且VH和VL特異性針對(duì)CD79。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是特異性針對(duì)CD79的dsscFv，V2是特異性針對(duì)白蛋白的dsscFv并且VH和VL特異性針對(duì)CD22。在一個(gè)實(shí)施方案中，V1是特異性針對(duì)白蛋白的dsscFv，V2是特異性針對(duì)CD79的dsscFv并且VH和VL特異性針對(duì)CD22。上述構(gòu)建體中的V1、V2、VH和VL可各自表示結(jié)合結(jié)構(gòu)域并摻入本文提供的任何序列。X和Y表示任意合適的接頭，例如X和Y可以是SGGGGSGGGGS(SEQIDNO:17)。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)V1和/或V2是dab、dsFv或dsscFv時(shí)，V1和/或V2的可變結(jié)構(gòu)域VH和VL之間的二硫鍵形成于位置VH44和VL100之間。本公開(kāi)還擴(kuò)展至本文公開(kāi)的新的多肽序列和與其至少80％相似或相同的序列，例如85％或更大，例如90％或更大，特別是95％或更大的相似性或同一性。本文所用的“同一性”表示在比對(duì)序列中的任何特定位置，氨基酸殘基在序列之間是相同的。本文所用的“相似性”表示在比對(duì)序列中的任何特定位置，氨基酸殘基在序列之間具有相似類型。例如，亮氨酸可以替代異亮氨酸或纈氨酸。通?？梢员舜巳〈钠渌被岚ǖ幌抻冢?苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸)；-賴氨酸、精氨酸和組氨酸(具有堿性側(cè)鏈的氨基酸)；-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性側(cè)鏈的氨基酸)；-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺側(cè)鏈的氨基酸)；和-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫側(cè)鏈的氨基酸)?？梢匀菀椎赜?jì)算同一性和相似性的程度(ComputationalMolecularBiology,Lesk,A.M.編輯,OxfordUniversityPress,NewYork,1988；Biocomputing.InformaticsandGenomeProjects,Smith,D.W.編輯,AcademicPress,NewYork,1993；ComputerAnalysisofSequenceData,Part1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.編輯,HumanaPress,NewJersey,1994；SequenceAnalysisinMolecularBiology,vonHeinje,G.,AcademicPress,1987,SequenceAnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J.編輯,MStocktonPress,NewYork,1991)，可獲取自NCBI的BLASTTM軟件(Altschul,S.F.等人,1990,J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.&States,D.J.1993,NatureGenet.3:266-272.Madden,T.L.等人,1996,Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.等人,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402；Zhang,J.&Madden,T.L.1997,GenomeRes.7:649-656)。特別地，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了任何合適的抗體形式的本文所述的CD22和CD79抗體。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了抗CD22抗體或其片段，其含有一個(gè)或多個(gè)本文上述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含本文提供的CDR并于SEQIDNO：95、96、97、98、99和100(抗體4120)或105、106、107、108、109和110(抗體4126)或115、116、117、118、119和120(抗體4127)或125、126、127、128、129和130(抗體4128)或135、136、137、138、139和140(抗體4130)或145、146、147、148、149和150(抗體4132)中。還提供了抗CD79抗體或其片段，其含有一個(gè)或多個(gè)本文上述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其包含本文提供的CDR并于SEQIDNO：75、76、77、78、79和80(抗體4447)或SEQIDNO：85、86、87、88、89和90(抗體4450)中。所述CDR可以摻入任何合適的抗體構(gòu)架和任何合適的抗體形式。這樣的抗體包括完整抗體及其功能活性片段或衍生物，其可以是但不限于單克隆抗體、人源化抗體、完全人抗體或嵌合抗體。因此，這樣的抗體可以包含具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈或其片段的完整抗體分子，并且可以是但不限于Fab、修飾的Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、單結(jié)構(gòu)域抗體、scFv、二價(jià)、三價(jià)或四價(jià)抗體、Bis-scFv、雙抗體、三抗體、四抗體和上述任何的表位結(jié)合片段(參見(jiàn)例如Holliger和Hudson，2005，NatureBiotech.23(9)：1126-1136；Adair和Lawson，2005，DrugDesignReviews-Online2(3)，209-217)。用于產(chǎn)生和制備這些抗體片段的方法是本領(lǐng)域公知的(參見(jiàn)例如Verma等人，1998，JournalofImmunologicalMethods，216,165-181)。多價(jià)抗體可以包含多種特異性或可以是單特異性的(參見(jiàn)例如WO92/22853和WO05/113605)。應(yīng)當(dāng)理解，如本文上文所述的，本發(fā)明的這個(gè)方面還擴(kuò)展到這些抗CD22和CD79抗體的變體，包括人源化形式和修飾形式，包括其中在CDR中氨基酸已被突變以去除一個(gè)或多個(gè)異構(gòu)化、脫酰胺、糖基化位點(diǎn)或半胱氨酸殘基。接頭本文中在一種環(huán)境中對(duì)接頭的教導(dǎo)同樣可以應(yīng)用于使用接頭的不同環(huán)境(諸如本發(fā)明的任何多特異性分子)中的接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，在本公開(kāi)的分子中使用的接頭是長(zhǎng)度為50個(gè)殘基或更少的氨基酸接頭，例如選自序列5至70所示的序列。表1.鉸鏈接頭序列表2.柔性接頭序列(S)在序列17至20中是任選的。剛性接頭的實(shí)例包括肽序列GAPAPAAPAPA(SEQIDNO:69)、PPPP(SEQIDNO:70)和PPP。其它接頭示于表3中：SEQIDNO:序列55DLCLRDWGCLW56DICLPRWGCLW57MEDICLPRWGCLWGD58QRLMEDICLPRWGCLWEDDE59QGLIGDICLPRWGCLWGRSV60QGLIGDICLPRWGCLWGRSVK61EDICLPRWGCLWEDD62RLMEDICLPRWGCLWEDD63MEDICLPRWGCLWEDD64MEDICLPRWGCLWED65RLMEDICLARWGCLWEDD66EVRSFCTRWPAEKSCKPLRG67RAPESFVCYWETICFERSEQ68EMCYFPGICWM效應(yīng)子分子如果需要，用于本發(fā)明的多特異性分子可以與一個(gè)或多個(gè)效應(yīng)子分子綴合。應(yīng)當(dāng)理解，效應(yīng)子分子可以包含單個(gè)效應(yīng)子分子或兩個(gè)或更多個(gè)這樣的分子，所述兩個(gè)或更多個(gè)這樣的分子經(jīng)連接以形成可以附接到本發(fā)明的多特異性分子上的單個(gè)部分。當(dāng)期望獲得連接至效應(yīng)子分子的根據(jù)本公開(kāi)的抗體或多特異性分子時(shí)，可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)或重組DNA方法制備，其中抗體片段直接或通過(guò)偶聯(lián)劑連接到效應(yīng)子分子。將這些效應(yīng)子分子與抗體綴合的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的(參見(jiàn)，Hellstrom等人,ControlledDrugDelivery,第二版,Robinson等人編輯,1987,pp.623-53；Thorpe等人,1982,Immunol.Rev.,62:119-58和Dubowchik等人,1999,PharmacologyandTherapeutics,83,67-123)。具體的化學(xué)方法包括，例如在WO93/06231、WO92/22583、WO89/00195、WO89/01476和WO03/031581中所述的那些?；蛘撸?dāng)效應(yīng)子分子是蛋白質(zhì)或多肽時(shí)，可以使用重組DNA方法實(shí)現(xiàn)連接，例如在WO86/01533和EP0392745中所述的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子可以包含效應(yīng)子分子。本文所用的術(shù)語(yǔ)效應(yīng)子分子包括例如抗腫瘤劑、藥物、毒素、生物活性蛋白，例如酶、其他抗體或抗體片段、合成或天然存在的聚合物、核酸及其片段，例如DNA、RNA及其片段、放射性核素，特別是放射性碘、放射性同位素、螯合金屬、納米顆粒和報(bào)告基團(tuán)，諸如熒光化合物或可通過(guò)NMR或ESR光譜法檢測(cè)的化合物。效應(yīng)子分子的實(shí)例可包括細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒性劑，包括對(duì)細(xì)胞有害(例如殺死細(xì)胞)的任何試劑。實(shí)例包括combrestatin，尾海兔素，埃博霉素，星形孢菌素，美登木素生物堿，海綿抑制素，rhizoxin，軟海綿素，桿孢菌素，hemiasterlins，紫杉醇，松胞菌素B，短桿菌肽D，溴化乙錠，依米丁，絲裂霉素，依托泊苷，tenoposide，長(zhǎng)春花新堿，長(zhǎng)春花堿，秋水仙堿，阿霉素，柔紅霉素，二羥基炭疽菌素二酮，米托蒽醌，光神霉素，放線菌素D，1-脫氫睪酮，糖皮質(zhì)激素，普魯卡因，丁卡因，利多卡因，心得安和嘌呤霉素及其類似物或同系物。效應(yīng)子分子還包括但不限于抗代謝物(例如氨甲蝶呤，6-巰基嘌呤，6-硫鳥(niǎo)嘌呤，阿糖胞苷，5-氟尿嘧啶decarbazine)，烷化劑(例如氮芥，三胺硫磷苯丁酸氮芥(thioepachlorambucil)，美法侖，卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)，環(huán)磷酰胺，白消安，二溴甘露醇，鏈脲佐菌素，絲裂霉素C和順式二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)，蒽環(huán)類抗生素(例如柔紅霉素(以前稱為道諾霉素)和阿霉素)，抗生素(例如更生霉素(以前稱為放線菌素)，博來(lái)霉素，光神霉素，氨曲霉素(AMC)，加利車(chē)霉素或倍癌霉素)和抗有絲分裂劑(例如長(zhǎng)春花新堿和長(zhǎng)春花堿)。其它效應(yīng)子分子可包括螯合放射性核素諸如111In和90Y、Lu177、鉍213、锎252、銥192和鎢188/錸188；或藥物諸如但不限于烷基磷酸膽堿、拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑、紫杉烷類和蘇拉明。其他效應(yīng)子分子包括蛋白質(zhì)、肽和酶。感興趣的酶包括但不限于蛋白水解酶，水解酶，裂合酶，異構(gòu)酶，轉(zhuǎn)移酶。感興趣的蛋白質(zhì)、多肽和肽包括但不限于免疫球蛋白，毒素諸如相思豆毒蛋白，蓖麻毒蛋白A，假單胞菌外毒素或白喉毒素，蛋白質(zhì)諸如胰島素，腫瘤壞死因子，α-干擾素，β-干擾素，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，血小板衍生生長(zhǎng)因子或組織纖溶酶原激活劑，血栓形成劑或抗血管生成劑，例如血管抑素或內(nèi)皮抑制蛋白，或，生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑諸如淋巴因子，白細(xì)胞介素-1(IL-1)，白細(xì)胞介素-2(IL-2)，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)或其它生長(zhǎng)因子和免疫球蛋白。其他效應(yīng)子分子可以包括可用于例如診斷的可檢測(cè)物質(zhì)。可檢測(cè)物質(zhì)的實(shí)例包括各種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性核素、正電子發(fā)射金屬(用于正電子發(fā)射斷層成像)和非放射性順磁金屬離子。一般參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)4,741,900中關(guān)于可與抗體綴合用作診斷劑的金屬離子。合適的酶包括辣根過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶、β半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基包括鏈霉抗生物素蛋白、抗生物素蛋白和生物素；合適的熒光材料包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯和藻紅蛋白；合適的發(fā)光材料包括魯米諾；合適的生物發(fā)光材料包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；和合適的放射性核素包括125I、131I、111In和99Tc。在另一個(gè)實(shí)例中，效應(yīng)子分子可以增加體內(nèi)抗體的半衰期和/或降低抗體的免疫原性和/或增強(qiáng)抗體跨上皮屏障至免疫系統(tǒng)的遞送。這種類型的合適效應(yīng)子分子的實(shí)例包括聚合物、白蛋白、白蛋白結(jié)合蛋白或白蛋白結(jié)合化合物諸如在WO05/117984中所述的那些。當(dāng)效應(yīng)子分子是聚合物時(shí)，其通?？梢允呛铣苫蛱烊淮嬖诘木酆衔铮缛芜x取代的直鏈或支鏈聚亞烷基、聚亞烯基或聚氧化烯聚合物或支鏈或非支鏈多糖，例如同多糖或異多糖。可存在于上述合成聚合物上的特定任選取代基包括一個(gè)或多個(gè)羥基、甲基或甲氧基。合成聚合物的具體實(shí)例包括任選取代的直鏈或支鏈聚(乙二醇)、聚(丙二醇)聚(乙烯醇)或其衍生物，特別是任選取代的聚(乙二醇)諸如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。功能測(cè)定和篩選形式用于本發(fā)明的典型合適的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以通過(guò)在功能測(cè)定中測(cè)試一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)?lái)鑒定。例如，可以在一種或多種功能測(cè)定中測(cè)試包含特異性針對(duì)抗原CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性針對(duì)抗原CD79a和/或CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多特異性分子。本文所用的“功能測(cè)定”是可用于確定經(jīng)受測(cè)定條件的蛋白質(zhì)復(fù)合物、抗體復(fù)合物或抗體混合物的一種或多種所需性質(zhì)或活性的測(cè)定。合適的功能測(cè)定可以是結(jié)合測(cè)定，細(xì)胞凋亡測(cè)定，抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定，細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖抑制(細(xì)胞抑制作用)測(cè)定，細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性效應(yīng))測(cè)定，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定，細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定，抗體生產(chǎn)和同種型轉(zhuǎn)換，和細(xì)胞分化測(cè)定。根據(jù)本公開(kāi)的多特異性抗體的功效可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法與這些模型中的個(gè)體抗體或抗體(或片段)的混合物進(jìn)行比較。功能測(cè)定可以根據(jù)需要重復(fù)多次以增強(qiáng)結(jié)果的可靠性?？梢圆捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)來(lái)鑒定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的結(jié)果，從而鑒定具有生物功能的多特異性分子。合適的功能測(cè)定的實(shí)例描述于本文的實(shí)施例中，并且包括測(cè)量本發(fā)明的多特異性分子在用抗IgM刺激后抑制B細(xì)胞激活的能力，如通過(guò)檢測(cè)B細(xì)胞激活的標(biāo)志物諸如磷酸化Akt表達(dá)、磷酸化P38表達(dá)、PLCγ信號(hào)傳導(dǎo)、CD40表達(dá)、CD71表達(dá)和/或CD86表達(dá)。當(dāng)建立用于篩選的功能測(cè)定時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以設(shè)定合適的閾值，其中超過(guò)該閾值的所鑒定的活性被認(rèn)為是“命中”。在使用多于一種功能測(cè)定的情況下，可以將每種測(cè)定的閾值設(shè)定在合適的水平以建立可控的命中率。在一個(gè)實(shí)例中，命中率可以是3-5％。在一個(gè)實(shí)例中，當(dāng)在B細(xì)胞激活測(cè)定中搜索抑制B細(xì)胞功能的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)r(shí)所設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)可以是至少兩個(gè)磷酸讀出數(shù)據(jù)(phospho-readout)的至少30％抑制，如上文和本文實(shí)施例所述。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化P38的抑制具有小于1nM的IC50，優(yōu)選小于0.5nM的IC50。在一個(gè)實(shí)例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.05nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化Akt的抑制具有小于1nM的IC50，優(yōu)選小于0.1nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.05nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化的PLCγ2的抑制具有小于1nM的IC50，優(yōu)選小于0.8nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.05nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抑制抗IgM刺激的B細(xì)胞中的CD71表達(dá)具有小于5nM的IC50，優(yōu)選小于3nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.5nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抑制抗IgM刺激的B細(xì)胞中的CD40表達(dá)具有小于5nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.5nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抑制抗IgM刺激的B細(xì)胞中的CD86表達(dá)具有小于5nM的IC50，優(yōu)選小于2nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施例中，多特異性分子在該測(cè)定中的IC50小于0.5nM。在一個(gè)實(shí)例中，本發(fā)明的多特異性分子對(duì)于抑制抗IgM刺激的B細(xì)胞中的CD71、CD40和CD86表達(dá)具有小于5nM的IC50和/或?qū)τ谝种瓶笽gM刺激的B細(xì)胞中的磷酸化的PLCγ2、P38和AKT的表達(dá)具有小于1nM的IC50。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用體內(nèi)測(cè)定，諸如動(dòng)物模型，包括小鼠腫瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或細(xì)菌感染的嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型等，來(lái)測(cè)試本公開(kāi)的分子。下文描述了用于篩選和發(fā)現(xiàn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的合適形式的實(shí)例。篩選以鑒定用于本發(fā)明的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以使用雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。本文所用的“雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物”是指包含通過(guò)異二聚體系鏈保持在一起的兩種蛋白質(zhì)(本文稱為雙特異性成分的A和B)的分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)中的一種或兩種具有結(jié)合結(jié)構(gòu)域，例如蛋白質(zhì)中的一種或兩種是抗體或其片段。通常，雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物具有式A-X:Y-B，其中：A-X是第一融合蛋白；Y-B是第二融合蛋白；X:Y是異二聚體系鏈；A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域；B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域；X是結(jié)合對(duì)的第一個(gè)結(jié)合伴侶；Y是所述結(jié)合對(duì)的第二結(jié)合伴侶；和:是X和Y之間的相互作用(例如結(jié)合相互作用)，和本文所用的“融合蛋白”包含與另一個(gè)實(shí)體例如結(jié)合伴侶X或Y(視情況而定)融合的蛋白質(zhì)成分，例如A或B。在實(shí)施方案中，融合蛋白是通過(guò)重組技術(shù)從遺傳構(gòu)建體表達(dá)的翻譯蛋白，例如在宿主中表達(dá)自DNA構(gòu)建體。系鏈X:Y的功能是保持蛋白A和B彼此接近，從而可以實(shí)現(xiàn)A和B的協(xié)同功能。本文所用的“異二聚體系鏈”是指包含兩個(gè)不同的結(jié)合伴侶X和Y的系鏈，所述結(jié)合伴侶形成彼此之間的相互作用(例如結(jié)合)，其具有足以將兩個(gè)結(jié)合伴侶保持在一起的總親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，X和/或Y不適合形成同二聚體。異二聚體系鏈?zhǔn)`和異二聚體系鏈在本文中可互換使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，“不適于形成同二聚體”是指一旦形成，則X-Y的異二聚體的形成是更優(yōu)選的，例如穩(wěn)定的，諸如熱力學(xué)穩(wěn)定的和/或物理上穩(wěn)定的(例如由缺乏聚集所證明的)。在一個(gè)實(shí)施方案中，X-Y相互作用比X-X或Y-Y相互作用更有利。當(dāng)融合蛋白A-X和B-Y混合時(shí)，這減少了同二聚體X-X或Y-Y的形成。這也使得同二聚體的去除相對(duì)簡(jiǎn)單，例如一個(gè)純化步驟(諸如柱層析)提供基本上純的根據(jù)本公開(kāi)的融合蛋白和/或雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，在融合蛋白表達(dá)后提供純化步驟。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在體外混合之前，以基本上純的形式提供融合蛋白。本文所用的基本上純的形式是指其中融合蛋白在85至100％范圍內(nèi)的，例如90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％的單體。在一個(gè)實(shí)施方案中，在雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物形成之后不需要純化。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的體外混合步驟中使用的融合蛋白的比例為A-X對(duì)B-Y是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的體外混合步驟中使用的融合蛋白的比例為B-Y對(duì)A-X是0.8:1至3:1，例如1.5:1或2:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，該比例為1:1。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合伴侶中的一個(gè)(或至少一個(gè))不能形成同二聚體，例如，結(jié)合伴侶的氨基酸序列被突變以消除或最小化同二聚體的形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)結(jié)合伴侶不能形成同二聚體，例如結(jié)合伴侶之一是肽，而另一個(gè)結(jié)合伴侶是特異性針對(duì)所述肽的VHH。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子中使用的scFv不能形成同二聚體。本文所使用的不能形成同二聚體，是指形成同二聚體的傾向低或?yàn)榱?。本文所用的低是?％或更少，諸如4、3、2、1、0.5％或更少的聚集。融合蛋白中的少量聚集或異二聚體系鏈?zhǔn)`的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物中殘余物通常對(duì)本公開(kāi)的方法具有最小的影響。在一個(gè)實(shí)施方案中，:是結(jié)合相互作用，例如基于吸引力諸如范德華力，諸如氫鍵和靜電相互作用，例如基于對(duì)抗原(諸如肽)的抗體特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，:是由特定化學(xué)相互作用(諸如點(diǎn)擊化學(xué))形成的共價(jià)鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，:不是共價(jià)鍵。本文所用的“形成復(fù)合物”是指當(dāng)融合蛋白成分A-X和B-Y在復(fù)合物組裝和融合蛋白保持在一起的適當(dāng)條件下接觸時(shí)充分特異和強(qiáng)的相互作用(包括結(jié)合相互作用或化學(xué)反應(yīng))。本文所用的“保持在一起”是指將成分(融合蛋白)保持在彼此附近，使得在結(jié)合后，復(fù)合物可以被處理為好像它是一個(gè)分子，并且在許多情況下表現(xiàn)和行為類似單個(gè)分子。在一個(gè)實(shí)施方案中，保持使得復(fù)合物適合用于本文公開(kāi)的方法，即適合用于至少一種功能篩選。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合相互作用是可逆的。當(dāng)涉及本文使用的X和Y時(shí)，特異性是指相互作用中的結(jié)合伴侶X和Y僅相互識(shí)別，或相對(duì)于非伴侶而言彼此具有顯著更高的親和力，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10倍的親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，X和Y之間的結(jié)合相互作用具有低解離常數(shù)。低解離常數(shù)的實(shí)例包括1-9x10-2s-1或更低，例如1-9x10-3s-1、1-9x10-4s-1、1-9x10-5s-1、1-9x10-6s-1或1-9x10-7s-1。特別合適的解離常數(shù)包括1x10-4s-1或更低，例如1x10-5s-1、1x10-6s-1或1x10-7s-1。盡管不希望受理論束縛，但據(jù)信低解離常數(shù)(也稱為解離速率)允許分子足夠穩(wěn)定以使雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物有用，特別是在功能篩選測(cè)定中。在一個(gè)實(shí)施方案中，X和Y彼此的親和力為5nM或更強(qiáng)，例如4nM、3nM、2nM、1nM或更強(qiáng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，X和Y彼此的親和力為900pM或更強(qiáng)，例如800、700、600、500、400、300、200、100或50pM或更強(qiáng)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X和Y彼此的親和力為10pM或更強(qiáng)，例如9、8、7、6或5pM。親和度是從相互作用的結(jié)合速率和解離速率所計(jì)算的值。本文所用的術(shù)語(yǔ)“親和力”是指分子(例如抗體)的單個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與其結(jié)合伴侶(例如肽)之間的非共價(jià)相互作用的總和的強(qiáng)度。分子對(duì)其結(jié)合伴侶的親和力通?？梢杂善胶饨怆x常數(shù)(KD)表示。親和力可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法測(cè)量，包括本文所述的那些，諸如表面等離子體共振方法，特別是BIAcore。在一個(gè)實(shí)施方案中，平行或基本同時(shí)測(cè)試根據(jù)本公開(kāi)的多個(gè)雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。本文所用的同時(shí)是指在相同的分析中、例如在相同的“運(yùn)行”中分析樣品/分子/復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，同時(shí)是指由儀器伴隨分析在基本上相同的時(shí)間分析信號(hào)輸出。該信號(hào)可能需要解卷積以解釋所獲得的結(jié)果。有利地，測(cè)試多個(gè)雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物允許更有效地篩選大量的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物和鑒定新的和有趣的關(guān)系。顯然，針對(duì)有趣的CD22和CD79的靶抗原不同的可變區(qū)可以獲得生物功能中的細(xì)微差別。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)使用如上所定義的多重測(cè)試法測(cè)試多個(gè)雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，并對(duì)其進(jìn)行一種或多種功能測(cè)定。本文使用的術(shù)語(yǔ)“生物功能”是指被測(cè)試的生物實(shí)體的天然活性或目的，例如細(xì)胞、蛋白質(zhì)或類似物的天然活性。理想地，可以使用體外功能測(cè)定法來(lái)測(cè)試功能的存在，包括使用活哺乳動(dòng)物細(xì)胞的測(cè)定。本文所用的天然功能包括異常功能，諸如與癌癥相關(guān)的功能。本文使用的相關(guān)“生物比較物”是指在針對(duì)雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物所采用的相同測(cè)定中用于評(píng)估活性以確定是否存在任何變化或新的活性或功能的合適實(shí)體。適用于A-X:Y-B的比較物可包括天然形式或以與雙特異性相同的形式存在的純化蛋白質(zhì)(包括重組蛋白質(zhì))，即其中A和B是相同的實(shí)體，諸如A-X:Y-A或B-X:Y-B。或者，可以使用未復(fù)合形式的融合蛋白A-X或B-Y作為比較物?；蛘?，可以采用不同形式(特別是如本文所述)的多個(gè)比較物。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于文獻(xiàn)中發(fā)現(xiàn)的公知常識(shí)或信息來(lái)識(shí)別和包括合適的對(duì)照/比較物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“協(xié)同功能”是指未觀察到或高于當(dāng)本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的第一和第二蛋白沒(méi)有一起使用時(shí)所觀察到的生物活性，例如僅在雙特異性形式中觀察到的活性。因此，“協(xié)同”包括新的生物功能。本公開(kāi)提供了至少特異性針對(duì)具有新的生物功能的CD22和CD79的分子。本文所用的新的生物功能是指直到兩種或更多種協(xié)同實(shí)體[蛋白A和蛋白B]結(jié)合在一起(作為雙特異性或其它方式)時(shí)才是明顯或不存在的功能或以前未鑒定的功能。本文所用的更高是指活性增加，包括從零增加，即雙特異性中的一些活性，其中個(gè)別未復(fù)合的雙特異性成分在相關(guān)功能測(cè)定中沒(méi)有活性，本文也稱為新活性或新生物功能。本文所用的更高還包括相比于個(gè)別未復(fù)合的雙特異性成分或二價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在相關(guān)功能測(cè)定中雙特異性中的更多附加功能，例如相關(guān)活性中10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％或更高的增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，新的協(xié)同功能是更高的抑制活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多特異性抗體分子具有比單獨(dú)或混合提供的針對(duì)CD22的二價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)域和針對(duì)CD79a的二價(jià)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的活性的總和更高的抑制活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的第一結(jié)合伴侶X和第二結(jié)合伴侶Y中的至少一個(gè)獨(dú)立地選自肽和蛋白質(zhì)；例如第一結(jié)合伴侶或第二結(jié)合伴侶是肽。合適的肽包括包含以下的組：GCN4，F(xiàn)os/Jun(人和鼠Fos分別具有Uniprot編號(hào)P01100和P01101，人和鼠jun分別具有Uniprot編號(hào)P05412和P05627)，人流感血凝素(HA)，多組氨酸(His)，綠色熒光蛋白(GFP)和FLAG。也考慮了適用于本公開(kāi)內(nèi)容的其它肽，并且特別合適的肽是用于蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽，因?yàn)檫@樣的肽具有以高親和力結(jié)合其各自的結(jié)合伴侶的趨勢(shì)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽”是指通過(guò)肽鍵連接的氨基酸的短聚合物，其中所述肽含有2至100個(gè)氨基酸，例如5至99，諸如6至98、7至97或8至96。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)中使用的肽是具有50個(gè)氨基酸殘基或更少，例如40、30、10個(gè)氨基酸殘基或更少的氨基酸序列。本公開(kāi)中使用的肽具有足夠長(zhǎng)度以適合目的，例如如果肽是接頭，則其需要適當(dāng)長(zhǎng)以允許其連接的片段發(fā)揮其生物功能；或者如果肽是結(jié)合伴侶，則其必須能夠特異性結(jié)合另一個(gè)實(shí)體，諸如抗體。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)的另一個(gè)結(jié)合伴侶(備選的第一或第二結(jié)合伴侶)是蛋白質(zhì)。本文所用的蛋白質(zhì)是指具有100個(gè)氨基酸或更多的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所用的“蛋白質(zhì)”是指具有二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的第一蛋白A和/或第二蛋白B是抗體或抗體片段。這樣的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物可以稱為雙特異性抗體復(fù)合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的雙特異性抗體復(fù)合物中采用的每個(gè)抗體或片段包含一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。在融合蛋白(A-X或B-Y)中使用的全長(zhǎng)抗體或抗體片段可以是單特異性的、多價(jià)的或雙特異性的。有利地，使用兩個(gè)雙特異性抗體或抗體片段允許本公開(kāi)的分子、諸如本文所述的雙特異性抗體復(fù)合物潛在地對(duì)多達(dá)4種不同抗原具有特異性(即復(fù)合物可以是四特異性的)。這允許研究親合力類型效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗體或抗體片段是單特異性抗體或抗體片段，例如Fab，F(xiàn)ab'，scFv或類似物，并且在特別是特異性針對(duì)CD22的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗體或抗體片段是單特異性抗體或抗體片段，例如Fab，F(xiàn)ab'，scFv或類似物，特別是特異性針對(duì)CD79a和/或CD79b的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗體或抗體片段是多價(jià)的，即具有兩個(gè)或更多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗體或抗體片段是單價(jià)的，并且在本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-X)中使用的抗體或抗體片段是單價(jià)的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單價(jià)的。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的多特異性分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域是單價(jià)和單特異性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗體或抗體片段是單價(jià)的，并且本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗體或抗體片段是多價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗體或抗體片段是多價(jià)的，并且本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗體或抗體片段是單價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第一融合蛋白A-X)中使用的抗體或抗體片段是多價(jià)的，并且本公開(kāi)的分子或其成分(諸如第二融合蛋白B-Y)中使用的抗體或抗體片段是多價(jià)的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)分子或其成分(例如雙特異性抗體復(fù)合物)的第一抗體、第二抗體或第一和第二抗體二者可以是IgG形式，例如抗CD22和/或抗CD79抗體可以以IgG形式提供。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗體片段選自：在第一融合蛋白(A-X)或第二融合蛋白(B-Y)中使用的片段抗原(Fab)片段，單鏈可變片段(scFv)和單結(jié)構(gòu)域抗體(sdAb)，諸如scFv。有利地，小尺寸的scFv可以促進(jìn)雙特異性抗體復(fù)合物的正確折疊。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的雙特異性抗體復(fù)合物的第一抗體/片段(A)、第二抗體/片段(B)或第一和第二抗體/片段兩者可以是Fab。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的雙特異性抗體復(fù)合物的第一、第二抗體/片段或第一和第二抗體/片段兩者都是VHH。在本公開(kāi)的雙特異性復(fù)合物的上下文中使用的“融合蛋白”是指蛋白質(zhì)，例如附接于結(jié)合伴侶的抗體或抗體片段。為了方便，本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物在本文中稱為A-X:Y-B。然而，該命名法并不旨在限制融合蛋白A-X和B-Y如何設(shè)計(jì)，因?yàn)槲覀兊膶?shí)驗(yàn)表明，結(jié)合伴侶X和Y可以顛倒(即A-Y和B-X)而不會(huì)不利地影響該方法。因此，A和B以及X和Y是被稱為用于輔助本技術(shù)的解釋的標(biāo)稱標(biāo)簽。本文所用的“附接”是指通過(guò)接頭直接或間接連接(connected或joined)，諸如肽接頭，其實(shí)例在下文討論。直接連接包括融合在一起(例如肽鍵)或化學(xué)綴合。本文所用的“結(jié)合伴侶”是指結(jié)合對(duì)的一個(gè)組成部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合伴侶的親和力高為5nM或更強(qiáng)，諸如900、800、700、600、500、400、300pM或更強(qiáng)。本文所用的“結(jié)合對(duì)”是指彼此特異性結(jié)合的兩個(gè)結(jié)合伴侶。結(jié)合對(duì)的實(shí)例包括肽和特異性針對(duì)其的抗體或結(jié)合片段，或酶和配體，或酶和該酶的抑制劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(X)選自：全長(zhǎng)抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，scFv，肽和sdAb，其中sdAb的實(shí)例包括VH或VL或VHH。在一個(gè)實(shí)施方案中，第二伴侶(Y)選自全長(zhǎng)抗體，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab'，scFv，肽和sdAb，其中sdAb的實(shí)例包括VH或VL或VHH。在一個(gè)實(shí)施方案中，在A是抗體或其片段的情況下，第一結(jié)合伴侶(X)附接到第一抗體或抗體片段的重鏈或輕鏈的C末端，例如，第一結(jié)合伴侶附接到第一抗體或抗體片段的重鏈的C末端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在B是抗體或其片段的情況下，第二結(jié)合伴侶(Y)附接到第二抗體或抗體片段的重鏈或輕鏈的C末端，例如第二結(jié)合伴侶附接到第二抗體或抗體片段的重鏈的C末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，X附接到抗體或片段(蛋白A)的重鏈的C末端，Y附接到抗體或片段(蛋白B)的C末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，X通過(guò)接頭(諸如ASGGGG或ASGGGGSG)附接到抗體或片段(蛋白A)的重鏈的C末端，并且Y通過(guò)接頭(諸如ASGGGG或ASGGGGSG)附接到抗體或片段(蛋白B)的C末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二結(jié)合伴侶(X或Y)是肽。合適的結(jié)合對(duì)的實(shí)例可以包括GCN4(SEQIDNO：1)或其變體和52SR4(SEQIDNO：3)或其變體，其是特異性針對(duì)GCN4的scFv。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(標(biāo)稱X)是GCN4(例如如SEQIDNO：1所示)或其變體(例如沒(méi)有His標(biāo)簽)，第二結(jié)合伴侶(標(biāo)稱Y)是特異性針對(duì)GCN4的scFv(例如如SEQIDNO：3所示)或其變體。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(標(biāo)稱X)是特異性針對(duì)GCN4的sFv(例如如SEQIDNO：3所示)或其變體，并且第二結(jié)合伴侶(標(biāo)稱Y)是GCN4(例如SEQIDNO：1所示)或其變體。GCN4變體包括與SEQIDNO：1具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％或98％、或99％同一性的氨基酸序列。GCN4變體還包括與由核苷酸序列SEQIDNO：2或在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：2雜交的核苷酸序列編碼的序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸。特異性針對(duì)GCN4的合適的scFv是52SR4(SEQIDNO：3)或其變體。52SR4的變體包括與SEQIDNO：3具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。52SR4變體還包括與由核苷酸序列SEQIDNO：4或在嚴(yán)格條件下與SEQIDNO：2雜交的核苷酸序列編碼的序列具有至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％、或99％同一性的氨基酸序列。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)單鏈抗體52SR4和肽GCN4是適合用于本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合對(duì)?；蛘撸梢詫⑷魏魏线m的抗體/片段和抗原(諸如肽)用作X和Y.在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(X)和第二結(jié)合伴侶(Y)是蛋白質(zhì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(X)是酶或其活性片段，第二結(jié)合伴侶(Y)是配體，或反之亦然。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶(X)是酶或其活性片段，第二結(jié)合伴侶(Y)是該酶的抑制劑，或反之亦然。本文使用的“活性片段”是指氨基酸片段，其小于實(shí)體的整個(gè)氨基酸序列，并保持基本上相同的生物活性或相關(guān)生物活性，例如大于50％活性，諸如60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一結(jié)合伴侶X是谷胱甘肽(GSH)，第二結(jié)合伴侶Y是谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，反之亦然。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X是Fos，Y是Jun，或反之亦然。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X是His，Y是抗His，或反之亦然。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合對(duì)是鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽，Y是鈣調(diào)蛋白，或反之亦然。在另一個(gè)實(shí)施方案中，X是麥芽糖結(jié)合蛋白，Y是抗麥芽糖結(jié)合蛋白或其片段，或反之亦然。也考慮了其它酶-配體組合用于結(jié)合伴侶。還合適的是本領(lǐng)域已知的用于蛋白質(zhì)純化的親和標(biāo)簽，因?yàn)樗鼈兙哂幸愿哂H和力結(jié)合其各自的結(jié)合伴侶的趨勢(shì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一或第二結(jié)合伴侶(X或Y)是蛋白質(zhì)或肽。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一和第二融合蛋白包含一個(gè)或多個(gè)肽接頭。接頭可以并入融合蛋白中的各個(gè)位置。例如，可以在結(jié)合伴侶和與其附接的蛋白質(zhì)之間引入接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭是肽接頭。本文所用的術(shù)語(yǔ)“肽接頭”是指具有氨基酸序列的肽。一系列合適的肽接頭是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽接頭可以是合成來(lái)源的，即通過(guò)合成化學(xué)技術(shù)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的結(jié)合伴侶通過(guò)肽接頭與其各自的蛋白質(zhì)連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白是翻譯融合物，其是在包含由其表達(dá)融合蛋白的遺傳構(gòu)建體的宿主細(xì)胞中表達(dá)的融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合蛋白通過(guò)任選地經(jīng)由肽接頭將A綴合至X或?qū)綴合至Y來(lái)制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，肽接頭的長(zhǎng)度為50個(gè)氨基酸或更少，例如20個(gè)氨基酸或更少。通常重組表達(dá)融合蛋白將更有效，因此可由宿主細(xì)胞表達(dá)的直接肽鍵或肽接頭可能是有利的。在一個(gè)方面，提供了產(chǎn)生本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的方法，包括以下步驟：(a)產(chǎn)生附接于結(jié)合對(duì)的第一結(jié)合伴侶(X)的包含特異性針對(duì)CD22或CD79a和/或CD79b(A)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一融合蛋白(A-X)；(b)產(chǎn)生附接于結(jié)合對(duì)的第二結(jié)合伴侶(Y)的包含特異性針對(duì)CD22或CD79a和/或CD79b(B)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第二融合蛋白(B-Y)；其中至少第一融合蛋白或第二融合蛋白包含特異性針對(duì)CD22的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，剩下的另一融合蛋白包含特異性針對(duì)CD79a和/或CD79b的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，和(c)將步驟a)和b)中制備的第一融合蛋白(A-X)和第二融合蛋白(B-Y)混合在一起。特別地，通過(guò)在體外混合A-X和B-Y來(lái)制備異二聚體系鏈?zhǔn)`的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括使A-X和B-Y接觸的體外混合步驟。因此，通常融合蛋白A-X和B-Y不共表達(dá)于相同的細(xì)胞中。這是有利的，因?yàn)槠湓试S例如100種A-X融合蛋白和100種A-Y融合蛋白分開(kāi)表達(dá)并任選地純化，并且通過(guò)隨后以各種排列混合這200種融合蛋白，可以提供10,000種異二聚體系鏈?zhǔn)`的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。相比之下，現(xiàn)有技術(shù)方法需要雙特異性的共表達(dá)，因此對(duì)于10,000種復(fù)合物，需要10,000個(gè)轉(zhuǎn)染、表達(dá)和純化。結(jié)合伴侶X和Y彼此具有親和力，并且作為或棒和磁體的生物等價(jià)物，并將復(fù)合物保持在一起。有利地，這意味著融合蛋白A-X和Y-B可以容易地通過(guò)簡(jiǎn)單地將融合蛋白混合在一起而組裝成雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。因此，本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物具有模塊化結(jié)構(gòu)，其允許容易地組裝兩種不同的蛋白，以便以例如網(wǎng)格樣方式產(chǎn)生具有不同抗原特異性組合的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的大組排列。這允許有效和系統(tǒng)篩選大量的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，以便檢測(cè)累加的、協(xié)同的或新的生物功能。給定X和Y對(duì)彼此是特異性的，這顯著降低了形成同二聚體的能力。X和Y在本文中統(tǒng)稱為結(jié)合對(duì)或結(jié)合伴侶。在一個(gè)實(shí)施方案中，X對(duì)其它X不具有高親和力。在一個(gè)實(shí)施方案中，Y對(duì)其它Y不具有高親和力。有利地，當(dāng)X和Y不形成同二聚體時(shí)，這防止了不期望的單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，增加了所需雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的產(chǎn)量，并且消除了繁重的純化步驟以除去單特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的需要。雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的這種快速組裝、產(chǎn)率和/或純度的水平不能通過(guò)現(xiàn)有技術(shù)方法有效獲得，特別是現(xiàn)有技術(shù)的方法通常需要大量的純化步驟。有利地，X和Y成分允許包含由不同排列的融合蛋白組成的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的多元體以快速且容易地組裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白A和B是抗體或抗體片段。當(dāng)抗體或抗體片段作為復(fù)合物通過(guò)X和Y保持在一起時(shí)，這形成雙特異性抗體復(fù)合物?；旌贤ǔＴ赬和Y可以相互作用的條件下進(jìn)行。在一個(gè)實(shí)施方案中，將融合蛋白在細(xì)胞培養(yǎng)條件下在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育，例如將融合蛋白在37℃/5％CO2環(huán)境中孵育90分鐘。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的融合蛋白在水性環(huán)境中混合，例如一種融合蛋白可以結(jié)合到固體表面諸如珠或板，而另一種融合蛋白可以被以水溶液/懸液的形式引入其中。固相允許容易地洗掉多余的成分和試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種融合都不與固相附接而是簡(jiǎn)單地混合在液體/溶液/培養(yǎng)基中。有利地，本公開(kāi)的方法可用于制備異源對(duì)之間(即在第一融合蛋白[A-X]和第二融合蛋白[B-Y]之間)形成的復(fù)合物，其中同源對(duì)之間的相互作用(即兩個(gè)第一融合蛋白[A-X]之間或兩個(gè)第二融合蛋白[B-Y]之間)被最小化。因此，本發(fā)明的方法允許制備大量的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，同時(shí)具有最小或沒(méi)有同二聚體復(fù)合物的污染。使用現(xiàn)有技術(shù)的方法，這種純度和產(chǎn)率水平是不可能的。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成的復(fù)合物不需要進(jìn)一步的純化步驟。在一個(gè)實(shí)施方案中，形成的復(fù)合物需要一個(gè)純化步驟，例如柱層析。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法還包括至少一個(gè)純化步驟，例如在表達(dá)根據(jù)本公開(kāi)的融合蛋白之后。本文所用的“功能測(cè)定”是可用于確定經(jīng)受測(cè)定條件的蛋白質(zhì)復(fù)合物、抗體復(fù)合物或抗體混合物的一種或多種所需性質(zhì)或活性的測(cè)定。合適的功能測(cè)定可以是結(jié)合測(cè)定，細(xì)胞凋亡測(cè)定，抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)測(cè)定，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)測(cè)定，細(xì)胞生長(zhǎng)或增殖抑制(細(xì)胞抑制作用)測(cè)定，細(xì)胞殺傷(細(xì)胞毒性效應(yīng))測(cè)定，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)測(cè)定，細(xì)胞因子產(chǎn)生測(cè)定，抗體生產(chǎn)和同種型轉(zhuǎn)換，和細(xì)胞分化測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用體內(nèi)測(cè)定，諸如動(dòng)物模型，包括小鼠腫瘤模型、自身免疫疾病模型、病毒感染或細(xì)菌感染的嚙齒動(dòng)物或靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型等，來(lái)測(cè)試本公開(kāi)的分子。在雙特異性抗體復(fù)合物的上下文中，根據(jù)本公開(kāi)的雙特異性抗體復(fù)合物的功效可以通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常已知的方法與這些模型中的個(gè)體抗體或抗體(或片段)的混合物進(jìn)行比較。功能測(cè)定可以根據(jù)需要重復(fù)多次，具有或不具有特定雙特異性抗體復(fù)合物的不同樣品，以增強(qiáng)結(jié)果的可靠性。可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)來(lái)鑒定統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的結(jié)果，從而鑒定具有生物功能的雙特異性抗體復(fù)合物，特別是鑒定用于本發(fā)明的多特異性分子的最佳可變區(qū)對(duì)。組合物和醫(yī)療用途在一個(gè)方面，提供了根據(jù)本公開(kāi)的分子或成分，諸如融合蛋白，異二聚體系鏈?zhǔn)`的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，包含本發(fā)明的分子的組合物，包括融合蛋白或所述雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，如本文定義的多元體、陣列、文庫(kù)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子，例如本文所述的抗體，多特異性分子和雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物適合于治療應(yīng)用，并且可以提供用于治療疾病的新療法。因此，在另一方面，提供了本發(fā)明的分子，例如上述的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，其用于治療。包括本文所述的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的本公開(kāi)的分子適合于治療一系列疾病，諸如癌癥。本公開(kāi)的分子，包括本文所述的多特異性分子和雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，也特別適合于抑制B細(xì)胞功能，以便控制各種自身免疫疾病中的免疫和自身免疫反應(yīng)。因此，本公開(kāi)擴(kuò)展到治療患者疾病的方法，包括施用治療有效量的本公開(kāi)的分子，例如本公開(kāi)的多特異性分子或雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。在一個(gè)方面，提供了包含一種或多種本公開(kāi)分子、例如本公開(kāi)的多特異性分子的藥物組合物。組合物中可包括各種不同的組分，包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。組合物可以任選地包含能夠改變本發(fā)明的多特異性分子群體的特征從而例如降低、穩(wěn)定、延遲、調(diào)節(jié)和/或激活抗體功能的其它分子。組合物可以是固體或液體形式，并且尤其可以是粉末、片劑、溶液或氣霧劑的形式。本發(fā)明還提供了藥物或診斷組合物，其包含與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合的本發(fā)明的抗體分子或多特異性分子。因此，提供了本發(fā)明的多特異性分子用于治療和制造用于治療病理性病況或病癥的藥物的用途。病理學(xué)病況病理學(xué)病況或病癥可以例如選自感染(病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲(chóng))，與感染相關(guān)的內(nèi)毒素性休克，關(guān)節(jié)炎諸如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，哮喘諸如重癥哮喘，慢性阻塞性肺病(COPD)，骨盆炎性疾病，阿爾茨海默氏病，炎性腸病，克羅恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，佩羅尼氏病，乳糜瀉，膽囊疾病，藏毛病，腹膜炎，銀屑病，血管炎，手術(shù)粘連，中風(fēng)，I型糖尿病，萊姆病，腦膜腦炎，自身免疫性葡萄膜炎，中樞和周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)的免疫介導(dǎo)的炎性病癥，諸如多發(fā)性硬化，狼瘡(諸如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)和吉蘭-巴雷綜合征，特應(yīng)性皮炎，自身免疫性肝炎，纖維性肺泡炎，格雷夫斯病，IgA腎病，特發(fā)性血小板減少性紫癜，梅尼埃病，天皰瘡，原發(fā)性膽汁性肝硬化，結(jié)節(jié)病，硬皮病，韋氏肉芽腫病，其它自身免疫性疾病，胰腺炎，創(chuàng)傷(手術(shù))，移植物抗宿主病，移植排斥，心臟病包括缺血性疾病諸如心肌梗塞以及動(dòng)脈粥樣硬化，血管內(nèi)凝血，骨吸收，骨質(zhì)疏松，骨關(guān)節(jié)炎，牙周炎，胃酸過(guò)少癥和癌癥，包括乳腺癌，肺癌，胃癌，卵巢癌，肝細(xì)胞癌，結(jié)腸癌，胰腺癌，食管癌，頭頸癌，腎臟癌癥，特別是腎細(xì)胞癌，前列腺癌，肝癌，黑素瘤，肉瘤，骨髓瘤，成神經(jīng)細(xì)胞瘤，胎盤(pán)絨毛膜癌，子宮頸癌和甲狀腺癌及其轉(zhuǎn)移形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是癌癥，例如白血病，包括淋巴細(xì)胞白血病，諸如急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性淋巴細(xì)胞白血??；或骨髓性白血病，諸如急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫性疾病包括：-急性播散性腦脊髓炎(adem)，急性壞死性出血性白質(zhì)腦炎，艾迪生病，腎上腺皮質(zhì)功能不全，皮質(zhì)醇減少癥，斑禿，淀粉樣變性，強(qiáng)直性脊柱炎，脊柱關(guān)節(jié)炎，Strumpell-marie疾病，抗GBM/抗TBM腎炎，抗磷脂綜合征(aps)，自身免疫性血管性水腫，自身免疫性再生障礙性貧血，自身免疫性自主神經(jīng)障礙，自身免疫性肝炎，自身免疫性高脂血癥，自身免疫性免疫缺陷，自身免疫性內(nèi)耳疾病(AIED)，自身免疫性淋巴細(xì)胞增生性綜合征(ALPS)，Canale-Smith綜合征，自身免疫性心肌炎，自身免疫性卵巢炎，自身免疫性胰腺炎(AIP)，自身免疫性多內(nèi)分泌腺綜合征(I、II&III型)，自身免疫性視網(wǎng)膜病變(AR)，自身免疫性血小板減少性紫癜(ATP)，自身免疫性甲狀腺疾病，自身免疫性蕁麻疹，軸突/神經(jīng)元神經(jīng)病變，巴洛病，白塞氏綜合征疾病，大皰性類天皰瘡，心肌病，卡斯特爾曼氏疾病，乳糜瀉，美洲錐蟲(chóng)病(chagasdisease)，慢性炎性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病(CIDP)，慢性復(fù)發(fā)性多灶性骨髓炎(CRMO)，Churg-Strauss綜合征，瘢痕性類天皰瘡/良性粘膜類天皰瘡(CP)，克羅恩病，炎癥性腸病，結(jié)腸炎，腸炎，回腸炎，Cogans綜合征，冷凝集病，先天性心臟傳導(dǎo)阻滯，柯薩奇心肌炎，crest病，冷球蛋白血癥，脫髓鞘性神經(jīng)病變，皰疹樣皮炎，杜氏病，皮肌炎，糖尿病，I型，盤(pán)狀紅斑狼瘡(DLE)，心肌梗死后綜合征，子宮內(nèi)膜異位癥，大皰性表皮松解癥(EB)和耳聾(EBA)，嗜酸性胃腸炎，食管炎，嗜酸性筋膜炎，舒曼綜合征，結(jié)節(jié)性紅斑，實(shí)驗(yàn)性變應(yīng)性腦脊髓炎，伊文思綜合征，纖維性肺泡炎，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎(顳動(dòng)脈炎)，巨細(xì)胞性心肌炎，腎小球性腎炎(非增殖性：局灶性節(jié)段性腎小球硬化和膜性腎小球腎炎。增殖性：IgA腎病)，肺出血-腎炎綜合征，具有多發(fā)性血管炎的肉芽腫病(GPA)(以前稱為韋氏肉芽腫病)，格雷夫斯病，吉蘭-巴雷綜合征，米勒費(fèi)希爾綜合征，急性運(yùn)動(dòng)性軸突性神經(jīng)病，急性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)軸突性神經(jīng)病，急性泛自主神經(jīng)病，Bickerstaff的腦干腦炎，橋本氏腦炎，橋本甲狀腺炎，溶血性貧血，過(guò)敏性紫癜，妊娠皰疹，低丙種球蛋白血癥，特發(fā)性肺纖維化，特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，IgA腎病(IGAN)，berger綜合征，咽炎性腎小球腎炎，IgA天皰瘡，IgG4相關(guān)性硬化疾病，免疫調(diào)節(jié)不育，包涵體肌炎，胰島素依賴型糖尿病，間質(zhì)性膀胱炎，艾薩克綜合征，神經(jīng)性肌強(qiáng)直，幼年型關(guān)節(jié)炎，幼年型肌炎，川崎綜合征，蘭伯特伊頓綜合征，白細(xì)胞分裂性血管炎，扁平苔蘚，硬化萎縮性苔蘚，木質(zhì)性結(jié)膜炎，線性IgA皮膚病(LAD)，類天皰瘡，紅斑狼瘡(SLE)，萊姆病，梅尼埃病，顯微多血管炎(MPA)，混合性結(jié)締組織病(MCTD)，單克隆γ病變，蠶食性角膜潰瘍，Mucha-Habermann疾病，多發(fā)性硬化癥，重癥肌無(wú)力，肌炎，發(fā)作性睡病，視神經(jīng)脊髓炎(Devic病)，神經(jīng)性肌強(qiáng)直，艾薩克綜合征(獲得性，副腫瘤性，遺傳性)，中性粒細(xì)胞減少癥，眼瘢痕性類天皰瘡，視神經(jīng)炎，卵巢炎，視性眼陣攣-肌陣攣綜合征，睪丸炎，復(fù)發(fā)性風(fēng)濕病，pandas(與鏈球菌相關(guān)的兒科自身免疫性神經(jīng)精神障礙)，副腫瘤性自身免疫多器官綜合征(PAMS)，副腫瘤性小腦變性，副腫瘤性天皰瘡(PNP)，陣發(fā)性夜間血紅蛋白尿(PNH)，帕里龍貝格綜合征，Parsonnage-Turner綜合征，parsplanitis(周?chē)咸涯ぱ?，妊娠性類天皰瘡(PG)，尋常型天皰瘡(PV)，葉狀皰疹(PF)，周?chē)窠?jīng)病，靜脈周?chē)X脊髓炎，惡性貧血，Poems綜合征，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎(PAN)，風(fēng)濕性多肌痛，多發(fā)性肌炎，心肌梗塞后綜合征，心包切開(kāi)術(shù)后綜合征，孕激素皮炎原發(fā)性膽汁性肝硬化，漢諾氏綜合征，原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)，硬化性膽管炎，銀屑病，銀屑病關(guān)節(jié)炎，壞疽性膿皮病，純紅細(xì)胞再生障礙，拉斯馬森腦炎，慢性局灶性腦炎(CFE)，雷諾現(xiàn)象，反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，萊特爾綜合征，康復(fù)相關(guān)性視網(wǎng)膜病(RAR)，反射性交感神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不良，萊特爾綜合征，復(fù)發(fā)性多軟骨炎，不寧腿綜合征，腹膜后纖維化，風(fēng)濕熱，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)節(jié)病，施密特綜合征，鞏膜炎，硬皮病，系統(tǒng)性硬化病，舍格倫綜合征，精子&睪丸自身免疫，僵人綜合征，亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎(SBE)，Susac綜合征，交感性眼炎，大動(dòng)脈炎，顳動(dòng)脈炎/巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，血栓閉塞性脈管炎，伯格氏病，血小板減少性紫癜(TTP)，托洛薩-亨特綜合征，橫貫性脊髓炎，潰瘍性結(jié)腸炎，未分化結(jié)締組織病(UCTD)，葡萄膜炎，風(fēng)濕性多肌痛，大動(dòng)脈炎，顳動(dòng)脈炎，伯格氏病，皮膚血管炎，川崎病，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，白塞氏綜合征，變應(yīng)性肉芽腫性血管炎，皮膚血管炎，過(guò)敏性紫癜，顯微多血管炎，韋氏肉芽腫病，高爾夫球性血管炎，水泡性皮膚病，Vitiligowegener肉芽腫病(現(xiàn)在稱為具有多發(fā)性血管炎的肉芽腫病(GPA))。在一個(gè)實(shí)施方案中，自身免疫性疾病選自包含以下的組或由以下組成的組：ANCA血管炎，IgA腎病(Berger's)，尋常型天皰瘡/大皰性類天皰瘡，ITP，原發(fā)性膽汁性肝硬化，自身免疫性甲狀腺炎(格雷夫斯病)，橋本氏病，狼瘡性腎炎，膜性腎小球腎炎(或膜性腎病)，APS，重癥肌無(wú)力，視神經(jīng)脊髓炎，原發(fā)性舍格倫綜合征，自身免疫性中性粒細(xì)胞減少癥，自身免疫性胰腺炎，皮膚肌炎，自身免疫性葡萄膜炎，自身免疫性視網(wǎng)膜病，白塞氏病，IPF，系統(tǒng)性硬化病，肝纖維化，自身免疫性肝炎，原發(fā)性硬化性膽管炎，白癜風(fēng)，肺出血-腎炎綜合征，肺泡蛋白沉著癥，慢性自身免疫性蕁麻疹，銀屑病，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，軸向脊椎關(guān)節(jié)炎，移植術(shù)(包括GvHD)，哮喘，COPD，巨細(xì)胞動(dòng)脈炎，難治性自身免疫性血細(xì)胞減少癥，伊文思綜合征(自身免疫性溶血性疾病)，I型糖尿病，結(jié)節(jié)病，多發(fā)性肌炎，潰瘍性結(jié)腸炎，克羅恩病，乳糜瀉，原發(fā)性巨球蛋白血癥，局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥，慢性萊姆病(萊姆疏螺旋體病)，扁平苔蘚，僵人綜合征，擴(kuò)張型心肌病，自身免疫性(淋巴細(xì)胞性)卵巢炎，獲得性大皰性表皮松解癥，自身免疫性萎縮性胃炎，惡性貧血，特應(yīng)性皮炎，動(dòng)脈粥樣硬化，多發(fā)性硬化，拉斯馬森腦炎，吉蘭-巴雷綜合征，獲得性神經(jīng)性肌強(qiáng)直，中風(fēng)在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病癥是癌癥，例如白血病，例如淋巴細(xì)胞白血病，例如急性淋巴細(xì)胞白血病或慢性淋巴細(xì)胞白血病；或骨髓性白血病，諸如急性骨髓性白血病或慢性骨髓性白血病；或淋巴瘤，諸如彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤或霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。本發(fā)明還提供了包含本公開(kāi)的分子(諸如本文所述的多特異性分子)與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體組合的藥物或診斷組合物。因此，提供了本公開(kāi)的分子(諸如本文所述的多特異性分子)用于治療和制造藥物的用途。組合物通常作為通常包括藥學(xué)上可接受的載體的無(wú)菌藥物組合物的一部分提供。本發(fā)明的藥物組合物可另外包含藥學(xué)上可接受的佐劑。本發(fā)明還提供了制備藥物或診斷組合物的方法，包括將本發(fā)明的多特異性分子與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體一起加入和混合。本文所用的術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的賦形劑”是指藥學(xué)上可接受的制劑載體、溶液或添加劑，以增強(qiáng)本公開(kāi)的組合物的期望特征。賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的并且包括緩沖液(例如檸檬酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，乙酸鹽緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液)，氨基酸，尿素，醇，抗壞血酸，磷脂，蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白)，EDTA，氯化鈉，脂質(zhì)體，甘露醇，山梨醇和甘油。溶液或懸浮液可以包封在脂質(zhì)體或可生物降解的微球中。通常使用無(wú)菌制造方法以基本上無(wú)菌的形式提供制劑。這可包括通過(guò)過(guò)濾用于制劑的緩沖溶劑溶液，抗體在無(wú)菌緩沖溶劑溶液中的無(wú)菌懸浮液的生產(chǎn)和滅菌，以及通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法將制劑分配到無(wú)菌容器中。藥學(xué)上可接受的載體本身不應(yīng)誘導(dǎo)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的產(chǎn)生，并且不應(yīng)是有毒的。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子，諸如蛋白質(zhì)，多肽，脂質(zhì)體，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和無(wú)活性病毒顆粒?？梢允褂盟帉W(xué)上可接受的鹽，例如無(wú)機(jī)酸鹽，諸如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，磷酸鹽和硫酸鹽，或有機(jī)酸鹽，諸如乙酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽和苯甲酸鹽。治療組合物中的藥學(xué)上可接受的載體可另外含有液體，諸如水、鹽水、甘油和乙醇。這樣的載體使得藥物組合物能夠配制成片劑，丸劑，糖錠，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿液和懸浮液，以供患者攝取。本公開(kāi)的分子(諸如本文所述的多特異性分子)可以分散在溶劑中遞送，例如以溶液或懸浮液的形式。它可以懸浮在適當(dāng)?shù)纳砣芤褐?，例如生理鹽水，藥理學(xué)上可接受的溶劑或緩沖溶液中。本領(lǐng)域已知的緩沖溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二鈉，8.0mg至9.0mgNaCl，0.15mg至0.25mg聚山梨酯，0.25mg至0.30mg無(wú)水檸檬酸和0.45mg至0.55mg檸檬酸鈉，以達(dá)到約4.0至5.0的pH。如上所述，懸浮液可以例如由凍干抗體制備。藥學(xué)上可接受的載體的詳盡討論可在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany，N.J.1991)中獲得。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指治療、改善或預(yù)防靶向疾病或病況或顯示可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果所需的治療劑的量。對(duì)于任何抗體，可以在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或動(dòng)物模型中，通常在嚙齒動(dòng)物、兔、狗、豬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物中初始估計(jì)治療有效量。動(dòng)物模型也可用于確定施用的合適的濃度范圍和途徑。這樣的信息然后可以用于確定用于在人中施用的有用劑量和途徑。對(duì)于人受試者，精確的治療有效量將取決于疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、給藥的時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐受性/應(yīng)答。該量可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定并且在臨床醫(yī)生的判斷范圍內(nèi)。通常，治療有效量為0.01mg/kg至50mg/kg，諸如0.1mg/kg至20mg/kg?；蛘?，劑量可以是每天1至500mg，諸如每天10至100、200、300或400mg。藥物組合物可以方便地以含有預(yù)定量的本發(fā)明活性劑的單位劑量形式提供。組合物可以單獨(dú)地施用給患者，或者可以與其他藥劑、藥物或激素組合(例如同時(shí)、順序或分開(kāi))施用。施用本公開(kāi)的多特異性分子的劑量取決于待治療的病況的性質(zhì)、存在的炎癥的程度以及抗體分子是被預(yù)防性使用還是治療現(xiàn)有病況。劑量的頻率將取決于多特異性分子的半衰期和其作用的持續(xù)時(shí)間。如果多特異性分子具有短的半衰期(例如2至10小時(shí))，則可能有必要每天給予一個(gè)或多個(gè)劑量。或者，如果多特異性分子具有長(zhǎng)的半衰期(例如2至15天)，則可能僅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2個(gè)月一次給予劑量。在本公開(kāi)中，最終制劑的pH與多特異性分子的等電點(diǎn)值不相似，因?yàn)槿绻苿┑膒H為7，則8-9或更高的pI可能是合適的。盡管不希望受理論束縛，但據(jù)認(rèn)為這可能最終提供具有改善的穩(wěn)定性的最終制劑，例如抗體或片段保留在溶液中。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任何數(shù)目的途徑施用，包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，透皮，經(jīng)皮(例如參見(jiàn)WO98/20734)，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸內(nèi)，局部，舌下，陰道內(nèi)或直腸途徑。無(wú)痛皮下注射器也可以用于施用本發(fā)明的藥物組合物。組合物的直接遞送通常通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射，或遞送到組織的間隙空間來(lái)完成。組合物也可以施用到感興趣的特定組織中。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。當(dāng)產(chǎn)品用于注射或輸注時(shí)，其可以采取在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，多特異性分子可以是干燥形式，用于在使用前用合適的無(wú)菌液體重構(gòu)。如果組合物通過(guò)使用胃腸道的途徑施用，組合物將需要含有保護(hù)抗體免于降解但是一旦其從胃腸道被吸收就釋放雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的試劑。根據(jù)本公開(kāi)的可霧化制劑可以例如作為包裝在箔包封中的單劑量單位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每個(gè)小瓶含有一定體積、例如2ml的溶劑/溶液緩沖液的單位劑量。本文所用的術(shù)語(yǔ)“變體”是指與相應(yīng)的野生型肽或蛋白質(zhì)的氨基酸或核苷酸序列相比，含有至少一個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列改變的肽或蛋白質(zhì)。變體可以包含與相應(yīng)的野生型肽或蛋白質(zhì)至少80％、或85％、或90％、或95％、或98％或99％的序列同一性。然而，變體可以包含小于80％的序列同一性，條件是所述變體表現(xiàn)出與其相應(yīng)的野生型肽或蛋白質(zhì)基本相似的功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的構(gòu)建體是至少三特異性的。在這種情況下，進(jìn)一步的特異性可以針對(duì)任何目標(biāo)抗原，例如延長(zhǎng)半衰期的抗原，諸如白蛋白或Fc新生兒受體(FcRn)；用于效應(yīng)子功能(諸如激活或抑制Fc受體或共刺激分子)的抗原；組織或細(xì)胞靶向抗原；或幫助血液/腦屏障(BBB)轉(zhuǎn)移的抗原，諸如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體或LRP1。本公開(kāi)還擴(kuò)展至組合物，諸如包含具有特定抗原特異性的所述新形式的藥物組合物。在另一方面，本公開(kāi)包括所述形式和組合物在治療中的用途。本發(fā)明還提供了制備藥物或診斷組合物的方法，包括將本發(fā)明的抗體分子或多特異性分子與一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體一起添加并混合?？贵w分子或多特異性分子可以是藥物或診斷組合物中的唯一活性成分，或者可以伴有其它活性成分，包括其他抗體成分或非抗體成分諸如類固醇或其他藥物分子。藥物組合物適當(dāng)?shù)匕委熡行Я康谋景l(fā)明的抗體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指治療、改善或預(yù)防靶向疾病或病癥或顯示可檢測(cè)的治療或預(yù)防效果所需的治療劑的量。對(duì)于任何抗體，可以在細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定或動(dòng)物模型中，通常在嚙齒動(dòng)物、兔、狗、豬或靈長(zhǎng)類動(dòng)物中初始估計(jì)治療有效量。動(dòng)物模型也可用于確定施用的適當(dāng)?shù)臐舛确秶屯緩?。這樣的信息然后可以用于確定用于在人中施用的有用劑量和途徑。對(duì)于人受試者，精確的治療有效量將取決于疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性、受試者的一般健康狀況、受試者的年齡、體重和性別、飲食、施用的時(shí)間和頻率、藥物組合、反應(yīng)敏感性和對(duì)治療的耐受性/應(yīng)答。該量可以通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定并且在臨床醫(yī)生的判斷范圍內(nèi)。通常，治療有效量為0.01mg/kg至500mg/kg，例如0.1mg/kg至200mg/kg，諸如100mg/Kg。藥物組合物可以方便地以每劑含有預(yù)定量的本發(fā)明活性劑的單位劑量形式提供。組合物可以單獨(dú)地施用給患者，或者可以與其他藥劑、藥物或激素組合(例如同時(shí)、順序或分開(kāi))施用。本文所用的藥劑是指當(dāng)施用時(shí)具有生理作用的實(shí)體。本文所用的藥物是指在治療劑量下具有適當(dāng)?shù)纳碜饔玫幕瘜W(xué)實(shí)體。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的抗體或片段與免疫抑制劑治療(諸如類固醇，特別是潑尼松)一起使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的抗體或片段與利妥昔單抗或其它B細(xì)胞療法一起使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本公開(kāi)的抗體或片段與任何B細(xì)胞或T細(xì)胞調(diào)節(jié)劑或免疫調(diào)節(jié)劑一起使用。實(shí)例包括氨甲蝶呤、微苯酚鹽和硫唑嘌呤。施用本發(fā)明的抗體分子的劑量取決于待治療的病況的性質(zhì)、存在的炎癥的程度以及抗體分子是被預(yù)防性使用還是治療現(xiàn)有病況。劑量的頻率將取決于抗體分子的半衰期和其作用的持續(xù)時(shí)間。如果抗體分子具有短的半衰期(例如2至10小時(shí))，則可能有必要每天給予一個(gè)或多個(gè)劑量?；蛘撸绻贵w分子具有長(zhǎng)的半衰期(例如2至15天)和/或長(zhǎng)期的藥效學(xué)(PD)譜(profile)，則可能僅需要每天一次、每周一次或甚至每1或2個(gè)月一次給予劑量。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量每?jī)芍苓f送一次，即每月兩次。在一個(gè)實(shí)施方案中，劑量被間隔開(kāi)以允許在施用更遠(yuǎn)劑量之前waine抗藥物(在這種情況下是抗抗體)應(yīng)答。本文使用的半衰期意在指循環(huán)中分子的持續(xù)時(shí)間，例如在血清/血漿中。本文所用的藥效學(xué)是指根據(jù)本公開(kāi)的分子的生物作用的譜，特別是持續(xù)時(shí)間。藥學(xué)上可接受的載體本身不應(yīng)誘導(dǎo)對(duì)接受組合物的個(gè)體有害的抗體的產(chǎn)生，并且不應(yīng)是有毒的。合適的載體可以是大的、緩慢代謝的大分子，諸如蛋白質(zhì)，多肽，脂質(zhì)體，多糖，聚乳酸，聚乙醇酸，聚合氨基酸，氨基酸共聚物和無(wú)活性病毒顆粒?？梢允褂盟帉W(xué)上可接受的鹽，例如無(wú)機(jī)酸鹽，例如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，磷酸鹽和硫酸鹽，或有機(jī)酸鹽，諸如乙酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽和苯甲酸鹽。治療組合物中的藥學(xué)上可接受的載體可另外含有液體，諸如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，輔助物質(zhì)，諸如潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖物質(zhì)，可以存在于這樣的組合物中。這樣的載體使得藥物組合物能夠配制成片劑，丸劑，糖衣丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿液和懸浮液，以供患者攝取。適合的給藥形式包括適于腸胃外給藥的形式，通過(guò)注射或輸注，例如通過(guò)團(tuán)注或連續(xù)輸注。當(dāng)產(chǎn)品用于注射或輸注時(shí)，其可以采取在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳液的形式，并且其可以含有配制劑，諸如懸浮劑、防腐劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。或者，抗體分子可以是干燥形式，用于在使用前用合適的無(wú)菌液體重構(gòu)。一旦配制，本發(fā)明的組合物可以直接施用于受試者。待治療的受試者可以是動(dòng)物。然而，在一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案中，所述組合物適于施用于人類受試者。適當(dāng)?shù)?，在根?jù)本公開(kāi)的制劑中，最終制劑的pH不類似于抗體或片段的等電點(diǎn)的值，例如如果蛋白質(zhì)的pI在8-9或以上的范圍內(nèi)，則制劑pH為7可能是合適的。盡管不希望受理論束縛，但據(jù)認(rèn)為這可能最終提供具有改善的穩(wěn)定性的最終制劑，例如抗體或片段保留在溶液中。在一個(gè)實(shí)例中，pH在4.0至7.0范圍內(nèi)的藥物制劑包含：1至200mg/mL根據(jù)本公開(kāi)的抗體分子，1至100mM緩沖液，0.001至1％表面活性劑，a)10至500mM的穩(wěn)定劑，b)10至500mM的穩(wěn)定劑和5至500mM的張度劑，或c)5至500mM的張度劑。本發(fā)明的藥物組合物可以通過(guò)任何數(shù)目的途徑施用，包括但不限于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，髓內(nèi)，鞘內(nèi)，心室內(nèi)，透皮，經(jīng)皮(例如參見(jiàn)WO98/20734)，皮下，腹膜內(nèi)，鼻內(nèi)，腸內(nèi)，局部，舌下，陰道內(nèi)或直腸途徑。無(wú)痛皮下注射器也可以用于施用本發(fā)明的藥物組合物。通常，治療組合物可以制備為注射劑，作為液體溶液或懸浮液。也可以制備適于在注射前溶解或懸浮在液體載體中的固體形式。組合物的直接遞送通常通過(guò)皮下、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射，或遞送到組織的間隙空間來(lái)完成。組合物也可以施用到損傷中。劑量治療可以是單劑量方案或多劑量方案。應(yīng)當(dāng)理解，組合物中的活性成分將是抗體分子。因此，其將易于在胃腸道中降解。因此，如果組合物通過(guò)使用胃腸道的途徑施用，組合物將需要含有保護(hù)抗體免于降解但一旦其已經(jīng)從胃腸道吸收就釋放抗體的試劑。藥學(xué)上可接受的載體的詳盡討論可在Remington'sPharmaceuticalSciences(MackPublishingCompany，N.J.1991)中獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，制劑作為用于局部施用(包括吸入)的制劑提供。合適的可吸入制劑包括可吸入粉末、含推進(jìn)劑氣體的計(jì)量氣溶膠或不含推進(jìn)劑氣體的可吸入溶液。根據(jù)本發(fā)明的含有活性物質(zhì)的可吸入粉末可以僅由上述活性物質(zhì)或上述活性物質(zhì)與生理上可接受的賦形劑的混合物組成。這些可吸入粉末可以包括單糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖)，二糖(例如乳糖，蔗糖，麥芽糖)，寡糖和多糖(例如葡聚糖)，多元醇(例如山梨醇，甘露醇，木糖醇)，鹽(例如氯化鈉，碳酸鈣)或這些彼此的混合物。適合使用單糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特別是但不限于以其水合物的形式。用于在肺中沉積的顆粒需要小于10微米的顆粒尺寸，諸如1-9微米，例如1-5μm?；钚猿煞?諸如抗體或片段)的粒度是最重要的?？捎糜谥苽淇晌霘馊苣z的推進(jìn)氣體是本領(lǐng)域已知的。合適的推進(jìn)劑氣體選自烴諸如正丙烷、正丁烷或異丁烷和鹵代烴諸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、環(huán)丙烷或環(huán)丁烷的氯化和/或氟化衍生物。上述推進(jìn)氣體可以單獨(dú)使用或以其混合物使用。特別合適的推進(jìn)氣體是選自TG11、TG12、TG134a和TG227的鹵代烷烴衍生物。在上述鹵代烴中，TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特別合適的。含推進(jìn)劑氣體的可吸入氣溶膠還可含有其它成分，諸如助溶劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑(表面活性劑)、抗氧化劑、潤(rùn)滑劑和調(diào)節(jié)pH的工具。所有這些成分在本領(lǐng)域中是已知的。根據(jù)本發(fā)明的含推進(jìn)劑氣體的可吸入氣溶膠可含有至多5重量％的活性物質(zhì)。本發(fā)明的氣溶膠含有例如0.002至5重量％，0.01至3重量％，0.015至2重量％，0.1至2重量％，0.5至2重量％或0.5至1重量％重量的活性成分?；蛘?，對(duì)肺的局部給藥還可以是通過(guò)給予液體溶液或懸浮液制劑，例如使用裝置諸如噴霧器，例如連接到壓縮機(jī)的噴霧器(例如，連接到由PariRespiratoryEquipment，Inc.，Richmond，Va.制造的PariMaster(R)壓縮機(jī)的PariLC-JetPlus(R)霧化器)。本發(fā)明的抗體或多特異性分子可以分散在溶劑中遞送，例如以溶液或懸浮液的形式。其可以懸浮在合適的生理溶液中，例如鹽水或其它藥理學(xué)上可接受的溶劑或緩沖溶液中。本領(lǐng)域已知的緩沖溶液可以每1ml水含有0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二鈉，8.0mg至9.0mgNaCl，0.15mg至0.25mg聚山梨酯，0.25mg至0.30mg無(wú)水檸檬酸和0.45mg至0.55mg檸檬酸鈉，以達(dá)到約4.0至5.0的pH。懸浮液可以使用例如凍干抗體。治療性懸浮液或溶液制劑還可以含有一種或多種賦形劑。賦形劑是本領(lǐng)域眾所周知的，包括緩沖液(例如檸檬酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，乙酸鹽緩沖液和碳酸氫鹽緩沖液)，氨基酸，尿素，醇，抗壞血酸，磷脂，蛋白質(zhì)(例如血清白蛋白)，EDTA，氯化鈉，脂質(zhì)體，甘露醇，山梨醇和甘油。溶液或懸浮液可以包封在脂質(zhì)體或可生物降解的微球中。通常使用無(wú)菌制造方法以基本上無(wú)菌的形式提供制劑。這可包括通過(guò)過(guò)濾用于制劑的緩沖溶劑/溶液，抗體在無(wú)菌緩沖溶劑溶液中的無(wú)菌懸浮液的生產(chǎn)和滅菌，以及通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟悉的方法將制劑分配到無(wú)菌容器中。根據(jù)本公開(kāi)的可霧化制劑可以例如作為包裝在箔包封中的單劑量單位(例如，密封塑料容器或小瓶)提供。每個(gè)小瓶含有一定體積、例如2ml的溶劑/溶液緩沖液的單位劑量。本文公開(kāi)的抗體可適于通過(guò)霧化遞送。還設(shè)想本發(fā)明的抗體可以通過(guò)使用基因治療來(lái)施用。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，將在適當(dāng)?shù)腄NA成分控制下編碼抗體分子的重鏈和輕鏈的DNA序列引入患者，使得抗體鏈從DNA序列表達(dá)并原位組裝。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子，諸如本文所述的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物可用于功能改變目的抗原的活性。例如，雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物可以直接或間接中和、拮抗或激動(dòng)所述一種或多種抗原的活性。本公開(kāi)還擴(kuò)展至包含本公開(kāi)的分子或其成分的試劑盒。在一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒包含：a)包含與結(jié)合對(duì)(X)的第一結(jié)合伴侶附接的特異性針對(duì)CD22或CD79a和/或CD79b的第一抗體或抗體片段(A)的一個(gè)或多個(gè)融合蛋白(A-X)；和b)包含與結(jié)合對(duì)(Y)的第二結(jié)合伴侶附接的特異性針對(duì)CD22或CD79a和/或CD79b的第二抗體或抗體片段(B)的一種或多種融合蛋白(B-Y)，其中第二結(jié)合伴侶特異性針對(duì)第一結(jié)合伴侶；例如其中第一結(jié)合伴侶(X)是肽或多肽，并且第二結(jié)合伴侶(Y)是特異性針對(duì)其的抗體或抗體片段；其中所述第二結(jié)合伴侶Y特異性針對(duì)所述第一結(jié)合伴侶X，所述第二結(jié)合伴侶是例如特異性針對(duì)其的抗體或抗體片段；并且兩個(gè)結(jié)合伴侶的特異性相互作用(例如結(jié)合相互作用)形成異二聚體-系鏈，其將來(lái)自a)和b)的兩種融合蛋白物理地結(jié)合在一起以形成雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物；和其中A或B中的至少一個(gè)特異性針對(duì)CD22，另一個(gè)特異性針對(duì)CD79a和/或CD79b，和所述融合蛋白是復(fù)合的或非復(fù)合的形式。有利地，試劑盒可以包含本公開(kāi)的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，或可以包含復(fù)合或非復(fù)合形式的融合蛋白。在前一種情況下，雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物準(zhǔn)備好“開(kāi)箱即用”，這提供了方便和易于使用，而在后一種情況下，可以根據(jù)使用者的要求通過(guò)使用組合不同的融合蛋白來(lái)組裝雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含使用說(shuō)明書(shū)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，試劑盒還包含一種或多種用于進(jìn)行一種或多種功能測(cè)定的試劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供本公開(kāi)的分子，包括融合蛋白、雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物或包含其的組合物用作實(shí)驗(yàn)室試劑。其它方面在其它方面，提供了核苷酸序列，例如編碼如本文所述的構(gòu)建體的DNA序列，包括如上定義的多特異性分子或融合蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了核苷酸序列，例如編碼本文所述構(gòu)建體的DNA序列，包括根據(jù)本公開(kāi)的多特異性分子或雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物或抗體。本文的公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至包含如上定義的核苷酸序列的載體。本文所用的術(shù)語(yǔ)“載體”是指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸的核酸分子。載體的實(shí)例是“質(zhì)粒”，其是另外的DNA區(qū)段可以連接的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)。另一種類型的載體是病毒載體，其中額外的DNA區(qū)段可以連接到病毒基因組中。某些載體能夠在導(dǎo)入它們的宿主細(xì)胞(例如，具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和附加型哺乳動(dòng)物載體)中自主復(fù)制。其他載體(例如非附加型哺乳動(dòng)物載體)可以整合到宿主細(xì)胞的基因組中，其中它們隨后與宿主基因組一起復(fù)制。在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是載體最常用的形式?？梢詷?gòu)建載體的一般方法、轉(zhuǎn)染方法和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。在這方面，參考“CurrentProtocolsinMolecularBiology”，1999，F(xiàn).M.Ausubel(ed)，WileyInterscience，NewYork和ColdSpringHarborPublishing生產(chǎn)的ManiatisManual。本文使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記”是指其表達(dá)允許鑒定已經(jīng)用含有標(biāo)記基因的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的蛋白質(zhì)。多種選擇性標(biāo)記是本領(lǐng)域已知的。例如，通常選擇性標(biāo)記基因賦予載體已經(jīng)導(dǎo)入的宿主細(xì)胞對(duì)藥物諸如如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。選擇性標(biāo)記也可以是視覺(jué)上可識(shí)別的標(biāo)記，諸如熒光標(biāo)記。熒光標(biāo)記的實(shí)例包括羅丹明，F(xiàn)ITC，TRITC，AlexaFluors及其各種綴合物。還提供了包含一個(gè)或多個(gè)克隆或表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，所述載體包含編碼本公開(kāi)的抗體的一個(gè)或多個(gè)DNA序列。任何合適的宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)可以用于表達(dá)編碼本公開(kāi)的抗體分子的DNA序列。可以使用細(xì)菌、例如大腸桿菌和其他微生物系統(tǒng)，或者也可以使用真核生物的、例如哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。合適的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括CHO、骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞。本公開(kāi)內(nèi)容還提供了用于生產(chǎn)根據(jù)本公開(kāi)的分子或其成分的方法，其包括在適于導(dǎo)致從編碼本公開(kāi)的分子的DNA表達(dá)蛋白的條件下培養(yǎng)含有本公開(kāi)的載體的宿主細(xì)胞，并分離該分子。包括本文所述的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物的本公開(kāi)的分子可用于診斷/檢測(cè)試劑盒。試劑盒可以例如包含對(duì)兩種抗原特異的雙特異性抗體復(fù)合物，兩種抗原均存在于相同的細(xì)胞類型上，并且其中只有在成功檢測(cè)到兩種抗原時(shí)才可進(jìn)行陽(yáng)性診斷。通過(guò)使用本公開(kāi)的分子諸如本文所述的雙特異性抗體復(fù)合物而不是非復(fù)合形式的兩種分開(kāi)的抗體或抗體片段，可以極大地增強(qiáng)檢測(cè)的特異性。在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分子諸如雙特異性抗體復(fù)合物固定在固體表面上。固體表面可以例如是芯片或ELISA板。還提供了根據(jù)本發(fā)明的分子、例如本文所述的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物用于在樣品中檢測(cè)第一和第二肽的存在的用途，其中所述分子用作檢測(cè)劑。本公開(kāi)的分子諸如本文所述的雙特異性抗體復(fù)合物可以例如與熒光標(biāo)記偶聯(lián)，所述熒光標(biāo)記有助于檢測(cè)結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物。這種雙特異性抗體復(fù)合物可用于免疫熒光顯微鏡術(shù)?；蛘?，雙特異性抗體復(fù)合物也可用于蛋白質(zhì)印跡或ELISA。在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于純化根據(jù)本公開(kāi)的分子或其成分的方法在一個(gè)實(shí)施方案中，提供了用于純化根據(jù)本公開(kāi)的分子或其成分的方法，其包括以下步驟：以非結(jié)合模式進(jìn)行陰離子交換層析，使得雜質(zhì)保留在柱上，并且抗體保持在未結(jié)合中。該步驟可以例如在約6-8的pH下進(jìn)行。該方法可以進(jìn)一步包括使用陽(yáng)離子交換層析的初始捕獲步驟，例如在約4至5的pH下進(jìn)行。該方法可以進(jìn)一步包括另外的層析步驟，以確保產(chǎn)物和方法相關(guān)的雜質(zhì)從產(chǎn)物流中適當(dāng)?shù)胤蛛x。純化方法還可以包括一個(gè)或多個(gè)超濾步驟，諸如濃縮和滲濾步驟。如上所用的“純化形式”意指至少90％的純度，例如91、92、93、94、95、96、97、98、99％w/w或更純。下文提供了本公開(kāi)的序列。序列GCN4(7P14P)序列ASGGGRMKQLEPKVEELLPKNYHLENEVARLKKLVGERHHHHHHSEQIDNO:1其中粗體形式的氨基酸是任選的GCTAGCGGAGGCGGAAGAATGAAACAACTTGAACCCAAGGTTGAAGAATTGCTTCCGAAAAATTATCACTTGGAAAATGAGGTTGCCAGATTAAAGAAATTAGTTGGCGAACGCCATCACCATCACCATCACSEQIDNO:252SR4dsscFv序列DAVVTQESALTSSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYASWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCVLWYSDHWVFGCGTKLTVLGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDVQLQQSGPGLVAPSQSLSITCTVSGFLLTDYGVNWVRQSPGKCLEWLGVIWGDGITDYNSALKSRLSVTKDNSKSQVFLKMNSLQSGDSARYYCVTGLFDYWGQGTTLTVSSAAAHHHHHHEQKLISEEDL—SEQIDNO:3GATGCGGTGGTGACCCAGGAAAGCGCGCTGACCAGCAGCCCGGGCGAAACCGTGACCCTGACCTGCCGCAGCAGCACCGGCGCGGTGACCACCAGCAACTATGCGAGCTGGGTGCAGGAAAAACCGGATCATCTGTTTACCGGCCTGATTGGCGGCACCAACAACCGCGCGCCGGGCGTGCCGGCGCGCTTTAGCGGCAGCCTGATTGGCGATAAAGCGGCGCTGACCATTACCGGCGCGCAGACCGAAGATGAAGCGATTTATTTTTGCGTGCTGTGGTATAGCGACCATTGGGTGTTTGGCTGCGGCACCAAACTGACCGTGCTGGGTGGAGGCGGTGGCTCAGGCGGAGGTGGCTCAGGCGGTGGCGGGTCTGGCGGCGGCGGCAGCGATGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGCCCGGGCCTGGTGGCGCCGAGCCAGAGCCTGAGCATTACCTGCACCGTGAGCGGCTTTCTCCTGACCGATTATGGCGTGAACTGGGTGCGCCAGAGCCCGGGCAAATGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATTTGGGGCGATGGCATTACCGATTATAACAGCGCGCTGAAAAGCCGCCTGAGCGTGACCAAAGATAACAGCAAAAGCCAGGTGTTTCTGAAAATGAACAGCCTGCAGAGCGGCGATAGCGCGCGCTATTATTGCGTGACCGGCCTGTTTGATTATTGGGGCCAGGGCACCACCCTGACCGTGAGCAGCGCGGCCGCCCATCACCATCACCATCACGAACAGAAACTGATTAGCGAAGAAGATCTGTAATAGSEQIDNO:4CD79b抗體Ab4447兔Ab4447VL區(qū)SEQIDNO:71兔Ab4447VL區(qū)SEQIDNO:72兔Ab4447VH區(qū)SEQIDNO:73兔Ab4447VH區(qū)SEQIDNO:74本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：77的衍生物，其中一個(gè)或兩個(gè)半胱氨酸殘基被另一個(gè)氨基酸取代，例如絲氨酸，特別是其中第一個(gè)半胱氨酸被絲氨酸取代，而第二個(gè)半胱氨酸保持不變，或第一個(gè)半胱氨酸保持不變，而第二半胱氨酸被絲氨酸取代，或其中兩個(gè)半胱氨酸被絲氨酸取代。Ab4450兔Ab4450VL區(qū)SEQIDNO:81兔Ab4450VL區(qū)SEQIDNO:82兔Ab4450VH區(qū)SEQIDNO:83兔Ab4450VH區(qū)SEQIDNO:84本公開(kāi)還擴(kuò)展至SEQIDNO：87的衍生物，其中基序DG中的至少一個(gè)氨基酸被另一個(gè)氨基酸取代，例如基序突變?yōu)镋G、DA或DS。CD22抗體Ab4120兔Ab4120VL區(qū)SEQIDNO:91兔Ab4120VL區(qū)SEQIDNO:92兔Ab4120VH區(qū)SEQIDNO:93兔Ab4120VH區(qū)SEQIDNO:94本公開(kāi)還擴(kuò)展至SEQIDNO：98的衍生物，其中半胱氨酸殘基被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。本公開(kāi)還擴(kuò)展至SEQIDNO：99的衍生物，其中半胱氨酸殘基被另一種氨基酸、例如絲氨酸取代。Ab4126兔Ab4126VL區(qū)SEQIDNO:101兔Ab4126VL區(qū)SEQIDNO:102兔Ab4126VH區(qū)SEQIDNO:103兔Ab4126VH區(qū)SEQIDNO:104本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：108的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：109的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：110的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。Ab4127兔Ab4127VL區(qū)SEQIDNO:111兔Ab4127VL區(qū)SEQIDNO:112兔Ab4127VH區(qū)SEQIDNO:113兔Ab4127VH區(qū)SEQIDNO:114本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：117的衍生物，其中獨(dú)立地進(jìn)行以下突變，例如DS是修飾的EA、DA或DT，并且DG被修飾為EG、DA或DS。在一個(gè)實(shí)施方案中，DS：DG序列是DS，EG；DS，DA；DS，DS；EA，DG；EA，EG；EA，DA；EA，DS；DA，DG；DA，EG；DA，DA；DA，DS；DT，DG；DT，EG；DT，DA；和DT，DS。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：118的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：119的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。Ab4128兔Ab4128VL區(qū)SEQIDNO:121兔Ab4128VL區(qū)SEQIDNO:122兔Ab4128VH區(qū)SEQIDNO:123兔Ab4128VH區(qū)SEQIDNO:124本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：128的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：129的衍生物，其中半胱氨酸被另一個(gè)氨基酸、例如絲氨酸取代。Ab4130兔Ab4130VL區(qū)SEQIDNO:131兔Ab4130VL區(qū)SEQIDNO:132兔Ab4130VH區(qū)SEQIDNO:133兔Ab4130VH區(qū)SEQIDNO:134本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：139的衍生物，其中半胱氨酸被另一種氨基酸、諸如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：139的衍生物，其中基序NS修飾為例如NA或NT。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：140的衍生物，其中基序NS修飾為例如NA或NT。Ab4132兔Ab4132VL區(qū)SEQIDNO:141兔Ab4132VL區(qū)SEQIDNO:142兔Ab4132VH區(qū)SEQIDNO:143兔Ab4132VH區(qū)SEQIDNO:144本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：148的衍生物，其中半胱氨酸被另一種氨基酸、諸如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：149的衍生物，其中半胱氨酸被另一種氨基酸、諸如絲氨酸取代。本公開(kāi)內(nèi)容還擴(kuò)展至SEQIDNO：149的衍生物，其中基序NS修飾為例如NA或NT。血清白蛋白結(jié)合抗體抗白蛋白抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(無(wú)ds)SEQIDNO：157抗白蛋白抗體的重鏈可變結(jié)構(gòu)域(ds)SEQIDNO：158抗白蛋白抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(無(wú)ds)SEQIDNO：159抗白蛋白抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域(ds)SEQIDNO：160人CD22SEQIDNO:161人CD79aSEQIDNO:162人CD79bSEQIDNO:163在本說(shuō)明書(shū)的上下文中，“包含”被解釋為“包括”。包括某些元件的本公開(kāi)的方面也旨在擴(kuò)展到相關(guān)元件的“由......組成”或“基本上由......組成”的替代實(shí)施方案。在此可以采用積極引述的實(shí)施方案作為免責(zé)聲明的基礎(chǔ)。本文引用的所有參考文獻(xiàn)通過(guò)引用具體并入。參考文獻(xiàn)1.Ribosomedisplayefficientlyselectsandevolveshigh-affinityantibodiesinvitrofromimmunelibraries.HanesJ,JermutusL,Weber-BornhauserS,BosshardHR,PlückthunA.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95,14130-141352.DirectedinVitroEvolutionandCrystallographicAnalysisofaPeptide-bindingSingleChainAntibodyFragment(scFv)withLowPicomolarAffinity.ZhandC,SpinelliS,LuginbuhlB,AmstutzP,CambillauC,PluckthunA.(2004)J.Biol.Chem.279,18870-188773.Antigenrecognitionbyconformationalselection.BergerC,Weber-BornhauserS,EggenbergerY,HanesJ,PluckthunA,BosshardH.R.(1999)F.E.B.S.Letters450,149-153實(shí)施例實(shí)施例中所用的術(shù)語(yǔ)Fab-Kd-Fab描述了具有式A-X:Y-B的雙特異性蛋白質(zhì)復(fù)合物，其中：A-X是第一融合蛋白；Y-B是第二融合蛋白；X:Y是異二聚體系鏈；A包含特異性針對(duì)抗原(諸如CD22或CD79)的Fab片段；B包含特異性針對(duì)抗原(諸如CD22或CD79)的Fab片段；X是結(jié)合對(duì)的第一結(jié)合伴侶，諸如scFv；Y是結(jié)合對(duì)的第二結(jié)合伴侶，諸如肽；和:是X和Y之間的相互作用(諸如結(jié)合相互作用)。實(shí)施例1-產(chǎn)生Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-B(Fab-肽[B-Y)用于功能測(cè)定克隆策略通過(guò)PCR或基因合成產(chǎn)生側(cè)接限制性酶切位點(diǎn)DNA序列的抗體可變區(qū)DNA。這些位點(diǎn)是用于可變重鏈的HindIII和XhoI以及用于可變輕鏈的HindIII和BsiWI。這使得重鏈可變區(qū)適于連接到兩個(gè)重鏈載體(與FabB-Y連接的pNAFH和與FabA-Xds[二硫鍵穩(wěn)定的]連接的pNAFH)，因?yàn)樗鼈兙哂谢パa(bǔ)的限制性位點(diǎn)。這將可變區(qū)上游(或5')與鼠恒定區(qū)和肽Y(GCN4)或scFvX(52SR4)連接，產(chǎn)生整個(gè)閱讀框。將輕鏈克隆到標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)部鼠類恒定κ載體(pMmCK或pMmCKS171C)中，其再次使用相同的互補(bǔ)的限制性位點(diǎn)。如果可變區(qū)分離自兔，則使用pMmCKS171C載體。通過(guò)使用位于整個(gè)開(kāi)放閱讀框側(cè)翼的引物進(jìn)行測(cè)序來(lái)確認(rèn)克隆事件。培養(yǎng)CHO-S將懸浮CHOS細(xì)胞預(yù)先適應(yīng)于補(bǔ)充有2mM(100x)glutamx的CDCHO培養(yǎng)基(Invitrogen)。在搖床培養(yǎng)箱(KunerAG，Birsfelden，Switzerland)上以140rpm搖動(dòng)將細(xì)胞維持在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并在補(bǔ)充有8％CO2的37℃下培養(yǎng)。電穿孔轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前，使用CEDEX細(xì)胞計(jì)數(shù)器(InnovatisAG，Bielefeld，Germany)測(cè)定細(xì)胞數(shù)和存活率，將所需量的細(xì)胞(2x108個(gè)細(xì)胞/ml)轉(zhuǎn)移到離心錐形管中，并以1400rpm旋轉(zhuǎn)10分鐘。將沉淀的細(xì)胞重懸于無(wú)菌Earls平衡鹽溶液中，并以1400rpm再旋轉(zhuǎn)10分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸浮至所需的細(xì)胞密度。載體DNA的最終濃度為400ug用于2x108細(xì)胞/ml的混合物并將800μl用移液管移至比色杯(Biorad)中并使用內(nèi)部電穿孔系統(tǒng)電穿孔。將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞直接轉(zhuǎn)移到含有富含2mMglutamx和抗生素抗有絲分裂(100X)溶液(1比500)的ProCHO5培養(yǎng)基的1X3L錐形瓶中。將細(xì)胞在設(shè)定為37℃，5％CO2和140rpm搖動(dòng)的Kuhner搖床培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)加入進(jìn)料補(bǔ)充劑2g/LASF(AJINOMOTO)，溫度降至37℃進(jìn)一步培養(yǎng)13天。在第4天，向培養(yǎng)物中加入3mM的丙酮酸鈉(n-BUTRICACID鈉鹽，SigmaB-5887)。在第14天，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到管中，并在4000rpm離心30分鐘后從細(xì)胞中分離上清液。將保留的上清液進(jìn)一步通過(guò)0.22μmSARTOBRANPMillipore，隨后通過(guò)0.22μmγ金過(guò)濾器過(guò)濾。通過(guò)蛋白G-HPLC測(cè)定最終表達(dá)水平。大規(guī)模(1.0L)純化通過(guò)使用AKTAXpress系統(tǒng)和HisTrapExcel預(yù)包裝的鎳柱(GEHealthcare)的親和捕獲來(lái)純化Fab-A和Fab-B。將培養(yǎng)物上清液0.22μm無(wú)菌過(guò)濾，并且如果需要，在加載到柱上之前用弱酸或堿將pH調(diào)節(jié)至中性。使用含有15-25mM咪唑的二次洗滌步驟從鎳樹(shù)脂中置換任何弱結(jié)合的宿主細(xì)胞蛋白/非特異性His結(jié)合物。用10mM磷酸鈉，pH7.4+1MNaCl+250mM咪唑進(jìn)行洗脫，收集2ml級(jí)分。將一個(gè)柱體積加入洗脫液中，將體系暫停10分鐘以收緊洗脫峰，并因此降低總洗脫體積。合并最干凈的級(jí)分并將緩沖液交換到PBS(Sigma)，pH7.4中并且0.22μm過(guò)濾。通過(guò)A280Scan，SE-HPLC(G3000方法)、SDS-PAGE(還原和非還原)和使用PTSEndosafe系統(tǒng)(針對(duì)內(nèi)毒素)測(cè)定最終匯集物。實(shí)施例2-使用異二聚體系鏈雙特異性蛋白復(fù)合體形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])來(lái)證實(shí)是CD79/CD22雙特異性而不是二價(jià)組合抑制Akt信號(hào)傳導(dǎo)將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在DMEM(LifeTechnologies)中洗滌并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀釋等摩爾(200nM)量的對(duì)于細(xì)胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特異性的Fab'-A(Fab-scFv)和Fab'-B(Fab-肽)產(chǎn)生雙特異性或二價(jià)抗體的網(wǎng)格。該網(wǎng)格如表4所示。表4：具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合的可能網(wǎng)格。其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)將Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后與2.5×105個(gè)PBMC在V底96孔板中混合。然后將PBMC加雙特異性或二價(jià)組合一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)8分鐘來(lái)激活B細(xì)胞。然后通過(guò)加入等體積的Cytofix緩沖液(BDBiosciences)停止信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。然后將板在室溫下放置15分鐘，然后以500g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量的上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗滌。然后將細(xì)胞在冰冷的PermBufferIII(BDBiosciences)中重懸浮30分鐘，然后在流式緩沖液中洗滌兩次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD20抗體(BDBiosciences)和熒光標(biāo)記的抗磷酸Akt抗體染色細(xì)胞，所述熒光標(biāo)記的抗磷酸Akt抗體識(shí)別蛋白質(zhì)上473位的修飾的絲氨酸殘基。然后將板重懸浮并在室溫下在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于25μl流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD20和Akt的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的Akt水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。CD22和CD79b的組合的相對(duì)效果顯示在表5中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。表5：具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制磷酸化Akt的相對(duì)效力的表。其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)該數(shù)據(jù)也以條形圖(圖1)的形式顯示：數(shù)據(jù)表示平均值，誤差條是95％置信區(qū)間。數(shù)據(jù)顯示，CD22與CD79b的組合可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中的磷酸化Akt表達(dá)。相比之下，CD22與CD22的組合表現(xiàn)出升高的磷酸Akt表達(dá)水平。實(shí)施例3-使用異二聚體系鏈雙特異性蛋白復(fù)合體形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])來(lái)證實(shí)是CD79/CD22雙特異性而不是二價(jià)組合抑制PLCγ2信號(hào)傳導(dǎo)。將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在DMEM(LifeTechnologies)中洗滌，并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀釋等摩爾(200nM)量的對(duì)于細(xì)胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特異性的Fab'-a(Fab-scFv[A-X])和Fab'-B(Fab-肽[B-Y])產(chǎn)生雙特異性或二價(jià)抗體的網(wǎng)格。該網(wǎng)格如表4所示。將Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后與2.5×105個(gè)PBMC在V底96孔板中混合。然后將PBMC加雙特異性或二價(jià)組合一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)8分鐘來(lái)激活B細(xì)胞。然后通過(guò)加入等體積的Cytofix緩沖液(BDBiosciences)停止信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。然后將板在室溫下放置15分鐘，然后以500g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量的上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在流式緩沖液中并再次洗滌。然后將細(xì)胞在冰冷的PermBufferIII(BDBiosciences)中重懸浮30分鐘，然后在流式緩沖液中洗滌兩次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD20抗體(BDBiosciences)和熒光標(biāo)記的抗磷酸PLCγ2抗體染色細(xì)胞，所述熒光標(biāo)記的抗磷酸PLCγ2抗體識(shí)別蛋白質(zhì)上759位的修飾的酪氨酸殘基。然后將板重懸浮并在室溫下在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于25μl流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD20和PLCγ2的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的PLCγ2水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。CD22和CD79b的組合的相對(duì)效果顯示在表6中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。表6：具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制磷酸化的PLCγ2的相對(duì)效力的表。其中X是scFv而Y是肽該數(shù)據(jù)還可以表示為條形圖(圖2)，數(shù)據(jù)表示平均值，誤差條為95％置信區(qū)間。數(shù)據(jù)顯示，CD22與CD79b和CD79b與CD79b的組合均可抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中的磷酸PLCγ2表達(dá)。相比之下，CD22與CD22的組合表現(xiàn)出升高的磷酸PLCγ2表達(dá)水平。實(shí)施例4-使用異二聚體系鏈雙特異性蛋白復(fù)合體形式的Fab’-A(Fab-scFv[A-X])和Fab’-b(Fab-肽[B-Y])來(lái)證實(shí)是CD79/CD22雙特異性組合抑制CD86表達(dá)。將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在DMEM(LifeTechnologies)中洗滌，并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀釋等摩爾(200nM)量的對(duì)于細(xì)胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特異性的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab'-Y(Fab-肽)產(chǎn)生雙特異性或二價(jià)抗體的網(wǎng)格。該網(wǎng)格如表4所示。將Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育90分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后與2.5×105個(gè)PBMC在V底96孔板中混合。然后將PBMC加雙特異性或二價(jià)組合一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)24小時(shí)來(lái)激活B細(xì)胞。此后，將板置于冰上，并在冰冷的流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗滌一次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD19抗體(BDBiosciences)和熒光標(biāo)記的抗CD86抗體染色細(xì)胞，并在冰上在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于25μl流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD19和CD86的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的CD86水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。CD22和CD79b的組合的相對(duì)效果顯示在表7中(↓＝抑制，↑＝刺激而)。表7：具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的抗體的雙特異性和二價(jià)組合抑制B細(xì)胞的CD86表達(dá)的相對(duì)效力的表。其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)該數(shù)據(jù)也以條形圖的形式顯示(圖3)，數(shù)據(jù)表示平均值，誤差條為95％置信區(qū)間。數(shù)據(jù)顯示，CD22與CD79b和CD79b與CD79b的組合都能抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞上的CD86表達(dá)。相比之下，CD22與CD22的組合表現(xiàn)出升高的CD86表達(dá)水平。實(shí)施例5-CD22和CD79b的抑制作用只有當(dāng)抗體以雙特異性取向排列時(shí)才能再現(xiàn)將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在DMEM(LifeTechnologies)中洗滌，并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀釋等摩爾(200nM)量的對(duì)于細(xì)胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特異性的Fab'-X(Fab-scFv)和/或Fab'-Y(Fab-肽)產(chǎn)生雙特異性、二價(jià)或抗體混合物的組合。這些組合顯示在表8中。然后，對(duì)于滴定曲線實(shí)驗(yàn)，將這些組合以1比2.5的稀釋度逐步稀釋8次，以產(chǎn)生用于該組合的劑量滴定。表8：對(duì)CD22和CD79b具有特異性的雙特異性、二價(jià)或混合物的網(wǎng)格。其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)將Fab'A-X和/或Fab'B-Y一起孵育90分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后與2.5×105個(gè)PBMC在V底96孔板中混合。然后將PBMC加上Fab'A-X和/或Fab'B-Y組合一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)8分鐘來(lái)激活B細(xì)胞。然后通過(guò)加入等體積的Cytofix緩沖液(BDBiosciences)停止信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。然后將板在室溫下放置15分鐘，然后以500g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量的上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中并再次洗滌。然后將細(xì)胞在冰冷的PermBufferIII(BDBiosciences)中重懸浮30分鐘，然后在流式緩沖液中洗滌兩次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD20抗體(BDBiosciences)、識(shí)別473位的修飾的絲氨酸殘基的抗磷酸Akt抗體和識(shí)別759位的修飾的酪氨酸殘基的抗磷酸PLCγ2抗體染色細(xì)胞。然后將板重懸浮并在室溫下在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于25μl流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD20、Akt和PLCγ2的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的Akt和PLCγ2水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。圖4和5顯示只有CD22和CD79b的雙特異性組合而不是CD22和CD79b抗體的混合物抑制磷酸化Akt和PLCγ2表達(dá)(數(shù)據(jù)表示平均值，誤差條是95％置信區(qū)間)。為了驗(yàn)證用CD22和CD79b的雙特異性組合觀察到的抑制，滴定該組合以及CD22和CD79b抗體的混合物，并測(cè)量B細(xì)胞中總細(xì)胞內(nèi)IkB(信號(hào)傳導(dǎo)讀出數(shù)據(jù))和CD86(24小時(shí)后的激活標(biāo)記)的抑制。從圖6中可以看出，如通過(guò)總IkB蛋白所測(cè)量的，CD22-X/CD79b-Y的組合而不是CD22-X/CD79b-X的組合能夠抑制抗IgM刺激后NF-κB信號(hào)激活。使用GraphpadPrism6使用4參數(shù)對(duì)數(shù)曲線擬合外推的IC50為7.5nM(數(shù)據(jù)表示平均值，誤差條是標(biāo)準(zhǔn)偏差)。另外，在24小時(shí)后，滴定CD22-X/CD79b-Y的組合而不是CD22-X/CD79b-X的組合能夠抑制抗IgM誘導(dǎo)的CD86在B細(xì)胞上的表達(dá)(參見(jiàn)圖7)。將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在DMEM(LifeTechnologies)中洗滌，并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％小牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM中稀釋等摩爾(500nM)量的Fab'-X(Fab-scFv)和Fab'-Y(Fab-肽)，產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞表面蛋白CD22和CD79b具有抗原特異性的雙特異性組合。然后將這些組合以1比2.5的稀釋度逐步稀釋8次，以產(chǎn)生用于該組合的劑量滴定。將Fab'-X和Fab'-Y一起孵育90分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后向V底96孔板中加入2.5×105個(gè)PBMC。然后將PBMC加入Fab'-X和Fab'-Y組合中并一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入200nM的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)激活B細(xì)胞24小時(shí)。為了能夠檢測(cè)細(xì)胞表面激活標(biāo)記物，將板置于冰上，在冰冷的流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)中洗滌一次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD19抗體(BDBiosciences)和熒光標(biāo)記的抗CD86抗體染色細(xì)胞，并在冰上在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于25ul流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD19和CD86的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的CD86水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。從圖7中可以看出，CD22-X/CD79b-Y的組合的滴定能夠在24小時(shí)后抑制抗IgM誘導(dǎo)的B細(xì)胞上CD86表達(dá)。使用GraphpadPrism6使用4參數(shù)對(duì)數(shù)曲線擬合外推的IC50為10.3nM(數(shù)據(jù)表示平均值，誤差棒為標(biāo)準(zhǔn)偏差)。實(shí)施例6-可用不同抗體V區(qū)再現(xiàn)CD22和CD79b雙特異性蛋白的抑制作用免疫：通過(guò)基因合成或商業(yè)來(lái)源獲得編碼所選抗原的DNA，并克隆到具有強(qiáng)組成型啟動(dòng)子的表達(dá)載體中。然后使用內(nèi)部電穿孔系統(tǒng)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染到Rab-9兔成纖維細(xì)胞(CRL-1414TM)中。二十四小時(shí)后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢查細(xì)胞的抗原表達(dá)，并在液氮中以等分試樣冷凍直至使用。通過(guò)在相同細(xì)胞上共表達(dá)或制備單一或多個(gè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的混合物，每只兔免疫多達(dá)6種抗原。用3劑量的細(xì)胞免疫兔?？贵w發(fā)現(xiàn)：使用與Zubler等人(1985)描述的方法類似的方法制備B細(xì)胞培養(yǎng)物。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自免疫兔的脾或PBMC衍生的B細(xì)胞以約2000-5000個(gè)細(xì)胞/孔的密度在具有200μl/孔R(shí)PMI1640培養(yǎng)基(GibcoBRL)的條形碼96孔組織培養(yǎng)板中在37℃下、在5％CO2氣氛中培養(yǎng)7天，所述RPMI1640培養(yǎng)基補(bǔ)充有10％FCS(PAAlaboratoriesltd)，2％HEPES(SigmaAldrich)，1％L-谷氨酰胺(GibcoBRL)，1％青霉素/鏈霉素溶液(GibcoBRL)，0.1％β-巰基乙醇(GibcoBRL)，3％激活的脾細(xì)胞培養(yǎng)物上清液和γ照射的突變體EL4鼠胸腺瘤細(xì)胞(5×104個(gè)/孔)。使用HEK293細(xì)胞并使用基于均勻熒光的結(jié)合測(cè)定來(lái)測(cè)定B細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中抗原特異性抗體的存在，所述HEK293細(xì)胞使用免疫兔用的抗原共轉(zhuǎn)染。篩選涉及使用MatrixPlatemate液體處理器將10ul來(lái)自條形碼96孔組織培養(yǎng)板的上清液轉(zhuǎn)移到含有用靶抗原轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞(約3000個(gè)細(xì)胞/孔)的條形碼384孔黑壁測(cè)定板中。用山羊抗兔IgGFcγ特異性Cy-5綴合物(Jackson)顯示結(jié)合。在AppliedBiosystems8200細(xì)胞檢測(cè)系統(tǒng)上讀板。初次篩選后，使用AvisoOnyx命中挑取機(jī)器人將陽(yáng)性上清液固定在96孔條形碼母板上，并將細(xì)胞培養(yǎng)板中的B細(xì)胞在-80℃冷凍。然后在基于均勻熒光的結(jié)合測(cè)定中，在分別用抗原轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和用重組蛋白作為抗原來(lái)源的SuperavidinTM珠(BangsLaboratories)上篩選母板。這是為了確定每個(gè)孔的抗原特異性。為了允許從感興趣的孔的選擇中回收抗體可變區(qū)基因，進(jìn)行解卷積步驟以使得能夠鑒定含有B細(xì)胞的異質(zhì)群體的給定孔中的抗原特異性B細(xì)胞。這是使用熒光聚焦方法(Clargo等人，2014.Mabs2014Jan1:6(1)143-159；EP1570267B1)實(shí)現(xiàn)的。簡(jiǎn)言之，將來(lái)自陽(yáng)性孔的分泌免疫球蛋白的B細(xì)胞與用靶抗原轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞或用生物素化的靶抗原包被的鏈霉抗生物素蛋白珠(NewEnglandBiolabs)和1:1200最終稀釋度的山羊抗兔Fcγ片段特異性FITC綴合物(Jackson)混合。在37℃下靜態(tài)孵育1小時(shí)后，由于圍繞B細(xì)胞的熒光暈的存在，可以鑒定抗原特異性B細(xì)胞。然后使用奧林巴斯顯微鏡鑒定的多個(gè)這些個(gè)體B細(xì)胞克隆用Eppendorf微操作器挑取并沉積到PCR管中。熒光聚焦方法也用于從直接來(lái)自免疫兔的骨髓的B細(xì)胞的異質(zhì)群體中鑒定抗原特異性B細(xì)胞。通過(guò)使用重鏈和輕鏈可變區(qū)特異性引物的逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR從單細(xì)胞中回收抗體可變區(qū)基因。進(jìn)行兩輪PCR、巢式二級(jí)PCR在3'和5'末端引入限制性位點(diǎn)，允許將可變區(qū)克隆到小鼠Fab-X和Fab-Y(VH)或小鼠κ(VL)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體中。將Fab-X和Fab-Y表達(dá)載體的重鏈和輕鏈構(gòu)建體使用Fectin293(LifeTechnologies)共轉(zhuǎn)染到HEK-293細(xì)胞中或使用Expifectamine(LifeTechnologies)Expi293細(xì)胞中，并在6孔組織中表達(dá)重組抗體培養(yǎng)板的體積為5ml。在5-7天表達(dá)后，收獲上清液。在對(duì)用抗原轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞和包被有重組蛋白或抗原轉(zhuǎn)染的HEK細(xì)胞的SuperavidinTM珠(BangsLaboratories)的基于均勻熒光的結(jié)合測(cè)定中測(cè)試上清液。這是為了確認(rèn)克隆的抗體的特異性。生產(chǎn)小規(guī)模FabA-X和FabB-Y(小規(guī)模(50mL)Expi293轉(zhuǎn)染)將Expi293細(xì)胞在Expi293TM表達(dá)培養(yǎng)基中常規(guī)地繼代培養(yǎng)至終濃度為0.5×106個(gè)活細(xì)胞/mL，并在軌道搖床培養(yǎng)箱(Multitron，InforsHT)中以120rpm，8％CO2和37℃培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染當(dāng)天，使用自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Vi-CELL，BeckmanCoulter)測(cè)量細(xì)胞活力和濃度。為了達(dá)到2.5×106個(gè)活細(xì)胞/mL的最終細(xì)胞濃度，將適當(dāng)體積的細(xì)胞懸浮液加入到無(wú)菌的250mL錐形瓶中，通過(guò)加入新鮮的、預(yù)熱的Expi293TM表達(dá)培養(yǎng)基來(lái)達(dá)到42.5mL的體積每50mL轉(zhuǎn)染。為了為每次轉(zhuǎn)染制備脂質(zhì)-DNA復(fù)合物，將總共50μg的重鏈和輕鏈質(zhì)粒DNA在I培養(yǎng)基(LifeTechnologies)中稀釋至總體積為2.5mL，并將135μL的ExpiFectamineTM293試劑(LifeTechnologies)在I培養(yǎng)基中稀釋至總體積為2.5mL。將所有稀釋液輕輕混合并在室溫下孵育不超過(guò)5分鐘，然后將每種DNA溶液加入各自稀釋的ExpiFectamineTM293試劑中，以獲得5mL的總體積。輕輕混合DNA-ExpiFectamineTM293試劑混合物，并在室溫下孵育20-30分鐘，以形成DNA-ExpiFectamineTM293試劑復(fù)合物。在DNA-ExpiFectamineTM293試劑復(fù)合物孵育完成后，將5mLDNA-ExpiFectamineTM293試劑復(fù)合物加入每個(gè)搖瓶中。將搖瓶在軌道搖床培養(yǎng)箱(Multitron，InforsHT)中以120rpm，8％CO2和37℃培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后約16-18小時(shí)，向每個(gè)搖瓶中加入250μL的ExpiFectamineTM293轉(zhuǎn)染增強(qiáng)子1(LifeTechnologies)和2.5mL的ExpiFectamineTM293轉(zhuǎn)染增強(qiáng)子2(LifeTechnologies)。轉(zhuǎn)染后7天收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到50mL旋轉(zhuǎn)管(Falcon)中并以4000rpm離心30分鐘，然后通過(guò)0.22μmStericup(MerckMillipore)無(wú)菌過(guò)濾。將澄清和無(wú)菌過(guò)濾的上清液儲(chǔ)存在4℃。通過(guò)蛋白G-HPLC測(cè)定最終表達(dá)水平。小規(guī)模(50ml)純化：使用小規(guī)?；谡婵盏募兓到y(tǒng)通過(guò)親和捕獲分別純化Fab-X和Fab-Y二者。簡(jiǎn)言之，將50ml培養(yǎng)物上清液0.22μm無(wú)菌過(guò)濾，然后加入500μLNiSepharose珠(GEHealthcare)。然后將上清液珠混合物翻滾約1小時(shí)，然后通過(guò)施加真空除去上清液。然后用洗滌液1(50mM磷酸鈉、1MNaCl，pH6.2)和洗滌液2(0.5MNaCl)洗滌珠。用50mM乙酸鈉，pH4.0+1MNaCl進(jìn)行洗脫。將洗脫的級(jí)分緩沖液交換到PBS(Sigma)，pH7.4中和0.22μm過(guò)濾。通過(guò)A280掃描，SE-UPLC(BEH200方法)、SDS-PAGE(還原和未還原)和使用PTSEndosafe系統(tǒng)(對(duì)于內(nèi)毒素)測(cè)定最終匯集物。將源自血小板血漿置換圓錐的人PBMC作為冷凍等分試樣存儲(chǔ)。在進(jìn)行測(cè)定之前，將細(xì)胞解凍，在RPMI1640(LifeTechnologies)中洗滌，并使其適應(yīng)37℃/5％CO2環(huán)境。在此期間，通過(guò)在含有10％胎牛血清、50單位/mL青霉素、50μg/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的RPMI1640中稀釋等摩爾(200nM)量的對(duì)細(xì)胞表面蛋白質(zhì)CD22和CD79b具有抗原特異性的Fab'-X(Fab-scFv)和/或Fab'-Y(Fab-肽)產(chǎn)生雙特異性、二價(jià)或抗體混合物的組合。3種不同的CD79bFab-Y和3種不同的CD22Fab-X的這些組合顯示在表9中。表9：具有針對(duì)CD22和CD79b的特異性的雙特異性蛋白的網(wǎng)格。其中X是scFv(52SR4)而Y是肽(GCN4)將Fab'A-X和Fab'B-Y一起孵育60分鐘(在37℃/5％CO2環(huán)境中)，然后與2.5×105個(gè)PBMC在V底96孔板中混合。然后將PBMC加上Fab'A-X和/或Fab'B-Y組合一起孵育另外90分鐘。此后，通過(guò)在37℃下加入12.5μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)10分鐘來(lái)激活B細(xì)胞。然后通過(guò)加入等體積的Cytofix緩沖液(BDBiosciences)停止信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。然后將板在室溫下放置15分鐘，然后以500g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量的上清液，將細(xì)胞沉淀重新懸浮在流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mMEDTA)中并再次洗滌。然后將細(xì)胞在冰冷的PermBufferIII(BDBiosciences)中重懸浮30分鐘，然后在流式緩沖液中洗滌兩次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD20抗體(BDBiosciences)和識(shí)別759位上修飾的酪氨酸殘基的抗磷酸PLCγ2抗體染色細(xì)胞。然后將平板重懸浮并在室溫下在黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于40μl流式緩沖液中。使用IntellicytHTFCTM流式細(xì)胞儀測(cè)量CD20和PLCγ2的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)B細(xì)胞被鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的PLCγ2水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為最大反應(yīng)(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。從圖8中可以看出，數(shù)據(jù)顯示使用所有不同的抗體V區(qū)的CD22與CD79b的組合可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中的磷酸化PLCγ2表達(dá)。實(shí)施例7：網(wǎng)格篩選大組異二聚體系鏈?zhǔn)`的蛋白質(zhì)復(fù)合物來(lái)鑒定新的雙特異性抗體靶簡(jiǎn)介：在較早實(shí)施例中雙特異性形式和篩選方法的成功驗(yàn)證之后，篩選擴(kuò)展到更大數(shù)量的抗原對(duì)。產(chǎn)生針對(duì)在B細(xì)胞上表達(dá)的23種不同抗原的一組抗體可變(V)區(qū)。使用Fab-Kd-Fab[即A-X:Y-B，其中A和B是Fab片段]形式，形成異二聚體系鏈?zhǔn)`的蛋白質(zhì)復(fù)合物的網(wǎng)格，代表315種不同抗原對(duì)組合中的每一種的多種V區(qū)組合。在高通量流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定中篩選這些組合調(diào)節(jié)BCR(B細(xì)胞受體)信號(hào)傳導(dǎo)的能力，以選擇用于用雙特異性抗體干預(yù)的新靶對(duì)。如實(shí)施例6中所述分離抗體。篩選測(cè)定使用設(shè)定為37℃的水浴將供體PBMC快速解凍，并小心地轉(zhuǎn)移到50mlFalcon管中。然后將它們?cè)跍y(cè)定培養(yǎng)基中逐滴稀釋至5ml，以使?jié)B透性休克最小化。然后將細(xì)胞小心稀釋至20ml，然后加入最終的培養(yǎng)基稀釋劑以使體積為50ml。然后將細(xì)胞以500g離心5分鐘，然后除去上清液并將細(xì)胞重懸于1ml培養(yǎng)基中。然后計(jì)數(shù)細(xì)胞并稀釋至1.66×106個(gè)細(xì)胞/ml，然后將每孔30μl分配到V-底TC板中，得到5.0×104個(gè)細(xì)胞/孔的最終測(cè)定濃度。然后將細(xì)胞板覆蓋存儲(chǔ)于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中，直到需要它們，給予它們至少1小時(shí)休息。將Fab-X和Fab-Y試劑在測(cè)定培養(yǎng)基中以最終測(cè)定濃度的5倍等摩爾比混合，并在37℃，5％CO2下孵育90分鐘。在96孔U形底聚丙烯板中制備樣品，并在孵育期間覆蓋。將10μl的5xFab-KD-Fab混合物加入到含有細(xì)胞的合適的測(cè)試孔中，并通過(guò)以1000rpm搖動(dòng)混合30秒，然后在37℃，5％CO2下孵育90分鐘。然后用10μl抗人IgM刺激細(xì)胞。刺激的最終測(cè)定濃度根據(jù)測(cè)定面板讀出數(shù)據(jù)而變化，以三種抗體混合物A、B和C(下文中詳述)以50μg/ml(混合物A&C)或25μg/ml(混合物B)的最終測(cè)定濃度刺激。然后將測(cè)定板在1000rpm下溫和混合30秒，然后在37℃，5％CO2孵育5分鐘(抗體混合物A和C)或2分鐘(抗體混合物B)。通過(guò)向所有孔中加入150μl冰冷的BDCytoFix來(lái)終止測(cè)定，并在室溫下孵育15分鐘。然后將固定的細(xì)胞以500g離心5分鐘以沉淀細(xì)胞，并使用BioTekELx405板洗滌器除去上清液。通過(guò)以2400rpm渦旋平板30秒來(lái)重懸沉淀。然后通過(guò)加入100μl冰冷的BD細(xì)胞透化緩沖液III在4℃下使細(xì)胞透化30分鐘。然后將細(xì)胞在100μlFACS緩沖液中洗滌，并在500g離心5分鐘。通過(guò)ELx405再次去除上清液，然后使用ELx405快速分配200μlFACS緩沖液以洗去任何殘余的透化緩沖液。再次將細(xì)胞以500g旋轉(zhuǎn)，通過(guò)倒置除去上清液。在前述旋轉(zhuǎn)步驟期間，在FACS緩沖液中制備抗體混合物并保持屏蔽光。然后通過(guò)渦旋(2400RPM，30秒)將細(xì)胞重懸浮，然后向所有孔中加入20μl抗體混合物，并將板在1000rpm下?lián)u動(dòng)30秒。然后將細(xì)胞在室溫下在黑暗中孵育60分鐘。然后將細(xì)胞在200μlFACS緩沖液中用500g旋轉(zhuǎn)洗滌兩次，并在每個(gè)步驟后除去上清液。最后，通過(guò)在2400rpm渦旋30秒來(lái)重懸細(xì)胞，然后加入最終20μlFACS緩沖液。然后在IntellicytHTFC/iQue儀器上讀板。FACS緩沖液＝PBS+1％BSA+0.05％NaN3+2mMEDTA抗體混合液A＝1:2CD20PerCp-Cy5.5(BDBiosciences)+1:5PLCγ2AF88+1:10AktAF647+1:50ERK1/2PE(稀釋于FACS緩沖液中)?？贵w混合液B＝1:2CD20PerCp-Cy5.5(BDBiosciences)+1:5SykPE+1:5BLNKAF647(稀釋于FACS緩沖液中)抗體混合液C＝1:5CD20PerCp-Cy5.5(Biolegend)+1:5PLCγ2AF488+1:10AktAF647+1:5SykPE(稀釋于FACS緩沖液中)試劑供應(yīng)商目錄號(hào)抗人IgMSouthernBiotech2022-14CytoFixBDBiosciences554655PermBufferIIIBDBiosciences558050抗Akt(pS473)AF647BDBiosciences561670抗SYK(pY348)PEBDBiosciences558529抗PLCγ2(pY759)AF488BDBiosciences558507抗BLNK(pY84)AF647BDBiosciences558443抗ERK1/2(pT202/pY204)PEBDBiosciences561991抗人CD20PerCp-Cy5.5BDBiosciences558021抗人CD20AF488BDBiosciences558056抗人CD20PerCp-Cy5.5Biolegend340508磷酸鹽緩沖液(PBS)FisherScientific10562765RPMI1640LifeTechnologies31870胎牛血清(FCS)LifeTechnologies16140GlutamaxLifeTechnologies35050青霉素/鏈霉素(P/S)LifeTechnologies15070EDTASigma03690疊氮化鈉(NaN3)SigmaS2002牛血清白蛋白(BSA)SigmaA1470用抗體混合物A和B或單獨(dú)的C篩選Fab-X+Fab-Y組合。所有篩選在來(lái)自2個(gè)不同血液供體的錐細(xì)胞上進(jìn)行。使用市售的軟件工具捕獲和評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)。將總共2500個(gè)Fab-X+Fab-Y組合篩選至315種不同的抗原組合。結(jié)果計(jì)算了每個(gè)Fab-Kd-Fab[即A-X:Y-B，其中A和B是Fab片段]組合對(duì)BCR信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)蛋白的磷酸化的誘導(dǎo)的抑制百分?jǐn)?shù)，在本實(shí)施例中尋找抑制B細(xì)胞功能的抗原的新組合，陽(yáng)性組合的標(biāo)準(zhǔn)被設(shè)定為V區(qū)的至少一個(gè)組合對(duì)至少兩種磷酸讀出數(shù)據(jù)的至少30％的抑制。根據(jù)該閾值，在315個(gè)檢查的組合中有11個(gè)新抗原對(duì)組合滿足所需標(biāo)準(zhǔn)。這代表3.5％的命中率，證明了篩選大量組合以找到具有所需活性的組合的重要性以及CD79b和CD22的組合的活性有多么的稀有。圖10-12顯示了抗原網(wǎng)格交叉特異性的數(shù)據(jù)。值分別為Syk、PLCγ2和AKT的磷酸化的抑制百分?jǐn)?shù)(激活則為負(fù)值)，并且代表所評(píng)估的多個(gè)V區(qū)組合的平均值。測(cè)試了315種不同的抗原組合，并且可以看出，不同抗體組合對(duì)BCR信號(hào)傳導(dǎo)的影響變化顯著，從強(qiáng)抑制例如Fab-X上的抗原2(CD79b)與Fab-Y上的抗原3(CD22)(對(duì)磷酸Syk的69.66％抑制)和Fab-Y上的抗原2(CD79b)與Fab-X上的抗原3(CD22)的組合(對(duì)磷酸Syk的52.32％抑制，示于圖11中)至激活例如X上的抗原6和Y上的抗原11(磷酸Syk的負(fù)的118.10％，圖11)。代表圖10-12中所示的平均％值的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)被針對(duì)Fab-X上的抗原2(CD79b)和Fab-Y上的抗原3(CD22)顯示于圖13中。在這種情況下，評(píng)估了不同抗體V區(qū)的23種不同組合。替代取向形式(即Fab-Y上的抗原2(CD79b)和Fab-X上的抗原3(CD22))的相同抗原組合被顯示于圖14中。在這種情況下，評(píng)估了不同抗體V區(qū)的9種不同組合。所有V區(qū)顯示抑制，但有利地該方法也可用于選擇最佳V區(qū)組合。實(shí)施例8：比較Fab-Kd-Fab篩選形式與分子連接的雙特異性BYbe形式的抗原CD79b加上抗原CD22共靶向活性。簡(jiǎn)介：為了檢查在Fab-Kd-Fab異二聚體系鏈?zhǔn)`的篩選復(fù)合物中鑒定的CD79b/CD22靶對(duì)活性可以在替代的治療性分子連接形式中轉(zhuǎn)化為類似的所需活性，抗原CD79b特異性(VR4447)和抗原CD22特異性(VR4130)以BYbe格式生成。該BYbe形式由作為二硫鍵穩(wěn)定的(ds)單鏈(sc)-Fv的抗抗原CD22V區(qū)(VR4130)經(jīng)由接頭SGGGGSGGGGS(SEQIDNO：17)與抗抗原CD79bFab(VR4447)的重鏈融合。方法:如下進(jìn)行用于功能篩選的BYbes的純化：如下純化功能篩選BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鏈的C末端解離(off)的scFv])形式。來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)expiHEK或CHO表達(dá)的澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行0.22μm無(wú)菌過(guò)濾。將過(guò)濾的上清液以2ml/min上樣到在PBSpH7.4(SigmaAldrichChemicals)中平衡的50mlGammabindPlusSepharoseXK26柱(GEHealthcare)上。上樣后，用PBSpH7.4洗滌柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl、pH2.7洗脫。洗脫后在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)，收集洗脫峰，然后用1/25體積的2MTris/HCl、pH8.5中和。使用具有10kDa(BYbes)截留分子量膜的AmiconUltra-15濃縮器并在水平轉(zhuǎn)頭中以4000xg離心來(lái)濃縮中和的樣品。將濃縮的樣品施加于在PBS，pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GEHealthcare)上。用等度梯度的PBS、pH7.4以1ml/min或2.6ml/min展開(kāi)(develop)。收集級(jí)分并通過(guò)在TSK凝膠G3000SWXL上的尺寸排阻色譜法分析；5μm，7.8×300mm柱，用等度梯度的0.2M磷酸鹽、pH7.0以1ml/min展開(kāi)，通過(guò)在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。合并選擇的單體級(jí)分，使用具有10kDa截留分子量膜的AmiconUltra-15濃縮器并在水平轉(zhuǎn)頭中以4000xg離心濃縮至>1mg/ml。測(cè)定最終樣品；通過(guò)A280掃描紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary50Bio)測(cè)量濃度；通過(guò)在TSK凝膠G3000SWXL上的尺寸排阻色譜測(cè)量單體％；5μm，7.8×300mm柱，用等濃度梯度的0.2M磷酸鹽，pH7.0以1ml/min展開(kāi)，通過(guò)在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)；通過(guò)在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝膠(Novex)上以50mA(每凝膠)進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE53分鐘；以及通過(guò)具有LimulusAmebocyteLysate(LAL)測(cè)試盒的CharlesRiver的便攜式測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量?jī)?nèi)毒素。功能測(cè)定激活標(biāo)志物測(cè)定：抗原CD79b特異性Fab'-Y和抗原CD22特異性Fab'-X以等摩爾濃度一起孵育60分鐘(在37℃和5％CO2環(huán)境中)。從100nM的起始摩爾濃度以1:4連續(xù)稀釋液滴定組合?？乖瑿D79b和CD22特異性BYbe也從100nM的起始摩爾濃度以1:4連續(xù)稀釋液滴定。在V-底96孔板中，將1.5×105個(gè)PBMC加入孔中，向其中加入滴定的Fab'-X和Fab'-Y組合或滴定的BYbe。將Fab'-X和Fab'-Y組合或BYbe與細(xì)胞一起孵育90分鐘。此后，通過(guò)在37℃和5％CO2下加入25μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)24小時(shí)來(lái)激活B細(xì)胞。向孔中加入100μL冰冷的FACS緩沖液(PBS+1％BSA+0.1％NaN3+2mMEDTA)中，將板密封并用濕冰覆蓋約15分鐘，然后在4℃下以500×g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量的上清液，并將板在2000rpm下?lián)u動(dòng)30秒。然后用熒光標(biāo)記的抗CD19、抗CD20和抗CD71、抗CD40和抗CD86抗體(BDBiosciences)的混合物將細(xì)胞染色。稍稍搖動(dòng)平板并在黑暗中于濕冰上孵育1小時(shí)。此后，將板洗滌兩次并重懸于20μlFACS緩沖液中。使用IntellicytScreener流式細(xì)胞儀測(cè)量CD19、CD20和CD71、CD40和CD86的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)將B細(xì)胞鑒定為不同于其他細(xì)胞群，并且計(jì)算每個(gè)孔的CD71、CD40和CD86水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于最大應(yīng)答(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。PhosFlow測(cè)定：抗原CD79b特異性Fab'-Y和抗原CD22特異性Fab'-X以等摩爾濃度一起孵育60分鐘(在37℃和5％CO2環(huán)境中)。從100nM的起始摩爾濃度以1:4連續(xù)稀釋液滴定組合。還從100nM的起始摩爾濃度以1:4連續(xù)稀釋滴定抗原CD79b和抗原CD22特異性BYbe。在V形底96孔板中，將5.0×104個(gè)PBMC添加至向其中添加了滴定的Fab'-X和Fab'-Y組合或滴定的BYbe的孔中。將Fab'-X和Fab'-Y組合或BYbe與細(xì)胞一起孵育另外的90分鐘。此后，通過(guò)在37℃和5％CO2下添加25μg/ml山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)持續(xù)15分鐘來(lái)激活B細(xì)胞。然后通過(guò)添加等體積的Cytofix緩沖液(BDBiosciences)來(lái)停止信號(hào)傳導(dǎo)反應(yīng)。然后將板在室溫下放置15分鐘，然后以500×g離心5分鐘。從細(xì)胞沉淀中棄去過(guò)量上清液，將其重懸于FACS緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mMEDTA)中并再次洗滌。然后將細(xì)胞在冰冷的Perm緩沖液III(BDBiosciences)中重懸30分鐘，然后在流式緩沖液中洗滌兩次。然后用熒光標(biāo)記的抗CD20抗體(BDBiosciences)和抗磷酸化的PLCγ2、抗磷酸化的Akt和抗磷酸化的p38抗體(BDBiosciences)將細(xì)胞染色。然后將板重懸并在室溫下于黑暗中孵育1小時(shí)。此后，將板再洗滌兩次并重懸于20μlFACS緩沖液中。使用Intellicyt流式細(xì)胞儀測(cè)量CD20和磷酸PLCγ2、磷酸Akt和磷酸p38的細(xì)胞表達(dá)。使用數(shù)據(jù)分析軟件包ForecytTM(Intellicyt)將B細(xì)胞鑒定為不同于其他細(xì)胞群體，并且計(jì)算每個(gè)孔的PLCγ2、Akt和p38水平的幾何平均值。然后將所有數(shù)據(jù)表示為相對(duì)于最大應(yīng)答(僅抗IgM)減去背景(僅細(xì)胞)的抑制百分?jǐn)?shù)。結(jié)果PhosFlow測(cè)定：圖15中的數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化的PLCγ2。圖16中的數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化的P38。圖17中的數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式的靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞中磷酸化的Akt。激活標(biāo)志物測(cè)定：如可從圖18看到的，數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞上CD71的表達(dá)。圖19中的數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞上CD40的表達(dá)。圖20中的數(shù)據(jù)顯示，以Fab-Kd-Fab或BYbe形式靶向抗原CD79b和抗原CD22可以抑制用抗IgM刺激的B細(xì)胞上CD86的表達(dá)。實(shí)施例9—比較分子連接的雙特異性Bybe形式的抗原CD79b加上抗原CD22與進(jìn)一步加上抗白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域以延長(zhǎng)體內(nèi)半壽期的共靶向活性。簡(jiǎn)介：為了檢查在Fab-Kd-Fab異二聚體系鏈?zhǔn)`的篩選復(fù)合體中鑒定的CD79b/CD22靶標(biāo)對(duì)的活性是否可以轉(zhuǎn)化成具有抗白蛋白靶向的體內(nèi)半壽期延長(zhǎng)的潛在治療性分子連接的形式的相似的所需活性，將抗白蛋白抗體片段經(jīng)具有序列SGGGGSGGGGS(SEQIDNO:17)的接頭與實(shí)施例8中所述的BYbe形式的抗原CD22Fab的輕鏈融合。在添加和不添加抗白蛋白片段(VR0645)的情況下以Bybe形式產(chǎn)生抗原CD79b特異性(VR4447)和抗原CD22特異性(VR4130和VR4126)。在本實(shí)驗(yàn)中使用的構(gòu)建體的描述。構(gòu)建體名稱Fab特異性重鏈scFv輕鏈scFvVR4447/VR4126BYbe抗原CD79b抗原CD22無(wú)VR4447/VR4126/VR645)BYbe/白蛋白抗原CD79b抗原CD22白蛋白VR4447/VR4130BYbe抗原CD79b抗原CD22無(wú)VR4447/VR4130/VR645)BYbe/白蛋白抗原CD79b抗原CD22白蛋白方法有/無(wú)抗白蛋白附加特異性的BYbe的純化:如下純化BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鏈的C末端解離的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重鏈和輕鏈的C末端解離的scFv])形式。將來(lái)自標(biāo)準(zhǔn)expiHEK或CHO表達(dá)的澄清的細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行0.22μm無(wú)菌過(guò)濾。以2ml/min將過(guò)濾的上清液上樣至于PBSpH7.4(SigmaAldrichChemicals)中平衡的50mlGammabindPlusSepharoseXK26柱(GEHealthcare)上。上樣后，用PBSpH7.4洗滌柱，然后用0.1M甘氨酸/HCl、pH2.7洗脫。洗脫后在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)，收集洗脫峰，然后用1/25體積的2MTris/HCl、pH8.5中和。使用具有10kDa或30kDa截留分子量膜的AmiconUltra-15濃縮器并在水平轉(zhuǎn)頭中以4000xg離心來(lái)濃縮中和的樣品。將濃縮的樣品施加于在PBS、pH7.4中平衡的XK16/60或XK26/60Superdex200柱(GEHealthcare)上。用等度梯度的PBS、pH7.4分別以1ml/min或2.6ml/min展開(kāi)柱子。收集級(jí)分并在TSKgelG3000SWXL上通過(guò)尺寸排阻層析法進(jìn)行分析；5μm、7.8X300mm柱子，用等度梯度的0.2M磷酸鹽、pH7.0以1ml/min展開(kāi)，通過(guò)在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)。合并選擇的單體級(jí)分，使用具有10kDa或30kDa截留分子量膜的AmiconUltra-15濃縮器并在水平轉(zhuǎn)頭中以4000xg離心來(lái)濃縮至>1mg/ml。測(cè)定最終樣品；通過(guò)A280掃描紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary50Bio)測(cè)量濃度；通過(guò)在TSKgelG3000SWXL上的尺寸排阻層析測(cè)量單體％；5μm、7.8x300mm柱子，用等度梯度的0.2M磷酸鹽、pH7.0以1ml/min展開(kāi)，通過(guò)在280nm處進(jìn)行吸光度檢測(cè)；通過(guò)在4-20％Tris-甘氨酸1.5mm凝膠(Novex)上以50mA(每凝膠)進(jìn)行還原和非還原SDS-PAGE53分鐘；以及通過(guò)具有LimulusAmebocyteLysate(LAL)測(cè)試盒的CharlesRiver’s便攜式測(cè)試系統(tǒng)測(cè)量?jī)?nèi)毒素。將100nM的每種構(gòu)建體純化的蛋白質(zhì)與來(lái)自5個(gè)分開(kāi)的供體的人PBMC在37℃/5％CO2下于RMPI1640培養(yǎng)基(加上10％胎牛血清和2mMGlutamax(R10培養(yǎng)基))中預(yù)孵育60分鐘。60分鐘后，用25ug/ml被設(shè)計(jì)來(lái)僅刺激B細(xì)胞的山羊抗IgM抗體刺激細(xì)胞。24小時(shí)后，將板置于冰上以停止任何進(jìn)一步的細(xì)胞激活，然后用冰冷的流式細(xì)胞術(shù)緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3)洗滌一次。除去所有上清液，并重懸細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞置于冰上，添加抗CD19、抗CD20、抗CD27、抗CD71和抗CD86抗體的混合物。將細(xì)胞孵育60分鐘，然后在流式細(xì)胞術(shù)緩沖液中洗滌兩次。使用iQUE高通量流式細(xì)胞儀產(chǎn)生抗CD27、抗CD71和CD86與CD19/CD20陽(yáng)性B細(xì)胞的結(jié)合的數(shù)據(jù)。使用Forecyt軟件產(chǎn)生直方圖并得到抗CD27、抗CD71和CD86抗體與B細(xì)胞的結(jié)合的幾何平均強(qiáng)度讀數(shù)。將該數(shù)據(jù)輸入至Excel中并為每個(gè)組合產(chǎn)生抑制百分?jǐn)?shù)的值。然后將數(shù)據(jù)輸入至GraphpadPrism中，并為每個(gè)組合產(chǎn)生盒和須圖表，其中平均值由“+”表示。圖21顯示由VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上CD27表達(dá)的抑制。在所測(cè)試的5個(gè)供體中，兩者均顯示出始終相似的抗IgM誘導(dǎo)的CD27的抑制水平。圖22顯示由VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上CD71表達(dá)的抑制。在5個(gè)供體當(dāng)中，兩者顯示出始終相似的抗IgM誘導(dǎo)的CD71的抑制水平。圖23顯示由VR4447/VR4126BYbe和VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上CD86表達(dá)的抑制。在5個(gè)供體當(dāng)中，兩者顯示出始終相似的抑制抗IgM誘導(dǎo)的CD86的水平。圖24顯示由VR4447/VR4130BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上的CD27表達(dá)的抑制。在所測(cè)試的5個(gè)供體中，兩者均顯示出始終相似的抗IgM誘導(dǎo)的CD27的抑制水平。圖25顯示由VR4447/VR4130BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上的CD71表達(dá)的抑制。在5個(gè)供體當(dāng)中，兩者顯示出始終相似的抗IgM誘導(dǎo)的CD71的抑制水平。圖26顯示由VR4447/VR4130BYbe和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白誘導(dǎo)的B細(xì)胞上CD86表達(dá)的抑制。在5個(gè)供體當(dāng)中，兩者顯示出始終相似的抑制抗IgM誘導(dǎo)的CD86的水平。實(shí)施例10—使用分子連接的雙特異性BYbe在進(jìn)一步加入抗白蛋白或者不加入抗白蛋白的情況下抗原CD79b加上抗原CD22對(duì)記憶B細(xì)胞功能的共靶向作用。簡(jiǎn)介：為了評(píng)估靶向CD79b/CD22是否對(duì)長(zhǎng)期培養(yǎng)中的B細(xì)胞具有功能效應(yīng)，測(cè)量了分離或在混合的PBMC培養(yǎng)物中培養(yǎng)的B細(xì)胞的IgG產(chǎn)生。記憶抗原破傷風(fēng)類毒素的特異性抗體的測(cè)量提供了記憶B細(xì)胞功能的讀出數(shù)據(jù)。在加入或不加入抗白蛋白片段(VR0645)的情況下以BYbe形式產(chǎn)生抗原CD79b特異性(VR4447)和抗原CD22特異性(VR4126、VR4127和VR4130)。將抗白蛋白抗體片段通過(guò)具有序列SGGGGSGGGGS(SEQIDNO：17)的接頭與如實(shí)施例8所述的BYbe形式的抗原CD22Fab的輕鏈融合。在本實(shí)驗(yàn)中使用的構(gòu)建體的描述。構(gòu)建體名稱Fab特異性重鏈scFv輕鏈scFvVR4447/VR4126BYbe抗原CD79b抗原CD22無(wú)VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白抗原CD79b抗原CD22白蛋白VR4447/VR4127BYbe抗原CD79b抗原CD22無(wú)VR4447/VR4130BYbe抗原CD79b抗原CD22無(wú)VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白抗原CD79b抗原CD22白蛋白方法有/無(wú)抗白蛋白附加特異性的BYbe的純化如實(shí)施例9所述純化BYbe(Fab-dsscFv[Fab重鏈的C末端解離的scFv])和具有抗白蛋白的BYbe(Fab-2xdsscFv[Fab重鏈和輕鏈的C末端解離的scFv])形式。B細(xì)胞的激活和破傷風(fēng)類毒素特異性IgG的測(cè)量用在含有10％胎牛血清和2mMGlutamax(R10培養(yǎng)基)的1640培養(yǎng)基中的500ng/mlCD40L，1μg/mlCpG和50ng/mlIL-21刺激來(lái)源于至多3個(gè)分開(kāi)的供體的人PBMC或純化B細(xì)胞6天。在第0天以100nM的終濃度加入純化蛋白的構(gòu)建體，并在測(cè)定期間保留在培養(yǎng)基中。6天后收集上清液，通過(guò)ELISA檢測(cè)破傷風(fēng)類毒素特異性IgG的量。簡(jiǎn)言之，將Maxisorp半孔ELISA板(Nunc)在4℃下用10ug/ml破傷風(fēng)類毒素的PBS溶液包被過(guò)夜。然后將平板在含有0.05％Tween20的5％牛奶的PBS溶液中封閉2小時(shí)。將上清液稀釋，然后加入在室溫下2小時(shí)。用PBS-0.05％Tween20洗滌平板，使用在5％牛奶-PBS-0.05％Tween20中稀釋至1ug/ml的過(guò)氧化物酶-山羊抗人IgG(H+L)檢測(cè)破傷風(fēng)結(jié)合的抗體。使用TMB底物溶液(KPL)顯影板，使用Synergy2微量酶標(biāo)儀(Biotek)測(cè)量450nM的吸光度。將數(shù)據(jù)導(dǎo)出到Excel中，并相對(duì)于沒(méi)有測(cè)試抗體培養(yǎng)的細(xì)胞計(jì)算抑制百分?jǐn)?shù)。然后將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Graphpad并繪制為條形圖。圖27顯示來(lái)自用VR4447/VR4126Bybe、VR4447/VR4127BYbe和VR4447/VR4130BYbe培養(yǎng)的PBMC的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。數(shù)據(jù)表示來(lái)自3個(gè)供體的合并數(shù)據(jù)。圖28顯示來(lái)自用VR4447/VR4126BYbe、VR4447/VR4127BYbe和VR4447/VR4130BYbe培養(yǎng)的純化B細(xì)胞的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。數(shù)據(jù)表示來(lái)自2個(gè)供體的合并數(shù)據(jù)。圖29顯示來(lái)自用VR4447/VR4126BYbe、VR4447/VR4127BYbe、VR4447/VR4130BYbe、VR4447/VR4126/VR645BYbe/白蛋白和VR4447/VR4130/VR645BYbe/白蛋白培養(yǎng)的PBMC或純化B細(xì)胞的破傷風(fēng)類毒素IgG產(chǎn)生的抑制。從單個(gè)供體顯示的數(shù)據(jù)。實(shí)施例11—SLE患者B細(xì)胞中BCR信號(hào)傳導(dǎo)的失調(diào)和共靶向抗原CD79b加抗原CD22對(duì)SLEB細(xì)胞功能的影響。簡(jiǎn)介：為了評(píng)估CD79b/CD22的組合是否可以用于治療患有自身免疫性疾病的人，我們使用來(lái)自患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的患者的B細(xì)胞作為模型系統(tǒng)。測(cè)試CD79b/CD22組合(VR4447/VR4130)對(duì)已知參與B細(xì)胞功能但在SLE患者中與健康志愿者相比失調(diào)的信號(hào)蛋白的激活狀態(tài)的影響。在該實(shí)驗(yàn)中，比較來(lái)自12個(gè)SLE患者和12個(gè)健康志愿者的B細(xì)胞的共靶向CD79b和CD22對(duì)其激活狀態(tài)的影響。方法:PhosFlow測(cè)定:所有測(cè)定使用2x105個(gè)PBMC/孔進(jìn)行。在處理的樣品中，以100nM的濃度測(cè)試抗原CD79b和抗原CD22特異性BYbe。來(lái)自健康志愿者和SLE患者的PBMC在37℃下與BYbe預(yù)孵育90分鐘。在未處理的樣品中，在該孵育期間簡(jiǎn)單地省略BYbe。此后，細(xì)胞用25μg/ml的山羊F(ab')2抗人IgM(SouthernBiotechnology)在37℃和5％CO2下激活10分鐘，并通過(guò)加入固定劑(Cytofix-BDBiosciences)停止反應(yīng)。在未刺激的樣品中，在該孵育期間簡(jiǎn)單地省略抗人IgM。在室溫下15分鐘后，將細(xì)胞沉淀(500×g5分鐘)，然后在冰冷的permbufferIII(BDBiosciences)中重懸浮，然后在流式緩沖液(PBS+1％BSA+0.01％NaN3+2mMEDTA)洗滌兩次。然后用抗CD20、抗磷酸化(p)NF-κB、抗pSyk、抗pAtk和抗pErk1&2染色細(xì)胞，并在室溫下在黑暗中孵育1小時(shí)。最后，板在流式緩沖液中洗滌兩次，然后在iQUE流式細(xì)胞儀(Intellicyt)上測(cè)量。然后計(jì)算B細(xì)胞中pNF-κB、pSyk、pAkt和pErk1&2表達(dá)的幾何平均值(平均熒光強(qiáng)度，MFI)，并以圖形形式表示。結(jié)果：圖30顯示與來(lái)自健康志愿者的那些相比，SLE患者B細(xì)胞中NF-κB、Syk、Akt和Erk1&2(未刺激的和未治療的)的基線磷酸化升高。圖31至34顯示在健康志愿者和SLE患者中，CD79/CD22Bybe可以同等地抑制pNF-κB、pSyk、pAkt和pErk1&2。結(jié)論：該數(shù)據(jù)顯示，與健康志愿者相比，來(lái)自SLE患者的B細(xì)胞在任何體外刺激之前都被激活。在通過(guò)B細(xì)胞受體刺激細(xì)胞時(shí)，與背景信號(hào)相比，健康志愿者和SLE患者都顯示出增強(qiáng)的激活水平。在健康志愿者和SLE患者中，該信號(hào)基本上被CD79b/CD22組合阻斷。該數(shù)據(jù)表明CD79b/CD22組合可以抑制來(lái)自健康志愿者以及具有潛在自身免疫疾病的人的B細(xì)胞，表明該途徑對(duì)B細(xì)胞激活具有根本重要性。序列表<110>UCBPharma<120>具有針對(duì)CD79和CD22的特異性的分子<130>G0224_WO<150>GB1412658.5<151>2014-07-16<160>163<170>PatentInversion3.5<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<220><223>GCN4(7P14P)序列<400>1AlaSerGlyGlyGlyArgMetLysGlnLeuGluProLysValGluGlu151015LeuLeuProLysAsnTyrHisLeuGluAsnGluValAlaArgLeuLys202530LysLeuValGlyGluArgHisHisHisHisHisHis3540<210>2<211>132<212>DNA<213>人工序列<220><223>GCN4(7P14P)序列<400>2gctagcggaggcggaagaatgaaacaacttgaacccaaggttgaagaattgcttccgaaa60aattatcacttggaaaatgaggttgccagattaaagaaattagttggcgaacgccatcac120catcaccatcac132<210>3<211>262<212>PRT<213>人工序列<220><223>52SR4dsscFv序列<400>3AspAlaValValThrGlnGluSerAlaLeuThrSerSerProGlyGlu151015ThrValThrLeuThrCysArgSerSerThrGlyAlaValThrThrSer202530AsnTyrAlaSerTrpValGlnGluLysProAspHisLeuPheThrGly354045LeuIleGlyGlyThrAsnAsnArgAlaProGlyValProAlaArgPhe505560SerGlySerLeuIleGlyAspLysAlaAlaLeuThrIleThrGlyAla65707580GlnThrGluAspGluAlaIleTyrPheCysValLeuTrpTyrSerAsp859095HisTrpValPheGlyCysGlyThrLysLeuThrValLeuGlyGlyGly100105110GlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGlyGlySerGlyGlyGly115120125GlySerAspValGlnLeuGlnGlnSerGlyProGlyLeuValAlaPro130135140SerGlnSerLeuSerIleThrCysThrValSerGlyPheLeuLeuThr145150155160AspTyrGlyValAsnTrpValArgGlnSerProGlyLysCysLeuGlu165170175TrpLeuGlyValIleTrpGlyAspGlyIleThrAspTyrAsnSerAla180185190LeuLysSerArgLeuSerValThrLysAspAsnSerLysSerGlnVal195200205PheLeuLysMetAsnSerLeuGlnSerGlyAspSerAlaArgTyrTyr210215220CysValThrGlyLeuPheAspTyrTrpGlyGlnGlyThrThrLeuThr225230235240ValSerSerAlaAlaAlaHisHisHisHisHisHisGluGlnLysLeu245250255IleSerGluGluAspLeu260<210>4<211>792<212>DNA<213>人工序列<220><223>52SR4dsscFv序列<400>4gatgcggtggtgacccaggaaagcgcgctgaccagcagcccgggcgaaaccgtgaccctg60acctgccgcagcagcaccggcgcggtgaccaccagcaactatgcgagctgggtgcaggaa120aaaccggatcatctgtttaccggcctgattggcggcaccaacaaccgcgcgccgggcgtg180ccggcgcgctttagcggcagcctgattggcgataaagcggcgctgaccattaccggcgcg240cagaccgaagatgaagcgatttatttttgcgtgctgtggtatagcgaccattgggtgttt300ggctgcggcaccaaactgaccgtgctgggtggaggcggtggctcaggcggaggtggctca360ggcggtggcgggtctggcggcggcggcagcgatgtgcagctgcagcagagcggcccgggc420ctggtggcgccgagccagagcctgagcattacctgcaccgtgagcggctttctcctgacc480gattatggcgtgaactgggtgcgccagagcccgggcaaatgcctggaatggctgggcgtg540atttggggcgatggcattaccgattataacagcgcgctgaaaagccgcctgagcgtgacc600aaagataacagcaaaagccaggtgtttctgaaaatgaacagcctgcagagcggcgatagc660gcgcgctattattgcgtgaccggcctgtttgattattggggccagggcaccaccctgacc720gtgagcagcgcggccgcccatcaccatcaccatcacgaacagaaactgattagcgaagaa780gatctgtaatag792<210>5<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>5AspLysThrHisThrCysAlaAla15<210>6<211>11<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>6AspLysThrHisThrCysProProCysProAla1510<210>7<211>18<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>7AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaThrCysProProCys151015ProAla<210>8<211>25<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>8AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaThrCysProProCys151015ProAlaThrCysProProCysProAla2025<210>9<211>30<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>9AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaGlyLysProThrLeu151015TyrAsnSerLeuValMetSerAspThrAlaGlyThrCysTyr202530<210>10<211>31<212>PRT<213>人工序列<220><223>鉸鏈接頭<400>10AspLysThrHisThrCysProProCysProAlaGlyLysProThrHis151015ValAsnValSerValValMetAlaGluValAspGlyThrCysTyr202530<21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