恩諾沙星抗原合成方法及恩諾沙星-IgY抗體制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域中的特異性IgY的制備和應(yīng)用，具體涉及一種恩諾沙星 抗原合成方法及恩諾沙星-IgY抗體制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 恩諾沙星為合成的第三代喹諾酮類抗菌藥物，為畜禽和水產(chǎn)專用的喹諾酮類抗菌 藥物，具有抗菌譜廣、滲透性強、價格低廉等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于畜禽和水產(chǎn)疾病預(yù)防和治 療。但是其長期使用會產(chǎn)生不良反應(yīng)，同時畜禽類產(chǎn)品中殘留的問題也變得日益突出。 [0003] 目前有些國家和組織已經(jīng)禁止其使用，有些國家也對其在畜禽產(chǎn)品中的殘留量進(jìn) 行了規(guī)定。而在我國針對畜禽食品中恩諾沙星的殘留檢測的標(biāo)準(zhǔn)還不健全，因此建立一套 快速、簡便、準(zhǔn)確的針對畜禽產(chǎn)品中恩諾沙星殘留的方法具有重要的意義。
[0004] 現(xiàn)階段，針對恩諾沙星殘留的檢測以高效液相色譜法（HPLC)、超高效液相色譜 (UPLC)法等理化手段為主，這些方法雖然靈敏度較高，但是相應(yīng)的成本也較高，對專業(yè)技術(shù) 要求較高，并不適合大量樣本的快速檢測，而以ELISA為基礎(chǔ)建立的檢測方法操作簡便、快 速、靈敏、不需要專業(yè)人員操作，具有良好的發(fā)展前景。
[0005] 卵黃抗體（egg yolk antibody，IgY)抗體是通過對禽類（雞）免疫注射特定抗原， 從而在體內(nèi)產(chǎn)生IgY，經(jīng)血液由母體傳遞到卵黃內(nèi)，在卵黃中富集，進(jìn)而通過分離卵黃，獲得 的特異性多克隆抗體。相對于從哺乳動物血清中獲得抗體，避免了常規(guī)的動物采血，減輕了 動物的痛苦，同時通過卵黃獲得抗體，產(chǎn)量大，制備簡單，每枚蛋中可以提純50~100mg的 抗體，且母雞易于飼養(yǎng)，費用低，便于大規(guī)模的生產(chǎn)特異性抗體，經(jīng)濟優(yōu)勢明顯。
[0006] 與哺乳動物免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)相似，IgY的Fab片段包含抗 原結(jié)合位點，F(xiàn)c片段包含的位點有補體激活功能、調(diào)理素作用和致敏過敏反應(yīng)作用等功能。 但是其結(jié)構(gòu)同哺乳動物有些不同，相對于IgG，IgY重鏈的氨基酸殘基數(shù)量多于IgG，且重鏈 恒定區(qū)（CH區(qū)）數(shù)量多于IgG，而輕鏈小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG， 使IgY相對于IgG更適合用于治療制劑。IgY等電點（PI)在5. 7~7. 6之間，在pH4. 0~ 11. 0時IgY穩(wěn)定，比兔IgG對酸變性更為敏感，當(dāng)pH值從4降到3時，IgY活性迅速喪失， 而IgG對此只受到微小影響；IgY在低溫下儲存時性能較穩(wěn)定，室溫下可保持6個月的活 性，4°C儲存6 ~7年活性下降僅 5% (Jaradat Z W，Marquardt R R.2000.Studies on the stability of chicken IgY in different sugars, complex carbohydrates and food materials. Food and Agricultural Immunology，12(4) :263_272) ;IgY抗胃蛋白酶消化的 穩(wěn)定性較牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力則較強（Shimizu M，Nagashima H，Sano K, et al. 1992. Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G. Biosci Biotechnol Biochem，56(2):270-274)〇
[0007] 由于哺乳動物和雞抗體特異性的差異，相對于哺乳動物IgG，卵黃抗體應(yīng)用于檢測 也具有多方面的優(yōu)勢如：卵黃抗體與風(fēng)濕因子、人類抗鼠抗體（HAMA)沒有交叉反應(yīng)，無補 體系統(tǒng)活性和異質(zhì)性凝集素，且不結(jié)合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反應(yīng)。此外，禽類針對 保守性強的蛋白質(zhì)往往能引發(fā)較哺乳動物抗體更強烈的抗體反應(yīng)，成為有關(guān)抗體研發(fā)的重 要選擇因素。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的第一個目的在于公開了恩諾沙星抗原 合成方法。本發(fā)明的第二個目的在于公開了恩諾沙星-IgY抗體制備方法。
[0009] 技術(shù)方案：恩諾沙星抗原合成方法，包括以下步驟：
[0010] (1)分別稱取5mg恩諾沙星、lOmgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，室溫下在磁 力攪拌器上攪拌24h，獲得反應(yīng)液，將反應(yīng)液以2000r/min離心10min，去沉淀，制成恩諾沙 星活化中間產(chǎn)物；
[0011] ⑵稱取l〇mg的牛血清白蛋白，溶于5ml的pH為7. 4的PBS中，在磁力攪拌器上 邊攪拌邊將步驟（1)得到的恩諾沙星活化中間產(chǎn)物逐滴加入到牛血清白蛋白-PBS溶液中， 室溫下在磁力攪拌器上攪拌12~16h得到反應(yīng)液；
[0012] (3)將步驟（2)得到的反應(yīng)液置于透析袋中，透析袋的透析液PBS，4°C透析48h，每 隔8h換透析液一次；
[0013] (4)透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)液體離心，去沉淀，即得到恩諾沙星抗原。
[0014] 恩諾沙星-IgY抗體制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0015] (1)合成恩諾沙星抗原，
[0016] (11)分別稱取5mg恩諾沙星、lOmgNHS、15mgEDC溶解于1ml的DMF中，室溫下在磁 力攪拌器上攪拌24h，獲得反應(yīng)液，將反應(yīng)液以2000r/min離心10min，去沉淀，制成恩諾沙 星活化中間產(chǎn)物；
[0017] (12)稱取10mg的牛血清白蛋白，溶于5ml的pH為7.4的PBS中，在磁力攪拌器 上邊攪拌邊將步驟（11)得到的恩諾沙星活化中間產(chǎn)物逐滴加入到牛血清白蛋白-PBS溶液 中，室溫下在磁力攪拌器上攪拌12~16h得到反應(yīng)液；
[0018] (13)將步驟（12)得到的反應(yīng)液置于透析袋中，透析袋的透析液PBS，4°C透析48h， 每隔8h換透析液一次；
[0019] (14)透析結(jié)束后，將透析袋內(nèi)液體離心，去沉淀，即得到恩諾沙星抗原；
[0020] (2)制備含抗體的免疫蛋，
[0021] (21)、向20周禽類初次注射步驟（14)合成得到的恩諾沙星抗原，抗原用量為 300 y g/只，此后的12周中，每隔三周再進(jìn)行一次抗原注射，抗原用量為250 y g/只；
[0022] (22)、收集注射恩諾沙星抗原的禽類所生產(chǎn)的蛋，并做標(biāo)記于4°C保存；
[0023] (3)將步驟（22)收集的蛋分離，得到卵黃和卵清，提取卵黃獲得恩諾沙星-IgY抗 體。
[0024] 作為本發(fā)明中恩諾沙星-IgY抗體制備方法的一種優(yōu)選方案：步驟（3)包括以下步 驟：
[0025] (31)收集注射恩諾沙星抗原的禽類所生產(chǎn)的蛋，進(jìn)行卵黃與卵清分離，收集卵黃， 將10ml卵黃使用20mlPBS稀釋得到稀釋液；
[0026] (32)向步驟（31)得到的稀釋液中加入1~2ml質(zhì)量體積比為3. 5%的PEG-6000， 攪拌2~5小時后，室溫下置于搖床搖晃30分鐘后得到混合液；
[0027] (33)將步驟（32)得到的混合液離心，收集上清，過濾，向濾液中加入等體積的質(zhì) 量體積比為8. 5%的PEG-6000,攪拌2~5小時后，室溫下置于搖床搖晃30分鐘得到混合 液；
[0028] (34)將步驟（33)得到的混合液離心，棄去上清液，沉淀使用10毫升的PBS懸浮后 得到重懸液，再向重懸液中加入等體積的質(zhì)量體積比為12%的PEG-6000,攪拌2~5小時 后，室溫置于搖床上搖晃30分鐘，再進(jìn)行離心獲得沉淀物；
[0029] (35)將步驟（34)獲得的沉淀物使用1. 2毫升PBS溶解后，先使用透析帶進(jìn)行透 析，再使用PBS透析12~16h，收集透析液中的恩諾沙星-IgY抗體即可。
[0030] 進(jìn)一步地，所述禽類為雞。
[0031] 進(jìn)一步地，恩諾沙星-IgY抗體在_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 有益效果：本發(fā)明公開的恩諾沙星抗原合成方法及恩諾沙星-IgY抗體制備方法 具有以下有益效果：
[0033] 可有效增強抗體一一抗酸性橙II IgY在初免20天左右，開始產(chǎn)生抗體，在初免后 90天左右，抗體滴度達(dá)到最高，即1 :102400,停止加強免疫后，