擬南芥抗性基因cimt1、其編碼蛋白及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及擬南芥抗性基因cnm、其編碼蛋白及應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前，世界上的許多耕地都有輕度的重金屬污染，這些重金屬污染物主要有鎘、 銅、鋅、鎳、鈷、鉛、砷等。這些重金屬污染主要是由于長(zhǎng)期使用磷酸肥料、污水處理不利、工 業(yè)廢料的污染、農(nóng)業(yè)灌溉的不科學(xué)造成的。植物體在面對(duì)這些重金屬脅迫時(shí)一方面會(huì)產(chǎn)生 活性氧（R0S)。在植物中，大多數(shù)金屬產(chǎn)生活性氧（R0S)是重金屬毒性的間接作用結(jié)果。這 種間接的作用包括它們與抗氧化系統(tǒng)的反應(yīng)，擾亂電子傳遞鏈，或者擾亂新陳代謝的必需 元素的合成。植物體中，重金屬脅迫所造成的另一個(gè)較嚴(yán)重的結(jié)果就是脂質(zhì)的過(guò)氧化，這種 脂質(zhì)的過(guò)氧化可以導(dǎo)致生物膜的損傷。丙二醛（MDA)是生物膜中多不飽和脂肪酸的一種重 要的分解產(chǎn)物，可以用來(lái)作為生物膜氧化脅迫的指示劑。重金屬會(huì)導(dǎo)致植物體出現(xiàn)很多的 病癥。以鎘為例，鎘（Cd)是一種高毒性的重金屬。鎘處理會(huì)抑制植物的很多生理過(guò)程，比 如光合作用、細(xì)胞延長(zhǎng)、固氮和礦物營(yíng)養(yǎng)吸收等。耕地中鎘的正常含量不能超過(guò)l〇〇mg/kg。 植物體處于鎘脅迫時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)光合效率降低、水分吸收降低以及營(yíng)養(yǎng)吸收降低等性狀。植 物在含有過(guò)多的隔的土壤中，會(huì)出現(xiàn)萎黃病、生長(zhǎng)抑制并最終導(dǎo)致植物體死亡。
[0003] 玉米（學(xué)名：Zea mays)是重要的糧食作物和飼料來(lái)源，也是全世界總產(chǎn)量最高的 糧食作物，目前也是我國(guó)種植面積最大的農(nóng)作物?，F(xiàn)代科技條件下，玉米深加工被廣泛應(yīng)用 于食品工業(yè)，醫(yī)藥工業(yè)和化學(xué)工業(yè)，具有廣闊的應(yīng)用前景。但是，隨著耕地污染的加重，各種 主要的農(nóng)作物的產(chǎn)量，包括玉米在內(nèi)都受到嚴(yán)重的影響。所以，研究玉米中的抗性基因及其 功能，對(duì)于提高玉米以及其他糧食作物的增產(chǎn)具有重大意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供擬南芥抗性基因cnm、其編碼蛋白及應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 擬南芥cnm蛋白或其編碼基因或含有該編碼基因的重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞系、轉(zhuǎn)基因植物株系在培育抗逆植物中的應(yīng)用，其中，所述擬南芥cnm蛋白如seqid NO. 6所示，或者是SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個(gè)或多個(gè)氨基 酸和/或修飾后且具有提尚植物抗逆功能的序列。
[0007] 擬南芥CIMT1蛋白或其編碼基因在抗逆植物輔助育種中的應(yīng)用，其中，所述擬南 芥cnm蛋白如EQ ID N0. 6所示，或者是SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和 /或增加一個(gè)或多個(gè)氨基酸和/或修飾后且具有提高植物抗逆功能的序列。
[0008] 所述抗逆包括抗重金屬污染、抗氧化脅迫、抗高溫脅迫、抗低溫脅迫、抗鹽堿、抗 旱、抗病蟲害中的至少一種。
[0009] 所述重金屬包括鎘、汞、金、銀、銅、鐵、鉛、砷、鉻中的至少一種。
[0010] 一種抗逆植物的培育方法，包括將擬南芥cnm基因轉(zhuǎn)入受體植物中，得到轉(zhuǎn)基 因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物與受體植物相比，其對(duì)逆境的抗性提高；所述擬南芥cnm基因的 核苷酸序列如SEQ ID N0. 5所示，或者為SEQ ID N0. 5的同義密碼子突變序列。
[0011] 所述逆境包括：重金屬污染、氧化脅迫、高溫、低溫、高鹽堿、干旱、病蟲害中的至少 一種。
[0012] 所述重金屬包括鎘、汞、金、銀、銅、鐵、鉛、砷、鉻中的至少一種。
[0013] 擬南芥B0XS2順式作用元件或其激活劑在培育抗逆植物中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明的有益效果是：
[0015] 本發(fā)明在擬南芥中克隆了鎘抗性基因cnm，它可以被cd所大量誘導(dǎo)，表達(dá)過(guò)量 的cnm足以使擬南芥產(chǎn)生抗cd的表型，這說(shuō)明cnm在重金屬的抗性調(diào)控中起到重要的 作用。因此，CIMT1基因具有極大的潛力應(yīng)用于培育具有抗鎘特性的轉(zhuǎn)基因作物中，從而提 高糧食作物的產(chǎn)量。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1為Zm0XS2b與Zm02Ll基因PCR產(chǎn)物的1 %的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0017] 圖2為玉米中Zm0XS2b與Zm02Ll的基因結(jié)構(gòu)示意圖（藍(lán)色長(zhǎng)方型：ANKYRIN重復(fù) 序列；紅色長(zhǎng)方形：鋅指結(jié)構(gòu)域；綠色方框：多聚谷氨酰胺序列；倒三角：預(yù)測(cè)出核序列；黑 色長(zhǎng)條:AT3片段；所有蛋白編碼區(qū)中并不存在內(nèi)含子。數(shù)字表示從轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)開(kāi)始的 DNA基因組位置）。
[0018] 圖3為qRT-PCR檢測(cè)的Zm0XS2b與Zm02Ll的相對(duì)表達(dá)量（生長(zhǎng)15天的玉米植株 使其處于0或者200 y M CdCl2處理下，誤差線表示三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。
[0019] 圖4為滴板檢測(cè)Zm0XS2b，Zm02Ll、AT3片段在粟酒裂殖酵母中的組成型表達(dá)（用 轉(zhuǎn)化空載體的酵母作為負(fù)對(duì)照，三角形表示，濃度依次十倍稀釋）。
[0020] 圖5為擬南芥種子種植在水平放置的1/2MS與含有75 y M CdCl2濃度的1/2MS培 養(yǎng)基上11天（每種轉(zhuǎn)基因植株的三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系被用來(lái)檢測(cè)）。
[0021] 圖6為生長(zhǎng)在1/2MS與含有75 yM 0(1(：12的1/2MS培養(yǎng)基上11天的擬南芥幼苗 (5棵）的鮮重（每個(gè)株系不少于20棵幼苗被用來(lái)測(cè)量，誤差線表示三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo) 準(zhǔn)偏差）。
[0022] 圖7為擬南芥種子種植在豎直放置的1/2MS與含有75 y M CdCl2濃度的1/2MS培 養(yǎng)基上11天（每種轉(zhuǎn)基因植株的三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系被用來(lái)檢測(cè)）。
[0023] 圖8為差異表達(dá)基因的韋恩圖（括號(hào)上的藍(lán)色數(shù)字表示上調(diào)的差異基因，括號(hào)下 的黑色數(shù)字表示下調(diào)差異基因，括號(hào)中的數(shù)字是某一部分差異基因的總量，括號(hào)旁邊的紫 色的數(shù)字表示一個(gè)基因在C1部分中下調(diào)，但是在C2部分中上調(diào)）。
[0024] 圖9為Cl、C2中差異基因交集聚類分析的熱圖（表達(dá)的差異用log2的值表示。 紅色表示與對(duì)照樣品相比上調(diào)的基因，綠色表示與對(duì)照樣品相比下調(diào)的基因）。
[0025] 圖10為8個(gè)差異基因的表達(dá)情況（柱狀圖表示轉(zhuǎn)基因植株與野生型轉(zhuǎn)錄水 平的差異倍數(shù)，誤差線代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Student' s t test的P值：脅 迫處理的樣品與非脅迫處理的樣品的比較；a:0. 01〈P < 0. 1 ;b :0. 001〈P < 0. 01 ;c : 0? 0001〈P < 0? 001) 〇
[0026] 圖11為Zm0XS2b與Zm02Ll蛋白激活含有B0XS2的啟動(dòng)子，蛋白質(zhì)與啟動(dòng)子的互 作檢測(cè)圖（侵染兩天之后檢測(cè)熒光強(qiáng)度LUC與rLUC的比值；黑色方框：預(yù)測(cè)的B0XS2序列； 數(shù)字：相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的DNA序列位置；B0XS2上方的數(shù)字：每個(gè)B0XS2的起始核苷酸 位置；誤差線：三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。
[0027] 圖12為轉(zhuǎn)基因植物WT(DEGs)與野生型的相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比（含有8個(gè)不同的 DEGs的35S: :DEG重組載體分別轉(zhuǎn)入野生型中，每種轉(zhuǎn)基因植物中的3個(gè)獨(dú)立的株系在 1/2MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)11天，縱坐標(biāo)表明了這些差異基因在轉(zhuǎn)基因植物中的相對(duì)表達(dá)量相比 與在野生型中表達(dá)量的倍數(shù)，誤差線表示兩次技術(shù)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差）。
[0028] 圖13為擬南芥種子種植在水平放置的1/2MS與含有75 y M CdCl2濃度的1/2MS培 養(yǎng)基上12天。三個(gè)獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因株系被用來(lái)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次以上，代表性的結(jié)果被 用來(lái)展示。
[0029] 圖14為生長(zhǎng)在1/2MS與含有75 y M 0(1(：12的1/2MS培養(yǎng)基上12天的擬南芥幼苗 (5棵）的鮮重（個(gè)株系不少于20棵幼苗被用來(lái)測(cè)量，誤差線表示三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn) 偏差）。
[0030] 圖15為Zm0XS2b與Zm02Ll蛋白結(jié)合(HMT1啟動(dòng)子中B0XS2附近的區(qū)域。用染色 體免疫共沉淀（ChIP)的技術(shù)來(lái)檢測(cè)Zm0XS2b與Zm02Ll蛋白。根據(jù)CIMT1的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的 引物組與ACT2的啟動(dòng)子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR檢測(cè)。黑色小方框表示預(yù)測(cè)的 B0XS2序列CTTCTTGTC ;大括號(hào)表示qPCR檢測(cè)的片段。數(shù)據(jù)顯示的是三個(gè)獨(dú)立生物學(xué)實(shí)驗(yàn) 的平均值。誤差線表示三次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。
[0031] 圖16為Zm0XS2b與Zm02Ll蛋白結(jié)合DEGs啟動(dòng)子中B0XS2附近的區(qū)域。用染色 體免疫共沉淀（ChIP)的技術(shù)來(lái)檢測(cè)Zm0XS2b與Zm02Ll蛋白。根據(jù)8個(gè)選擇的差異表達(dá) 基因的啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的引物組與ACT2的啟動(dòng)子的引物被用作免疫共沉淀后的qPCR檢測(cè)。將 每個(gè)樣品（DNA與蛋白復(fù)合物）與a-Flag抗體或者沒(méi)有抗體的對(duì)照（NoAb)共沉淀后所得 的CP值標(biāo)準(zhǔn)化到其樣品的inpu