本發(fā)明涉及骨科疾病檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒。
背景技術(shù)：
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病因至今并不十分明了，目前大多認(rèn)為其是人體自身免疫性疾病，亦可視為一種慢性的綜合征，表現(xiàn)為外周關(guān)節(jié)的非特異性炎癥，此時(shí)患病關(guān)節(jié)及其周圍組織呈現(xiàn)進(jìn)行性破壞，并致使受損關(guān)節(jié)發(fā)生功能障礙。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率女性高于男性，女性是男性的2～3倍，歐美國(guó)家的發(fā)病率明顯高于國(guó)人。其臨床癥狀和體征特點(diǎn)有：疼痛、僵硬、腫脹、畸形、皮下結(jié)節(jié)、體溫升高等。本病早期即有關(guān)節(jié)局部痛感，尤其是在活動(dòng)期，并伴有觸痛及壓痛，此為最早出現(xiàn)、也是患者最敏感的體征；在晨起時(shí)會(huì)有受累關(guān)節(jié)僵硬癥狀，且受累關(guān)節(jié)周圍軟組織呈彌漫性腫脹，表面溫度略高于正常關(guān)節(jié)；后期病例一般均出現(xiàn)掌指關(guān)節(jié)屈曲及尺偏畸形；30％～40％的患者可出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)，此有助于對(duì)本病的診斷；急性期的某些患者可出現(xiàn)發(fā)熱，多為38℃以下的低熱。本病早期可通過(guò)藥物療法和物理理療進(jìn)行治療，后期嚴(yán)重患者需進(jìn)行手術(shù)治療，故對(duì)本病進(jìn)行早期診斷，有利于其積極有效的治療。
目前，具有與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相類似癥狀及體征的疾病很多，如骨性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)、銀屑病性關(guān)節(jié)炎等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎目前的檢查方法包括實(shí)驗(yàn)室檢查，X線檢查等，也有免疫球蛋白(IgM，IgG)檢查，具有一定的診查效果，但準(zhǔn)確率不高?？筊A33是一種分子量33KD的核酸結(jié)合蛋白，在早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病人血清中出現(xiàn)；抗角蛋白抗體(AKA)在研究中發(fā)現(xiàn)其陽(yáng)性患者幾乎均發(fā)展成類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，故可作為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷指標(biāo)；免疫球蛋白IgG在一些病程長(zhǎng)，病情重的患者血清中有很明顯高比例，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病程及病情的診斷具有很好的參考價(jià)值，故研究一種更加準(zhǔn)確的免疫檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的方法，就是本發(fā)明要研究的問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題就是提供一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒。
本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒，包括試紙條、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙條由樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼制成；所述硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線1包被有抗RA33特異性抗體，所述檢測(cè)線2包被有抗角蛋白特異性抗體(AKA)，所述檢測(cè)線3包被有抗免疫球蛋白IgG抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體；所述微孔試劑為凍干的納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體。
進(jìn)一步的，所述微孔條底部含有凍干的納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，所述微孔條上具有微孔塞，所述微孔塞能夠緊密地塞在微孔條中。
進(jìn)一步的，所述抗RA33特異性抗體為來(lái)自HeLa細(xì)胞的單克隆抗體，所述抗角蛋白特異性抗體(AKA)為角蛋白與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原制備的單克隆抗體，所述抗免疫球蛋白IgG抗體為抗免疫球蛋白的單克隆抗體。
進(jìn)一步的，述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或人血清白蛋白。
進(jìn)一步的，所述樣品吸收墊經(jīng)處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL。
進(jìn)一步的，所述的膠體金標(biāo)記抗體的制備方法為：
a.所述膠體金溶液的制備方法為：將質(zhì)量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰后迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，得到膠體金溶液；
b.將制備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質(zhì)量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總?cè)芤鹤罱K濃度為0.9％，先以350r/min的轉(zhuǎn)速低速離心8min，再以2000r/min的轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、膠體金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標(biāo)記的免疫球蛋白IgG抗體。
進(jìn)一步的，所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測(cè)線1，檢測(cè)線2，檢測(cè)線3和質(zhì)控線的位置，檢測(cè)線1上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線2上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線3上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質(zhì)控線上噴涂包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg。
一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒的制備方法為：
(1)分別制備凍干有納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，包括以下方法：a.所述膠體金溶液的制備方法為：將質(zhì)量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰后迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，得到膠體金溶液；b.將制備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質(zhì)量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總?cè)芤鹤罱K濃度為0.9％，先以350r/min的轉(zhuǎn)速低速離心8min，再以2000r/min的轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、膠體金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標(biāo)記的免疫球蛋白IgG抗體，對(duì)其進(jìn)行凍干處理即得；
(2)樣品吸收墊的制備方法：樣品吸收墊經(jīng)處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；
(3)所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測(cè)線1，檢測(cè)線2，檢測(cè)線3和質(zhì)控線的位置，檢測(cè)線1上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線2上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線3上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質(zhì)控線上噴涂包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg；
(4)試紙條制備：將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼制成試紙條，干燥處理即得；
(5)將微孔試劑、微孔條、微孔塞和試紙條組裝成試劑盒。
本發(fā)明的試劑盒使用方法：取血后分離得到血清，將待測(cè)血清滴加于微孔試劑中，將其混勻，靜置4min，將標(biāo)有MAX標(biāo)記線的一端插入上述微孔試劑中，5-10分鐘判斷結(jié)果：如果檢測(cè)線1，檢測(cè)線2和質(zhì)控線均有明顯紅色顯示則判定為陽(yáng)性，且為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎初期；如果檢測(cè)線1，檢測(cè)線2，檢測(cè)線3和質(zhì)控線均有紅色顯示則判定為陽(yáng)性，且為中晚期；如果質(zhì)控線未見(jiàn)顯色反應(yīng)，則判斷檢測(cè)無(wú)效。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在：本發(fā)明通過(guò)抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)、抗免疫球蛋白IgG抗體作為三重指標(biāo)來(lái)檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，抗RA33特異性抗體和抗角蛋白特異性抗體(AKA)在早期類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清中出現(xiàn)，且其消長(zhǎng)與病情和用藥無(wú)關(guān)，為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)，免疫球蛋白IgG在中晚期，病程長(zhǎng)，病情重的患者中明顯升高，不僅可以對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎進(jìn)行診斷，而且為其病情輕重，病程長(zhǎng)短提供重要參考依據(jù)，操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，可用于臨床推廣。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例：一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒，包括試紙條、微孔條、微孔試劑和微孔塞，所述試紙條由樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼制成；所述硝酸纖維素膜上包被有檢測(cè)線1、檢測(cè)線2、檢測(cè)線3和一條質(zhì)控線，所述檢測(cè)線1包被有抗RA33特異性抗體，所述檢測(cè)線2包被有抗角蛋白特異性抗體(AKA)，所述檢測(cè)線3包被有抗免疫球蛋白IgG抗體，所述質(zhì)控線包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體；所述微孔試劑為凍干的納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體。
其中，所述微孔條底部含有凍干的納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，所述微孔條上具有微孔塞，所述微孔塞能夠緊密地塞在微孔條中；所述抗RA33特異性抗體為來(lái)自HeLa細(xì)胞的單克隆抗體，所述抗角蛋白特異性抗體(AKA)為角蛋白與載體蛋白偶聯(lián)物為免疫原制備的單克隆抗體，所述抗免疫球蛋白IgG抗體為抗免疫球蛋白的單克隆抗體；述載體蛋白為牛血清白蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或人血清白蛋白；所述樣品吸收墊經(jīng)處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；所述的膠體金標(biāo)記抗體的制備方法為：a.所述膠體金溶液的制備方法為：將質(zhì)量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰后迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，得到膠體金溶液；b.將制備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質(zhì)量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總?cè)芤鹤罱K濃度為0.9％，先以350r/min的轉(zhuǎn)速低速離心8min，再以2000r/min的轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、膠體金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標(biāo)記的免疫球蛋白IgG抗體；所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測(cè)線1，檢測(cè)線2，檢測(cè)線3和質(zhì)控線的位置，檢測(cè)線1上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線2上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線3上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質(zhì)控線上噴涂包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg。
一種檢測(cè)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的膠體金免疫層析試劑盒的制備方法為：
(1)分別制備凍干有納米金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、納米金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和納米金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG抗體的微孔試劑，包括以下方法：a.所述膠體金溶液的制備方法為：將質(zhì)量濃度為0.01％的氯金酸溶液200ml，加熱至沸騰后迅速加入2ml濃度為1％的檸檬酸三鈉水溶液，加熱煮沸10min，冷卻后以蒸餾水恢復(fù)到原體積，得到膠體金溶液；b.將制備好的膠體金溶液取出10mL的量共3份，取抗RA33特異性抗體、抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗免疫球蛋白IgG抗體各40μg分別加入上述所取的三份膠體金溶液中，攪拌，再分別加入質(zhì)量濃度為5％的胎牛血清，其加入量為使總?cè)芤鹤罱K濃度為0.9％，先以350r/min的轉(zhuǎn)速低速離心8min，再以2000r/min的轉(zhuǎn)速高速離心15min，取上清液，4℃下保存，即得到純化的膠體金標(biāo)記的抗RA33特異性抗體、膠體金標(biāo)記的抗角蛋白特異性抗體(AKA)和抗膠體金標(biāo)記的免疫球蛋白IgG抗體，對(duì)其進(jìn)行凍干處理即得；
(2)樣品吸收墊的制備方法：樣品吸收墊經(jīng)處理液處理，所述處理液是由1.5g牛血清蛋白(BSA)和1.2g氯化鈉，1g的海藻糖用0.01mol/LPBS定容至100mL；
(3)所述硝酸纖維素膜的包被方法為：在硝酸纖維素膜特定位置上劃出檢測(cè)線1，檢測(cè)線2，檢測(cè)線3和質(zhì)控線的位置，檢測(cè)線1上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗RA33單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線2上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗角蛋白單克隆抗體，其包被量為30-40μg，檢測(cè)線3上噴涂包被有膠體金標(biāo)記的抗免疫球蛋白IgG單克隆抗體，其包被量為25-35μg，質(zhì)控線上噴涂包被有羊抗鼠IgM單克隆抗體，其包被量為25-35μg；
(4)試紙條制備：將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊、PVC底板相互粘貼制成試紙條，干燥處理即得；
(5)將微孔試劑、微孔條、微孔塞和試紙條組裝成試劑盒。
最后應(yīng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。