本發(fā)明涉及抗增殖細(xì)胞核抗原抗體的定量檢測(cè)，具體涉及一種抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒及其制作方法和使用方法。

背景技術(shù)：

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)又稱Cyclin或DNA聚合酶δ輔助蛋白，是一個(gè)36KD的核內(nèi)蛋白多肽。1978年Myachi等首次發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中的自身抗體(抗核抗體)與細(xì)胞核增殖狀態(tài)有密切關(guān)系。PCNA在細(xì)胞增殖周期中的作用在于：與DNA聚合酶δ結(jié)合，從而引導(dǎo)完成DNA的復(fù)制。當(dāng)PCNA缺乏時(shí),在DNA的后隨鏈的模板上只有短的DNA片段合成；當(dāng)PCNA與DNA聚合酶δ結(jié)合時(shí)，前導(dǎo)鏈被合成被合成，從而使得DNA雙鏈能夠協(xié)調(diào)的合成出來。因而DNA聚合酶δ和PCNA可能負(fù)責(zé)合成前導(dǎo)鏈。當(dāng)PCNA的反義寡脫核苷酸作用于細(xì)胞時(shí)，DNA的合成和細(xì)胞的有絲分裂完全被抑制。從而進(jìn)一步證實(shí)了PCNA在細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞周期進(jìn)展方面的重要作用。

PCNA的表達(dá)在細(xì)胞增殖周期中的不同階段是不同的。在靜止期和G1早期，PCNA幾乎不表達(dá)；G1晚期PCNA的表達(dá)開始增加；在S期達(dá)到高峰，隨后在G2期和M期降低。PCNA的發(fā)現(xiàn)和其單克隆抗體的建立為研究正常和異常細(xì)胞在體內(nèi)的增殖變化提供了新的研究手段。由于PCNA的表達(dá)與DNA的合成有直接的關(guān)系，它的存在直接表明細(xì)胞處于增殖周期，從而有助于準(zhǔn)確了解各種腎臟病的發(fā)病過程和進(jìn)展情況。由于PCNA處在細(xì)胞核內(nèi)，它的免疫組化染色可以與細(xì)胞的其它標(biāo)記物(識(shí)別胞漿或胞漿性抗原)的染色接合起來，利用雙標(biāo)記技術(shù)可以準(zhǔn)確判別處于增殖周期的細(xì)胞即PCNA陽性細(xì)胞屬于那種細(xì)胞類型，從而有助于分析各種細(xì)胞在腎臟病進(jìn)展中的作用。

但是目前對(duì)于增殖細(xì)胞核抗原定量檢測(cè)依然沒有快速有效的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒及其制作方法和使用方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)中增殖細(xì)胞核抗原定量檢測(cè)的難題?？乖鲋臣?xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒用純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相載體，往包被抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)抗體的酶標(biāo)板中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗PCNA抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過洗滌液徹底洗滌后用底物溶液顯色。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。具體技術(shù)方案如下：

一種抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒，其固相載體為純化的抗體包被的酶標(biāo)板。

進(jìn)一步地，所述純化的抗體為抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)抗體。

進(jìn)一步地，還包括標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、生物素標(biāo)記抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶液、濃洗滌液以及終止液。

進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)品為粉末狀固體或溶液狀態(tài)。

進(jìn)一步地，所述標(biāo)準(zhǔn)品為溶液形式，其濃度分別為0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。

進(jìn)一步地，所述終止液為HCl或H2SO4。

進(jìn)一步地，所述底物溶液包含第一底物溶液和第二底物溶液，所述第一底物溶液為過氧化氫，所述第二底物溶液為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。

上述抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒的制作方法，用純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相載體；往包被抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)抗體的酶標(biāo)板中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗PCNA抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素。

上述抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒的使用方法，包括如下步驟：

(1)配置標(biāo)準(zhǔn)液；

(2)加樣；

(3)棄去液體并甩干，加工作液；

(4)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干；

(5)每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液；

(6)溫育后，棄去孔內(nèi)液體，甩干；

(7)依序每孔加底物溶液；

(8)依序每孔加終止溶液；

(9)酶聯(lián)儀測(cè)量；或者進(jìn)一步包括：

(10)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

進(jìn)一步地，步驟(1)之前提前配置好所有試劑，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡；和/或，步驟(1)中，用樣品稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，濃度配成0.48ug/L、0.24ug/L、0.12ug/L、0.06ug/L、0.03ug/L、0ug/L，其中0ug/L為不含標(biāo)準(zhǔn)品的樣品稀釋液；和/或，步驟(2)中，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔，空白孔加樣品稀釋液100ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘；和/或，步驟(3)中，每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100ul，37℃,60分鐘；和/或，步驟(4)中，溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干；和/或，步驟(5)中，每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液100ul，37℃，60分鐘；和/或，步驟(6)中，溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干；和/或，步驟(7)中，依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色；和/或，步驟(8)中，依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)；和/或，步驟(9)中，用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度，在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)；和/或，步驟(10)中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將樣品反應(yīng)后的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，確定樣品濃度，并乘以稀釋倍數(shù)，既得到原樣品濃度。

與目前現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明酶聯(lián)免疫法測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)能為廣大客戶接受，操作簡(jiǎn)單，而且標(biāo)準(zhǔn)品采用粉末固體，客戶使用前才進(jìn)行配置，雖然增加用戶的操作步驟，但是濃度準(zhǔn)確，不會(huì)出現(xiàn)活性降解的情況。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒使用方便、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適合大批量樣品定性或定量。具體來說：使用酶聯(lián)免疫作為比較經(jīng)典的生物樣品檢測(cè)方法，酶聯(lián)免疫法測(cè)定增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)能為廣大客戶接受，操作簡(jiǎn)單，而且標(biāo)準(zhǔn)品采用粉末固體，客戶使用前才進(jìn)行配置，雖然增加用戶的操作步驟，但是濃度準(zhǔn)確，不會(huì)出現(xiàn)活性降解的情況。本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒使用方便、檢測(cè)方法高效、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便，適合大批量樣品定性或定量。

附圖說明

為抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

具體實(shí)施方式

下面根據(jù)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，其為本發(fā)明多種實(shí)施方式中的一種優(yōu)選實(shí)施例。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒，所述試劑盒的反應(yīng)原理為：用純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相載體，往包被抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)抗體的酶標(biāo)板中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗PCNA抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過洗滌液徹底洗滌后用底物溶液顯色。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

試劑盒包含酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、生物素標(biāo)記抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶液、濃洗滌液、終止液。所述標(biāo)準(zhǔn)品為粉末狀固體或溶液狀態(tài)，如果為溶液形式，其濃度分別為0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。優(yōu)選粉末固體。所述終止液為HCl或H2SO4，優(yōu)選H2SO4，更優(yōu)選H2SO4濃度為4M。所述底物溶液包含底物溶液1和底物溶液2，所述底物溶液1為過氧化氫，所述底物溶液2為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。所述酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度時(shí)使用波長(zhǎng)為400～550nm，優(yōu)選波長(zhǎng)450nm。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，一種抗增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)抗體定量試劑盒，進(jìn)一步地試劑盒包含酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、樣品稀釋液、生物素標(biāo)記抗體稀釋液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液、生物素標(biāo)記抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素、底物溶液、濃洗滌液、終止液。

所述標(biāo)準(zhǔn)品為粉末狀固體或溶液狀態(tài)，如果為溶液形式，其濃度分別為0ug/L，0.03ug/L，0.06ug/L，0.12ug/L，0.24ug/L，0.48ug/L。優(yōu)選粉末固體。

所述終止液為HCl或H2SO4，優(yōu)選H2SO4，更優(yōu)選H2SO4濃度為4M。所述底物溶液包含底物溶液1和底物溶液2，所述底物溶液1為過氧化氫，所述底物溶液2為四甲基聯(lián)苯胺(TMB)。

所述試劑盒的反應(yīng)原理為：用純化的抗體包被酶標(biāo)板，制成固相載體，往包被抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)抗體的酶標(biāo)板中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物素化的抗PCNA抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的親和素，經(jīng)過洗滌液徹底洗滌后用底物溶液顯色。四甲基聯(lián)苯胺(TMB)在過辣根過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在終止液的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(OD值)，計(jì)算樣品濃度。

所述酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度時(shí)選擇波長(zhǎng)為400～550nm，優(yōu)選波長(zhǎng)450nm。

具體的使用方法采用如下步驟：

實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1、配置標(biāo)準(zhǔn)液：用樣品稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品，濃度配成0.48ug/L、0.24ug/L、0.12ug/L、0.06ug/L、0.03ug/L、0ug/L，其中0ug/L為不含標(biāo)準(zhǔn)品的樣品稀釋液。

2、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?00ul，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品100ul，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。

3、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液100ul(取1ul生物素標(biāo)記抗體加99ul生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時(shí)內(nèi)配制)，37℃,60分鐘。

4、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

5、每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液(同生物素標(biāo)記抗體工作液)100ul，37℃，60分鐘。

6、溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350ul/每孔，甩干。

7、依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光顯色(30分鐘內(nèi)，此時(shí)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止)。

8、依序每孔加終止溶液50ul，終止反應(yīng)(此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

9、用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD值)。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

10、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將樣品反應(yīng)后的吸光度與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，確定樣品濃度。并乘以稀釋倍數(shù)，既得到原樣品濃度。

上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了示例性描述，顯然本發(fā)明具體實(shí)現(xiàn)并不受上述方式的限制，只要采用了本發(fā)明的方法構(gòu)思和技術(shù)方案進(jìn)行的各種改進(jìn)，或未經(jīng)改進(jìn)直接應(yīng)用于其它場(chǎng)合的，均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。