本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測潛在結(jié)核的特異性標(biāo)志物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

結(jié)核是一種由人結(jié)核分枝桿菌引起的疾病。根據(jù)WHO最新數(shù)據(jù)顯示，全球約有30％的人口感染結(jié)核病菌，現(xiàn)有結(jié)核病人約2000萬，每年新增800-1000萬人，每年約有200萬人死于結(jié)核病，是其它所有傳染病總和。我國結(jié)核病情尤為嚴(yán)重，現(xiàn)有結(jié)核感染者5億，占全球的20％，每年約13萬人死于結(jié)核病，是其它所有傳染病總和的2倍。如不及時(shí)采取措施，未來十年可能有3000萬人患病，將會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。目前結(jié)核病控制的存在的主要問題是病人發(fā)現(xiàn)率低，治愈率低。在診斷方面，現(xiàn)有的檢測方法不能很好的區(qū)分潛在結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核，目前還沒有一種潛在結(jié)核診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

結(jié)核菌素皮試(tuberculin skin test,TST)是一種廣泛使用的結(jié)核檢測方法，已經(jīng)有100多年的歷史，由于其操作簡單、檢測成本低，在全世界得到廣泛使用。但是這種方法會(huì)把接種過卡介苗的非結(jié)核患者診斷為結(jié)核陽性，其結(jié)核檢測錯(cuò)誤率較高。γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γrelease assays，IGRAs)能夠很好的克服這一缺點(diǎn)，對(duì)結(jié)核病檢測的靈敏度和特異性都很高。這種方法利用ELISA檢測全血中IFN-γ釋放量或ELISPOT檢測外周血單核細(xì)胞中釋放IFN-γ的T淋巴細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測。IFN-γ釋放實(shí)驗(yàn)采用RD-1區(qū)的特異性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7(RD-11)，這些區(qū)域特異性的存在于人結(jié)核桿菌，而卡介苗菌株BCG和大多數(shù)環(huán)境結(jié)核桿菌沒有這些區(qū)域。

不管是結(jié)核菌素皮試還是人干擾素-γ釋放實(shí)驗(yàn)都不能很好的檢出潛在結(jié)核患者，關(guān)鍵在于沒有特異性和靈敏度高的潛在結(jié)核抗原。因此，加大結(jié)核病菌的基礎(chǔ)研究，尋找快速，準(zhǔn)確，實(shí)用的潛在結(jié)核檢測方法，提高潛在結(jié)核病人的檢出率，是目前結(jié)核病診斷需要迫切解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提出一種用于檢測潛在結(jié)核的特異性標(biāo)志物及其應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：

一種用于檢測潛在結(jié)核的特異性標(biāo)志物，其為抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合。

優(yōu)選地，所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.1的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

優(yōu)選地，所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.3的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

一種所述的特異性標(biāo)志物在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中包括如下內(nèi)容的說明書：人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ或者IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結(jié)核診斷因子。

優(yōu)選地，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中包括如下內(nèi)容的說明書：當(dāng)所述特異性標(biāo)志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合時(shí)，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ作為潛在結(jié)核診斷因子；當(dāng)所述特異性標(biāo)志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合時(shí)，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結(jié)核診斷因子。

一種用于鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核的試劑盒，包含所述的特異性標(biāo)志物。

優(yōu)選地，所述試劑盒中還包括配合所述特異性標(biāo)志物一起使用的試劑。

一種所述的試劑盒在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果包括：本發(fā)明經(jīng)過大量研究，篩選出了Rv2626c、Rv3716c、TrxC抗原或其兩兩組合作為潛在結(jié)核檢測的特異性標(biāo)志物，能夠判斷受試者是否為潛在結(jié)核患者，并可以將潛在結(jié)核患者與結(jié)核病人區(qū)分開，其在潛在結(jié)核診斷試劑盒，在潛在結(jié)核鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查中具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中所制備的Rv2626c蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a空載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道2為PET-32a-Rv2626c轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道3為蛋白分子標(biāo)記；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中所制備的Rv3716c蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a空載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道2為PET-32a-Rv3716c轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道3為蛋白分子標(biāo)記；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中所制備的TrxC蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖。泳道1為PET-32a-TrxC轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道2為PET-32a空載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后菌液上清；泳道3為蛋白分子標(biāo)記；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1中的IFN-γ對(duì)3個(gè)潛在結(jié)核特異性抗原的反應(yīng)；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1中的TNF-α對(duì)3個(gè)潛在結(jié)核特異性抗原的反應(yīng)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的介紹，以使更好的理解本發(fā)明，但下述實(shí)施例并不限制本發(fā)明范圍。

本發(fā)明提供一種用于檢測潛在結(jié)核的特異性標(biāo)志物，在具體的實(shí)施方式中，其為抗原Rv2626c、抗原Rv3716c、抗原TrxC、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合。

本發(fā)明所稱的“潛在結(jié)核”為感染了結(jié)核桿菌，即體內(nèi)攜帶有結(jié)核桿菌，但體內(nèi)的結(jié)核桿菌處于休眠期，還沒有爆發(fā)出來引起人體一些臨床上可見的結(jié)核癥狀。

以下通過一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)闡述，下述實(shí)施例中：所使用的實(shí)驗(yàn)方法、檢測方法或分析方法等如無特別說明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等如無特別說明，均可以從市購獲得，所述的“常溫”是指25-37℃；抗原Rv2626c、抗原Rv3716c或抗原TrxC在下文中也稱“潛在結(jié)核特異性抗原”。

在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，可以優(yōu)選以下方案中的至少一個(gè)：

所述抗原Rv2626c是如序列表中sequence ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.1的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.1所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

所述抗原Rv3716c是如序列表中sequence ID No.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.2的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.2所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

所述抗原TrxC是如序列表中sequence ID No.3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或是將序列表中的sequence ID No.3的氨基酸殘基經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與sequence ID No.3所示具有相同功能的衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供一種所述的特異性標(biāo)志物在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中包括如下內(nèi)容的說明書：人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ或者IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結(jié)核診斷因子。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中包括如下內(nèi)容的說明書：當(dāng)所述特異性標(biāo)志物是Rv2626c、抗原Rv2626c和抗原Rv3716c的組合、或抗原Rv2626c和抗原TrxC的組合時(shí)，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ作為潛在結(jié)核診斷因子；當(dāng)所述特異性標(biāo)志物是抗原Rv3716c、抗原TrxC、或抗原Rv3716c和抗原TrxC的組合時(shí)，人的外周全血樣本經(jīng)過所述特異性標(biāo)志物刺激后，以釋放出的IFN-γ與TNF-α的比值作為潛在結(jié)核診斷因子。

本發(fā)明還提供一種用于鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核的試劑盒，包含所述的特異性標(biāo)志物。

在一些優(yōu)選的實(shí)施例中，所述試劑盒中還包括配合所述特異性標(biāo)志物一起使用的試劑。

本發(fā)明還提供一種所述的試劑盒在制備具有鑒別、診斷、輔助診斷、篩查和/或輔助篩查潛在結(jié)核用途的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

以下通過更具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述。

實(shí)施例1

1.分子克隆潛在結(jié)核特異性抗原

1.1提取結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)總RNA

1)用接種環(huán)取結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株(北京株)于7H11固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)5-6周，用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落于體積比為0.1％的7H9吐溫液體培養(yǎng)基中，2周后轉(zhuǎn)種，待OD₆₀值達(dá)到0.5-0.8時(shí)備用。

2)離心去除培養(yǎng)基上清，用PBS洗一遍，制備成1×10⁹CFU/份，加入新配置的甲醇氯仿混懸液(甲醇和氯仿的體積比為1:3)1ml，渦旋震蕩1分鐘，立刻加入Trizol5ml，渦旋震蕩15秒。

3)于冰上靜置10分鐘，12000g離心10分鐘，取上層水相，加入等體積的異丙醇混勻，-20℃靜止2小時(shí)。

4)10000g離心10分鐘后棄上清，用70％乙醇洗兩次，自然干燥后加入DEPC水溶解，得到H37Rv菌株總RNA。

1.2 RT-PCR獲取目的基因片段

1.2.1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)H37Rv菌株基因組DNA序列(NCBI Reference SEQ:NC_000962.3)設(shè)計(jì)引物，分別進(jìn)行RT-PCR獲得Rv2626c，Rv3716c和TrxC的全長CDS序列，擴(kuò)增引物如下：

Rv2626c上游引物P1(如sequence ID No.4所示)：ATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P2(如sequence ID No.5所示)：CTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P3(如sequence ID No.6所示)：ATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P4(如sequence ID No.7所示)：TCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P5(如sequence ID No.8所示)：ATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P6(如sequence ID No.9所示)：CTAGTTGAGGTTGGGAAC

再次設(shè)計(jì)引物分別加入酶切位點(diǎn)BamHI和EcoRI，酶切后連接在載體PET-32a中，構(gòu)建成表達(dá)載體PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC。

帶酶切位點(diǎn)的引物如下：

Rv2626c上游引物P7(如sequence ID No.10所示)：

CGGATCCATGACCACCGCACGCG

Rv2626c下游引物P8(如sequence ID No.11所示)：

GGAATTCCTAGCTGGCGAGGGCCAT

Rv3716c上游引物P9(如sequence ID No.12所示)：

CGGATCCATGCAACCCGGAGGCGAC

Rv3716c下游引物P10(如sequence ID No.13所示)：

GGAATTCTCAGATCCCTGGTACAGGT

TrxC上游引物P11(如sequence ID No.14所示)：

CGGATCCATGACCGATTCCGAGAAG

TrxC上游引物P12(如sequence ID No.15所示)：

GGAATTCCTAGTTGAGGTTGGGAAC

1.2.2逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

在0.2ml EP管中，取如上1.1中提取的H37Rv菌株總RNA 1μg，按如下比例建立逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：

于PCR儀上50℃反應(yīng)30min，然后94℃下2min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，合成cDNA于1.2.3中的PCR反應(yīng)。

1.2.3 Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段擴(kuò)增

在0.2ml EP管中，取如上1.2.2中H37Rv菌株的cDNA，按如下比例建立基因片段擴(kuò)增反應(yīng)體系：

于PCR儀上94℃5min，然后30個(gè)PCR循環(huán)，每個(gè)循環(huán)94℃45s，60℃45s，72℃1min，最后延伸72℃5min。

1.3表達(dá)載體構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增的Rv2626c，Rv3716c和TrxC的基因片段進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，在紫外燈下用手術(shù)刀片切下相應(yīng)大小的DNA片段，稱重后移入EP管。根據(jù)DNA片段純化試劑盒說明書進(jìn)行回收。

1.3.1將純化的PCR片段連接到PMD-18T載體上

反應(yīng)體系如下：

1.3.2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化

1)取一管DH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰上融化后加入上述連接產(chǎn)物，輕輕混勻。

2)冰上靜置20min。

3)將EP管在42℃下熱激60s。

4)快速取出EP管在冰上放置1-2min。

5)加入800μL不含抗性的LB液體培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至搖床，37℃搖震蕩培養(yǎng)1h。

6)取出EP管，在常溫下4000rpm，離心1min，吸取700μL上清，剩余200μL輕輕吹打重懸細(xì)胞。

7)將重懸細(xì)胞均勻涂布于含有氨芐抗性(100mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)12-16h。

1.3.3提取質(zhì)粒并測序

從含有氨芐抗性(100mg/ml)的LB固體培養(yǎng)基中挑取10個(gè)菌落進(jìn)行克隆PCR進(jìn)行陽性鑒定，并接種于一塊新的含抗性的LB固體培養(yǎng)基中。對(duì)克隆PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并測序。質(zhì)粒提取過程按質(zhì)粒提取試劑盒說明書操作。

1.3.4酶切與純化

將測序正確的PMD-18T-Rv2626c，PMD-18T-Rv3716c和PMD-18T-TrxC，以及表達(dá)載體PET-32a進(jìn)行BamHI和EcoRI雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖電泳，目的片段切膠回收，并用膠純化試劑盒純化。

1.3.5連接與轉(zhuǎn)化

將純化的帶酶切位點(diǎn)的Rv2626c，Rv3716c和TrxC基因片段和載體PET-32a分別進(jìn)行如下連接反應(yīng)：

將經(jīng)上述連接反應(yīng)得到的重組的PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)，并在含有氨芐(50mg/ml)LB固體培養(yǎng)基中篩選陽性克隆。

1.4表達(dá)

利用大腸桿菌體外誘導(dǎo)表達(dá)潛在結(jié)核特異性抗原的具體過程為：

1)挑取鑒定為陽性的菌斑于3ml含有氨芐抗性(50mg/ml)的LB液體培養(yǎng)中，37℃震蕩培養(yǎng)12-16小時(shí)。

2)按1％轉(zhuǎn)種于新鮮配置的含有氨芐抗性(50mg/ml)的LB液體培養(yǎng)中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀值為0.4-0.6。

3)加入IPTG至終濃度為0.5mM，37℃下誘導(dǎo)培養(yǎng)3-16小時(shí)。

4)4℃10000g下離心5min，分別收集上清和沉淀。

1.5純化

所有在大腸桿菌表達(dá)的蛋白均帶有組氨酸標(biāo)簽，可以通過Ni-NAT進(jìn)行親和純化，具體過程如下：

1)加入150μL細(xì)胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)和蛋白酶抑制劑PMSF。

2)冰上超聲破碎細(xì)胞。

3)加入10％triton X-100，使終濃度為0.05％，充分混勻，冰上放置10分鐘。

4)4℃13000g離心15min，取上清。

5)將Ni-NAT用10倍柱體積的細(xì)胞裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油)平衡。

6)將上清蛋白樣品加入到Ni-NAT柱中，流速為15ml/h。

7)用5倍柱體積的細(xì)胞裂解緩沖液沖洗Ni-NAT一次，流速為30ml/h。

8)用5倍柱體積的內(nèi)毒素緩沖液(10mM Tris-HCl pH7.9，0.5％ASB-14)沖洗Ni-NAT一次，流速為30ml/h。

9)用5倍柱體積的洗脫液(20mM Tris-HCl pH7.9，0.5M NaCl，10％甘油，250mM咪唑)沖洗Ni-NAT一次，流速為15ml/h，收集洗脫液。

10)12.5％SDS-PAGE分析蛋白純化情況。

1.6結(jié)果

如圖1、2和3所示，與對(duì)照PET-32a空載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)相比，PET-32a-Rv2626c，PET-32a-Rv3716c和PET-32a-TrxC轉(zhuǎn)染大腸桿菌Rosetta-gami 2(DE3)后在0.5M IPTG誘導(dǎo)下有特異性的蛋白條帶出現(xiàn)。通過與蛋白分子標(biāo)記對(duì)比，Rv2626c，Rv3716c和TrxC分子大小為12KDa、10KDa和10KDa。

2.評(píng)估潛在結(jié)核患者和結(jié)核病人對(duì)潛在結(jié)核特異性抗原的反應(yīng)

2.1實(shí)驗(yàn)樣本

實(shí)驗(yàn)樣本如表1所示：

表1受試者樣本特征情況表

結(jié)核病人樣本：40例結(jié)核病人外周全血實(shí)驗(yàn)樣本采集自深圳市第三人民醫(yī)院結(jié)核科門診或住院的結(jié)核病人，經(jīng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)所有受試者干擾素釋放實(shí)驗(yàn)均為陽性。

根據(jù)潛在結(jié)核的定義選取的潛在結(jié)核患者樣本為：35例潛在結(jié)核患者來自于其家庭成員至少有一個(gè)是結(jié)核病陽性，且在一起共同生活超過半年以上，且排除結(jié)核桿菌培養(yǎng)為陽性的患者。

2.2γ-干擾素釋放試驗(yàn)

γ-干擾素釋放試驗(yàn)采用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試劑盒(Cellestis，Qiagen GmBH)，所有實(shí)驗(yàn)步驟按廠家說明書進(jìn)行操作。本實(shí)驗(yàn)35名潛在結(jié)核患者和40名結(jié)核病人γ-干擾素釋放試驗(yàn)均為陽性，說明γ-干擾素釋放試驗(yàn)不能很好區(qū)分潛在結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核。

2.3潛在結(jié)核特異性抗原檢測

2.3.1外周全血分析

1)將肝素鈉靜脈全血用RPMI1640稀釋10倍。

2)往48孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入稀釋外周全血，每孔400μL，每個(gè)樣本4個(gè)重復(fù)。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL鏈霉素(10mg/ml)。

4)每個(gè)樣本分別添加Rv2626c，Rv3716c和TrxC潛在結(jié)核特異性抗原，終濃度為5ug/ml；同時(shí)設(shè)置一個(gè)空白對(duì)照，該孔不添加任何潛在特異性抗原。

5)37℃、5％二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)6天。

6)離心收集血清。

2.3.2 IFN-γ和TNF-α檢測

IFN-γ和TNF-α檢測采用達(dá)科為生物工程有限公司人IFN-γELISA Kit和人TNF-αELISA Kit。操作過程按說明書進(jìn)行。

2.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果與判讀

應(yīng)用潛在結(jié)核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC對(duì)40名結(jié)核病人和35名潛在結(jié)核患者外周全血進(jìn)行特異性刺激，然后應(yīng)用ELISA檢測血清樣本中的IFN-γ和TNF-α的含量，我們發(fā)現(xiàn)潛在結(jié)核患者血清中IFN-γ的含量明顯高于結(jié)核病人，與之相反，潛在結(jié)核患者血清中TNF-α的含量明顯低于結(jié)核病人，結(jié)果如圖4和圖5所示，表明經(jīng)潛在結(jié)核特異性抗原刺激，IFN-γ可以作為潛在結(jié)核患者特異性檢測因子，TNF-α可以作為結(jié)核病人特異性檢測因子。我們把受試的35名潛在結(jié)核患者設(shè)為診斷組，另外40名結(jié)核病人作為對(duì)照組，以診斷組陽性率最高和對(duì)照組陽性率最低為標(biāo)準(zhǔn)，利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出最佳陽性判斷閾值(如表2所示)。受試者血清中IFN-γ和TNF-α含量高于陽性判斷閾值的判定為陽性，低于陽性判斷閾值的判斷為陰性。

IFN-γELISA檢測中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC對(duì)潛在結(jié)核患者陽性判定數(shù)均為31個(gè)，陽性率為31/35＝88.5％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC對(duì)結(jié)核病人陽性率分別為7.5％，12.5％和10％。由此可以看出，三者相比，Rv2626c對(duì)潛在結(jié)核患者檢測的準(zhǔn)確率最高。

TNF-αELISA檢測中，如表2所示，Rv2626c，Rv3716c和TrxC對(duì)潛在結(jié)核患者陽性判定數(shù)均為4個(gè)，陽性率為4/35＝11.4％；Rv2626c，Rv3716c和TrxC對(duì)結(jié)核病人陽性率分別為70％，72.5％和57.5％。由此可以看出，Rv2626c和Rv3716c對(duì)結(jié)核病人的檢測準(zhǔn)確率要好于TrxC。

表2：IFN-γ和TNF-α對(duì)潛在結(jié)核特異性抗原的反應(yīng)結(jié)果

于此同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，Rv2626c分別聯(lián)合其它兩種特異性抗原Rv3716c和TrxC能明顯提高潛在結(jié)核患者陽性檢測率，檢測數(shù)據(jù)如表3所示。對(duì)于聯(lián)合抗原檢測來說，陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)為只要有一種抗原檢測結(jié)果為陽性即判定為陽性。從表3中可以看出，Rv2626c+Rv3716c在潛在結(jié)核患者中的陽性率從88.5％提高到100％，在結(jié)核病人中的陽性率從7.5％提高到17.5％；Rv2626c+TrxC在潛在結(jié)核患者中的陽性率從88.5％提高到97.14％，在結(jié)核病人中的陽性率從7.5％提高到12.5％。

表3 IFN-γ對(duì)聯(lián)合抗原的反應(yīng)結(jié)果

基于IFN-γ可以作為潛在結(jié)核患者特異性檢測因子，TNF-α可以作為結(jié)核病人特異性檢測因子，猜想，利用IFN-γ/TNF-α比值作為潛在結(jié)核診斷因子可能有助于提高檢測特異性和靈敏度。IFN-γ/TNF-α比值為同一病人血清樣本經(jīng)潛在結(jié)核特異性抗原刺激后IFN-γ釋放量除以TNF-α釋放量，并利用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC curve)篩選出最佳陽性判斷閾值(如表4所示)，Rv2626c，Rv3716c和TrxC在潛在結(jié)核患者中的陽性率均為94.2％，在結(jié)核病人中的陽性率分別為7.5％，5％和5％。因此利用IFN-γ/TNF-α比值檢測中，Rv3716c和TrxC具有最佳檢測效果，對(duì)潛在結(jié)核患者檢測的靈敏度為94.2％，特異性為95％。

表4 IFN-γ/TNF-α比值對(duì)潛在結(jié)核檢測診斷效果

2.5結(jié)論

從本實(shí)驗(yàn)可以看出，利用潛在結(jié)核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC能夠很好的區(qū)分潛在結(jié)核患者和結(jié)核病人。運(yùn)用Rv2626c+Rv3716c或Rv2626c+TrxC雙抗原進(jìn)行IFN-γ單因子ELISA檢測，可以提高潛在結(jié)核診斷的靈敏度，但代價(jià)是降低了檢測的特異性。而運(yùn)用Rv3716c和TrxC其中任何一個(gè)單抗原進(jìn)行IFN-γ/TNF-α比值的雙因子檢測，潛在結(jié)核診斷靈敏度從88.5％提高到94.2％，特異性從92.5％提高到95％，沒有因靈敏度提高而降低特異性。

目前，還沒有一款產(chǎn)品能夠很好的區(qū)分潛在結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核，以γ-干擾素釋放試驗(yàn)(interferon-γrelease assays，IGRAs)為例，它能同時(shí)檢測出潛在結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核，但是不能將兩者區(qū)分開。本實(shí)驗(yàn)35名潛在結(jié)核患者和40名結(jié)核病人運(yùn)用QuantiFERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)試劑盒進(jìn)行檢測均呈陽性。而采用潛在結(jié)核特異性抗原Rv2626c，Rv3716c和TrxC，并運(yùn)用我們開發(fā)的IFN-γ和TNF-α雙因子檢測能很好的區(qū)分潛在結(jié)核和活動(dòng)性結(jié)核。

實(shí)施例2

潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒的制備。

1、待測樣本準(zhǔn)備

待測樣本分為三組，分別為健康人，潛在結(jié)核患者和結(jié)核病人。

健康人樣本數(shù)為18個(gè)，血液樣本來自深圳市第三人民醫(yī)院門診部和住院部，經(jīng)結(jié)核桿菌培養(yǎng)為陰性，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

潛在結(jié)核患者樣本數(shù)為21個(gè)，血液樣本來自于上述實(shí)施例1所述，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

結(jié)核病人樣本數(shù)為29個(gè)，血液樣本來自于上述實(shí)施例1所述，且都有卡介苗接種經(jīng)歷。

2、診斷過程涉及的試劑

診斷過程涉及的試劑包括ELISA板，IFN-γ包被抗體和檢測抗體，TNF-α包被抗體和檢測抗體，包被抗體緩沖液，檢測抗體稀釋液，洗滌緩沖液，終止緩沖液，TMB，Streptavidin-HRP，RPMI1640，青霉素，鏈霉素，Rv3716c和TrxC。結(jié)核診斷特異性抗原ESAT-6，CFP-10和TB7.7來自于QFT-GIT試劑盒。

3、潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒制備過程

1)用0.15M pH7.2的PBS作為包被抗體緩沖液稀釋IFN-γ包被抗體和TNF-α包被抗體，具體稀釋度依據(jù)不同抗體公司原料，生產(chǎn)批號(hào)和棋盤滴定實(shí)驗(yàn)而定。

2)往96孔ELISA板中加入含有包被抗體的工作液，每孔100μL。每五孔為一個(gè)檢測單元，前四孔加入IFN-γ包被抗體工作液，第五孔加入TNF-α包被抗體工作液。

3)4℃過夜。

4)倒掉包被抗體工作液，用洗滌緩沖液洗滌5遍。

5)自然風(fēng)干。

4、潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒操作過程

4.1全血樣本制備

1)將肝素鈉靜脈全血用RPMI1640稀釋10倍。

2)往48孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板中加入稀釋外周全血，每孔400μL，每個(gè)樣本4個(gè)重復(fù)。

3)每孔添加4μL青霉素(10000U/ml)和4μL鏈霉素(10mg/ml)，得到全血樣本。

4.2 IFN-γ和TNF-αELISA分析

ELISA分析參照達(dá)科為生物工程有限公司IFN-γ和TNF-α檢測試劑盒說明進(jìn)行，具體加樣過程和順序如表5所示：

表5：IFN-γ和TNF-αELISA分析的加樣順序表

5、陽性判定方法

ESAT-6和CFP-10刺激陽性判定閾值為IFN-γ25pg/ml，Rv3716c刺激后陽性判定閾值為IFN-γ/TNF-α2.07，TrxC刺激后陽性判定閾值為IFN-γ/TNF-α1.93。具體陽性判定標(biāo)準(zhǔn)如表6所示。

表6：陽性判定表

6、應(yīng)用制備的ELISA試劑盒進(jìn)行潛在結(jié)核診斷的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)18個(gè)健康人，21個(gè)潛在結(jié)核患者和29個(gè)結(jié)核病人應(yīng)用達(dá)科為公司制備的潛在結(jié)核ELISA檢測試劑盒進(jìn)行檢測，結(jié)果如表7所示。由于Rv3716C和TrxC刺激得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，故表7只列出了Rv3716C刺激后得到的檢測結(jié)果。從表7中可以看到，孔1(陰性對(duì)照)全部為陰性，孔2(陽性對(duì)照)全部為陽性，說明試劑盒制備沒有問題，達(dá)到質(zhì)量控制要求。

表7：采用Rv3716C抗原的潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒檢測結(jié)果

本實(shí)施例僅詳細(xì)介紹了使用潛在結(jié)核特異性抗原Rv3716c或TrxC來制備潛在結(jié)核診斷試劑盒，但其保護(hù)范圍不限于使用潛在結(jié)核特異性抗原Rv3716C或TrxC，還包括使用潛在結(jié)核特異性抗原Rv2626c。此外，本實(shí)施例僅詳細(xì)介紹了使用潛在結(jié)核特異性抗原聯(lián)合活動(dòng)性結(jié)核檢測抗原SAT-6，CFP-10和TB7.7，但其保護(hù)范圍不限于聯(lián)合SAT-6，CFP-10和TB7.7，還包括聯(lián)合其他活動(dòng)性結(jié)核檢測特異性抗原。另外，潛在結(jié)核診斷試劑盒還可以結(jié)合ELISA/ELISPOT/流式方法，制備相應(yīng)的潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒、潛在結(jié)核ELILSPOT診斷試劑盒和潛在結(jié)核流式診斷試劑盒，本實(shí)施例僅詳細(xì)介紹了潛在結(jié)核ELISA診斷試劑盒的制備，但其保護(hù)范圍不限于使用其它通用技術(shù)使用本抗原，還包括結(jié)核ELILSPOT診斷試劑盒和結(jié)核流式診斷試劑盒及其他通用技術(shù)使用本抗原的試劑盒。

本發(fā)明的實(shí)施例2詳細(xì)介紹了使用潛在結(jié)核特異性抗原并聯(lián)合活動(dòng)性結(jié)核檢測抗原在制備潛在結(jié)核診斷試劑盒方面的應(yīng)用，聯(lián)合后的效果是通過一個(gè)產(chǎn)品就能同時(shí)區(qū)分健康人、潛在結(jié)核患者和活動(dòng)性結(jié)核患者。在其他實(shí)施例中，還可以提供一種只檢測潛在結(jié)核的試劑盒，與實(shí)施例2的區(qū)別僅在于只使用本發(fā)明篩選出的潛在結(jié)核特異性抗原，不聯(lián)合其他活動(dòng)性結(jié)核檢測抗原，其他制備步驟和使用方法均相同，從而開發(fā)出一種只檢測潛在結(jié)核的試劑盒。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干等同替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。