專(zhuān)利名稱(chēng)：用蠶表達(dá)丙肝抗原制備口服藥物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類(lèi)藥物技術(shù)領(lǐng)域。
全世界約1％人口感染丙型肝炎病毒(HCV)，約50％以上的慢性肝炎是由HCV感染引起的，世界各地的流行病學(xué)研究表明，大約90％的輸血后肝炎均由HCV引起，HCV是一種十分嚴(yán)重的肝病，是誘發(fā)肝硬化、肝癌的重要因素。目前，我國(guó)丙肝感染者約有3000萬(wàn)人，還有上升的趨勢(shì)。
70年代初期，美國(guó)首先發(fā)現(xiàn)輸血后肝炎病例，既非甲肝亦非乙肝，英國(guó)發(fā)生因注射血友病因子Ⅷ濃縮劑或血透后此類(lèi)肝炎的持續(xù)暴發(fā)。1975年Feinsten等首先證實(shí)這種肝炎為非甲非乙型肝炎，即丙肝(HCV)的存在。1989年，Kuo和Choo等用酵母來(lái)表達(dá)HCV的cDNA片段，與HCV病人的血清進(jìn)行反應(yīng)來(lái)篩選HCV抗原，發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物能與HCV抗體反應(yīng)，從而捕獲到能表達(dá)HCV抗原的cDNA克隆，并與人體基因組和甲肝(HAV)和乙肝(HBV)沒(méi)有交叉雜交。Choo和Kuo等同年用隨機(jī)引物法建立了HCV的全cDNA文庫(kù)，用HCV血清來(lái)篩選抗原，獲得一個(gè)互補(bǔ)的DNA克隆，并能編碼HCV抗原，證明HCV基因組為一個(gè)RNA片段，大小約10000個(gè)堿基，為正鏈RNA。從此揭開(kāi)了HCV分子生物學(xué)研究的序幕。因?yàn)镠CV在血液中含量極少，而且無(wú)法通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)獲得，所以它是完全依賴于基因工程技術(shù)來(lái)研究的人類(lèi)病毒之一，Reyes等1990年從慢性肝炎獼猴的血清中獲得一個(gè)長(zhǎng)為7.5Kb RNA片段，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)氨基酸功能分析認(rèn)為其功能RNA聚合酶，并確認(rèn)其來(lái)源于HCV RNA。Takamigawa等1991年報(bào)道了日本的HCV基因全序列，長(zhǎng)為9416bp，編碼一個(gè)為3010個(gè)氨基酸的大蛋白，5’端的調(diào)控序列為332個(gè)核苷酸，3’端調(diào)控序列為54個(gè)核苷酸，該HCV株與Choo報(bào)道的HCV株的核苷酸同源性為77％，并與黃病毒相似，大蛋白成熟后可形成C、E1、E2、NS2、NS3、NS4a、NS4b和NS5a和NS5b等成份。其中C為外殼蛋白，E為囊膜蛋白，NS為非結(jié)構(gòu)蛋白。HCV存在地區(qū)差異，并具有高度變異的特性，所以形成各個(gè)亞型。Simmonds等1993年和Mellor等1995年根據(jù)HCV基因型和NS5區(qū)的系統(tǒng)發(fā)生將HCV分成6個(gè)亞型。認(rèn)為兩者之間核苷酸相差68-79％者為亞型標(biāo)準(zhǔn)。畢勝利等報(bào)道中國(guó)HCV河北株的全序列與日本相似。河北株和臺(tái)北株系，大小分別為9375bp和9425bp，屬于第Ⅱ亞型。
C蛋白為21kD,E1為31kD,E2為70kD,NS2為23kD,NS3為70kD,NS4a為8kD,NS4b為27kD,NS5a為58kD,NS5b為68kD,HCV抗血清中還存在E2-NS2聯(lián)合蛋白，分子量約在82至83kD。
綜上所述，由于HCV的多變性，因此預(yù)防HCV，研制HCV疫苗相當(dāng)困難，至今還未能成功的實(shí)例。
本發(fā)明的目的是提供一種以家蠶為生物反應(yīng)器，高效表達(dá)丙肝病毒的結(jié)構(gòu)基因，制備口服疫苗的方法。
本發(fā)明所述的方法以家蠶作為生物反應(yīng)器，通過(guò)家蠶核型多角體病毒表達(dá)系統(tǒng)重組帶有人的丙型肝炎病毒基因，獲得重組的帶丙型肝炎病結(jié)構(gòu)基因的家蠶核型多角體病毒，接種家蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)分離純化，冷凍干燥，以家蠶血液或蛹為填充料配制成口服防治丙肝肝炎的藥物。
PCR方法合成的丙肝基因片段為C+E1+E2，克隆進(jìn)入pUC19的SmaⅠ位點(diǎn)，獲得重組克隆pUCVCE，基因長(zhǎng)為2430bp，克隆進(jìn)入到pUBM-4載體中，在BmNPV多角體啟動(dòng)子的直接控制下，與野生病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過(guò)重組空斑挑選得重組家蠶核型多角體病毒，表達(dá)量為0.5mg/蠶，0.6mg/蛹。
接種重組病毒于家蠶幼蟲(chóng)、蛹、蛾的高效表達(dá)丙型肝炎結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)過(guò)分子篩和MonoQ純化的含量為80％，分子量分別為75kD和50kD。
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明的內(nèi)容用兩個(gè)特異性的引物，我們擴(kuò)增了河北株HCV的C+E1+E2基因，大小約2430bp。并克隆到pUC19中，重組質(zhì)粒稱(chēng)為pUHCVCE。將重組質(zhì)粒pUHCVCE進(jìn)行亞克隆，并測(cè)定了全序列，序列與畢勝利報(bào)道的同源性為97％(PCR及測(cè)序技術(shù)方法詳見(jiàn)《分子克隆》，科學(xué)出版社，1995)。將所獲得的基因克隆到家蠶表達(dá)載體pUBM-4(申請(qǐng)人自行構(gòu)建，病毒學(xué)報(bào)，1993)的EcoRⅤ和BglⅡ位點(diǎn)，與野生型病毒共轉(zhuǎn)染，在家蠶Bm-N細(xì)胞中進(jìn)行重組(病毒重組技術(shù)按Summers等方法，Texas Agricultural Experimenl Station,USA1987)。
經(jīng)過(guò)12輪重組篩選，ELISA鑒定證明純化的病毒已表達(dá)了C+E1+E2基因。PCR檢測(cè)的結(jié)果，說(shuō)明重組病毒已帶有丙肝的C+E1+E2外源基因。該重組病毒稱(chēng)之為BmNPV(C+E)。
以不同量的合成肽(22肽RRGPRLGVRAPRKTSERSQPRG)。確定能抑制≥50％0.D.值作相對(duì)比較，估算抗原表達(dá)量，結(jié)果表明蛹體在感染72h后有較高的表達(dá)量。隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量平衡稍有降低。以72h樣品經(jīng)1∶10稀釋后相當(dāng)于肽20μg/ml抑制的O.D.值來(lái)計(jì)算，表達(dá)量為20-200μg/ml，則每蛹體表達(dá)量推算為60-600μg/ml。蠶的最高表達(dá)時(shí)間為4-5天，表達(dá)量為100-500μg/蠶。
用3萬(wàn)頭五齡起蠶，每頭人工接種重組病毒使之發(fā)病，5天后收集蠶血清共20000ml，每瓶500ml貯存于-20℃。
蠶血清先經(jīng)5000rpm離心1小時(shí)，取上清在25000rpm離心30分鐘，經(jīng)硫酸銨沉淀后上Sephadex G100柱分離，每次收集樣品均經(jīng)ELISA測(cè)活，確定其活性存在，并通過(guò)陰陽(yáng)性血清分別測(cè)定，篩選活性峰。
將過(guò)Sephadex G100柱的活性部分混合后，上MonoQ柱(高25cmφ=1cm)，流速0.5ml/分鐘，5ml/管收集。先用20mM Tris-HCl,pH7.5緩沖液淋洗，當(dāng)沒(méi)有蛋白被洗脫下來(lái)時(shí)，再用75ml pH7.5 20mM Tris-HCl緩沖液+75ml含1M NaCl的緩沖液進(jìn)行線性梯度洗脫。據(jù)計(jì)算及ELISA結(jié)果產(chǎn)物的純度在80％左右。在蠶、蛹、蛾中表達(dá)的丙肝抗原，經(jīng)過(guò)過(guò)濾(100KD超濾)，30000rpm離心后經(jīng)冷凍干燥后，在無(wú)菌條件下裝入膠囊制成口服藥物。
采用本發(fā)明所述方法制備的丙肝抗原口服藥物(簡(jiǎn)稱(chēng)BHC)，其藥效如下將BHC(含量2ml)給藥8周齡SD大鼠，每只SD大鼠平均體重為200g，連續(xù)給藥4周，采血后用HCV抗體檢測(cè)試劑盒測(cè)抗體(檢測(cè)方法按上海復(fù)華公司試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，檢測(cè)的結(jié)果如表1、表2所示。結(jié)果表明鼠體內(nèi)產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗體。
表1給藥BHC后4周SD大鼠血的HCV抗體水平檢測(cè)
表2給藥BHC后4周SD大鼠的HCV抗體水平檢測(cè)
將4周齡，平均體重16～18g的BalB/C小鼠，雌雄各半，每天給藥(含量500μl)連續(xù)4周，每天一次4周后采血，用HCV抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果如表3所示(檢測(cè)方法按衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所生產(chǎn)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，結(jié)果表明雌雄個(gè)體80％以上均產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗體水平，相當(dāng)于丙肝感染者的抗體水平，說(shuō)明BHC口服劑型的HCV抗原可以通過(guò)腸道被老鼠吸收，并具有抗原活性，能在體內(nèi)產(chǎn)生較強(qiáng)的抗體，產(chǎn)生了免疫應(yīng)答。
表3
檢測(cè)條件酶標(biāo)板為已包被好的標(biāo)準(zhǔn)丙肝測(cè)活板，一抗稀釋度為1∶100，二抗稀釋度為1∶3000，底物為鄰苯二胺，以稀釋液作對(duì)照、檢測(cè)時(shí)間96.10.7。機(jī)型5001型酶標(biāo)儀本發(fā)明所述的丙肝口服藥物的方法與現(xiàn)有技術(shù)相比，原料易得，生產(chǎn)成本低，具有良好的預(yù)防丙型肝炎療效，具有十分重大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
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1．一種用蠶表達(dá)丙肝病毒蛋白制備口服藥物的方法，其特征在于以家蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾作為生物反應(yīng)器，將人的丙型肝炎病毒基因重組進(jìn)入家蠶核型多角體病毒表達(dá)系統(tǒng)，獲得重組的帶丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)基因的家蠶核型多角體病毒，接種家蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾進(jìn)行表達(dá)，所獲得的表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)分離純化，冷凍干燥，以家蠶血液、蛹和蛾為填充料配制成口服防治丙型肝炎的藥物或純化產(chǎn)物制成注射藥物。
2．根據(jù)權(quán)利要求1，所述的方法，其特征在于將PCR方法合成的丙肝C+E1+E2基因片段，克隆進(jìn)入pUC19的SmaⅠ位點(diǎn)，獲得重組克隆pUCVCE，基因長(zhǎng)為2430bp，克隆進(jìn)入到pUBM-4載體中，在BmNPV多角體啟動(dòng)子的直接控制下，與野生病毒DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，通過(guò)重組空斑挑選得重組家蠶核型多角體病毒。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于接種重組病毒于家蠶幼蟲(chóng)、蛹、蛾的高效表達(dá)丙型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白，經(jīng)過(guò)分子篩和MonoQ純化的含量為80％，分子量分別為75kD和50kD。
4．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3，表達(dá)所生產(chǎn)的丙型肝炎病毒蛋白，與家蠶血液、蛹和蛾的主要成分，經(jīng)冷凍干燥后，制成膠囊或片劑經(jīng)鈷60滅菌，成為防治丙型肝炎的藥物或疫苗。
5．根據(jù)權(quán)利要求1、2、3、4，本專(zhuān)利應(yīng)包括任何其它途徑所獲得的丙肝抗原制成口服藥物或疫苗的途徑。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)制藥工程中的基因工程生產(chǎn)多肽類(lèi)藥物技術(shù)領(lǐng)域。以家蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾作為生物反應(yīng)器,通過(guò)家蠶核型多角體病毒表達(dá)系統(tǒng)重組帶有人的丙型肝炎病毒基因,將獲得的重組病毒,接種家蠶幼蟲(chóng)、蛹和蛾進(jìn)行表達(dá),經(jīng)分離純化,冷凍干燥,制成口服預(yù)防丙型肝炎的藥物,首次實(shí)現(xiàn)丙肝抗原口服藥物的發(fā)明。與現(xiàn)有技術(shù)相比,原料易得,生產(chǎn)成本低,預(yù)防效果良好,具有十分重大的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/51GK1218691SQ9812461
公開(kāi)日1999年6月9日 申請(qǐng)日期1998年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月5日
發(fā)明者張耀洲, 吳祥甫, 杜廣希 申請(qǐng)人:浙江農(nóng)業(yè)大學(xué), 中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所, 浙江海寧絲綢集團(tuán)有限責(zé)任公司