控制植物分枝的擬南芥基因AtTIE1及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種控制植物分枝的擬南芥基因及 該基因的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 分枝是植物的重要特性，在很大程度上，分枝影響植物的形態(tài)建成。單子葉植物的 分蘗是一種特殊的分枝。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，適宜的分蘗數(shù)目與糧食作物的高產(chǎn)密切相關(guān)。
[0003] 植物的分枝來源于葉腋中的側(cè)芽。盡管側(cè)生分生組織與莖頂端分生組織具有同樣 的發(fā)育潛力，但是側(cè)芽經(jīng)常形成具有更少葉片的休眠芽。一旦環(huán)境條件適合，休芽便可以被 激活，形成分枝（Journal of experimental botany，2007，vol. 59:67-74)。分枝發(fā)育的調(diào) 控賦予植物對(duì)于持續(xù)變化的環(huán)境條件的可塑性，這一過程受到嚴(yán)格而精細(xì)的調(diào)控。
[0004] 分枝的形成過程大致分為兩個(gè)階段：腋芽處側(cè)生分生組織的起始和側(cè)芽的發(fā)生 (Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003,vol. 100:11765-11770)。側(cè) 芽在什么位置發(fā)生以及側(cè)芽是發(fā)育成分枝還是處于休眠狀態(tài)受到多種內(nèi)源和外源信號(hào)的 調(diào)控，這些信號(hào)從其被感知的部位轉(zhuǎn)導(dǎo)到側(cè)芽（The Plant cell, 2007, vol. 19:458-472)。 在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，植物激素發(fā)揮著重要的作用。其中，生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素和獨(dú)腳金內(nèi)酯 對(duì)于調(diào)控側(cè)生分生組織的起始和側(cè)枝的發(fā)育的作用最為重要。
[0005] 生長(zhǎng)素是第一個(gè)被報(bào)道與分枝調(diào)控相關(guān)的植物激素。1934年，人們發(fā)現(xiàn)植物的頂 端能夠抑制側(cè)枝的發(fā)生，這種現(xiàn)象稱為"頂端優(yōu)勢(shì)"。這種現(xiàn)象至少在一定程度上受到生長(zhǎng) 素的調(diào)控，因?yàn)樽柚股L(zhǎng)素的極性運(yùn)輸或者移除植物的頂端都能促進(jìn)側(cè)芽的發(fā)生，并且這 種促進(jìn)作用可以被外加的生長(zhǎng)素抑制。但是，很多實(shí)驗(yàn)證明生長(zhǎng)素調(diào)控側(cè)枝發(fā)育的作用是 間接的。諸多研究表明生長(zhǎng)素可能通過下調(diào)細(xì)胞分裂素的合成、限制細(xì)胞分裂素向芽運(yùn)輸 來抑制分枝發(fā)育。同時(shí)獨(dú)腳金內(nèi)酯通過影響主莖中生長(zhǎng)素的運(yùn)輸能力來調(diào)節(jié)側(cè)芽的生長(zhǎng)。
[0006] 在側(cè)枝發(fā)育的調(diào)控中，多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子參與激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和其他調(diào)控過程， 從而行使著重要的功能。擬南芥REV編碼一個(gè)第三類homeodomain-zip蛋白。它是側(cè)生 分生組織起始所必需的，并且可能在已知的分生組織的調(diào)節(jié)因子，如SHOOT MERISTEMLESS (STM)和 CLAVATA1 (CLVl)的上游發(fā)揮作用（Development, 1995, vol. 121:2723-2735;The Plant Journal, vol. 2001，25:223-236)。LAS是一個(gè)GRAS家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在營(yíng)養(yǎng)生 長(zhǎng)階段調(diào)控側(cè)生分生組織的起始。las突變體在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期，葉腋處幾乎不能形成側(cè)生 分生組織。LAS可能在REV的上游行使作用（Proceedings of the National Academy of Sciences, 2003, vol. 100:11765-11770)。R2R3MYB 基因編碼的 RE⑶LATORS OF AXILLARY MERISTEMS1 (RAXl)，RAX2和RAX3在擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)中均參與調(diào)控側(cè)生分生組 織的發(fā)育。R2R3MYB基因家族不同成員的突變體控制著不同發(fā)育階段的側(cè)生分生組織的形 成（The Plant Cell，2006，vol.l8:586-597;The Plant Cell, 2006, Vol. 18, 598 - 611)。擬 南芥ROX基因編碼一個(gè)bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)早期rox突變體的側(cè)芽形成受到抑 制。ROX在水稻中的同源基因 LAX PANICLE(LAX)和番茄中的同源基因 BAl同樣參與側(cè)生 分生組織的形成（The Plant Journal, 2012, vol. 71:61-70)。此外，有研究表明TCP家族 轉(zhuǎn)錄因子也參與植物分枝的調(diào)控。TBl基因分別在玉米和水稻中負(fù)調(diào)控側(cè)枝的形成，在其 功能缺失突變體中玉米和水稻的分枝數(shù)目顯著增加（Genetics，1995, vol. 141:333-346; Th e Plant Journal; 2003, vol. 33:513-520)。BRCl 基因編碼一個(gè)擬南芥 TCP 家族轉(zhuǎn)錄因子， 在側(cè)芽發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。BRCl的活性與側(cè)芽的產(chǎn)生成負(fù)相關(guān)關(guān)系，并且專一地影 響側(cè)芽的發(fā)育。BRCl響應(yīng)環(huán)境和內(nèi)源的信號(hào)，從而控制側(cè)芽發(fā)生。生長(zhǎng)素和MX途徑通過 BRCl 來促進(jìn)側(cè)芽的休眠 （The Plant Cell, 2007, vol. 19:458-472)。
[0007] 盡管人們已經(jīng)在植物分枝調(diào)控機(jī)制的研究中取得了一定進(jìn)展，但是其調(diào)控機(jī)制仍 然存在很多沒有闡明的問題。本發(fā)明研究表明AtTIEl作為一個(gè)正調(diào)控因子調(diào)控?cái)M南芥分 枝發(fā)育。這在一定程度上加深了人們對(duì)于植物分枝調(diào)控機(jī)制的理解。在模式植物擬南芥中 深入研究分枝發(fā)育的調(diào)控機(jī)制可能為作物育種提供一定的借鑒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供一種控制植物分枝的擬南芥基因及其編碼蛋白，用于改良 植物的株型。
[0009] 本發(fā)明所提供的影響分枝數(shù)目的基因，名稱為AtTIEl，來源于擬南芥 (Arabidopsisthaliana),編碼下述蛋白質(zhì)（i)或（ii):
[0010] (i)序列表中的SEQ ID No: 1所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0011] (ii)序列表中的SEQ ID No: 1氨基酸序列經(jīng)過一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失 或添加而衍生的蛋白質(zhì)，并且所衍生的蛋白質(zhì)具有與（i)所述蛋白質(zhì)相同的功能。序列表 中的SEQ ID No: 1由193個(gè)氨基酸殘基組成，其N端含有一個(gè)核定位信號(hào)KRGK (28-31位 氨基酸殘基)、一段堿性區(qū)域（29-45位氨基酸殘基)和一個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)（47-57位氨基酸殘基)， C端末尾含有一個(gè)EAR轉(zhuǎn)錄抑制基序（188-193位氨基酸殘基)。所述取代、缺失或添加的一 至十個(gè)氨基酸殘基可以是非保守區(qū)域中的氨基酸殘基，其改變不會(huì)對(duì)該蛋白的功能產(chǎn)生影 響。對(duì)氨基酸殘基進(jìn)行取代、缺失或添加的方法，以及對(duì)蛋白功能的檢測(cè)均是本領(lǐng)域技術(shù)人 員所熟知的，通常是利用基因工程的手段對(duì)其編碼基因進(jìn)行突變，然后再表達(dá)出相應(yīng)的蛋 白并檢測(cè)其功能。
[0012] 本發(fā)明的控制植物分枝的擬南芥基因 AtTIEl的核酸序列可以是其cDNA序列，也 可以是基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上一致性且編碼相同功能蛋白的 DNA序列。序列表中SEQ ID N0:2所示的是AtTIEl基因的cDNA序列，SEQ ID N0:3所示的 是AtTIEl基因的基因組DNA序列。
[0013] 本發(fā)明還提供了包含上述核酸序列以及與該核酸序列操作性相連的表達(dá)調(diào)控序 列的表達(dá)載體。在較佳的實(shí)施方案中，所述表達(dá)調(diào)控序列包括組成型高表達(dá)的調(diào)控序列，例 如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供一種改變植物分枝數(shù)目和改造植物株型的方法。
[0015] 應(yīng)用AtTIEl基因可影響擬南芥等植物的分枝數(shù)目，其方法可以是將AtTIEl基 因?qū)胫参锛?xì)胞、組織或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，使所述 AtTIE 1基因在植物中表達(dá)，得到分枝數(shù)目改變的轉(zhuǎn)基因植物。
[0016] 在上述改變植物分枝數(shù)目和改造植物株型的方法中，所述AtTIEl基因既可為所 述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組DNA序列，或者是與這些序列具有90%以上 一致性且編碼相同功能蛋白的DNA序列。與所述序列具有90%以上同源性且編碼相同功能 蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組DNA序列用已知的方法進(jìn)行分離和/或修 飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的 微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且在一些應(yīng)用（例如，反義或共抑制技 術(shù)）中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以 及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
[0017] 本發(fā)明AtTIEl基因或其同源序列可通過植物表達(dá)載體導(dǎo)入植物組織、細(xì)胞或器 官。用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿 菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如Gateway系列載體(如pB7FWG2 等)、pBin系列載體(如pBinl9等)、pjim系列載體(如pjiml9等)、pCAMBIA系列載體(如 PCAMBIA1301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物 中復(fù)制的載體，如pENTR/D-TOPO載體、pUC系列載體或pBluescript系列載體等。
[0018] 使用本發(fā)明AtTIEl基因或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷 酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜 花葉病毒（CAMV) 35S啟動(dòng)子、玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actinl啟動(dòng)子等；所述誘導(dǎo)型 啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ΑΒΑ、乙烯、鹽堿或化學(xué)等誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用 或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用 增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū) 域起始密碼子等，但必須與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯 控制信號(hào)和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可 以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。
[0019] 為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因（GUS基因、 GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（ΝΡΤΠ )基因、 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記物或卡那霉素 標(biāo)記物等）或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因（如抗除莠劑基因）等。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采 用Southern、PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有 目的基因。
[0020] 攜帶有本發(fā)明AtTIEl基因或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過使用原生質(zhì) 體-化學(xué)介導(dǎo)法（Ca2+、PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、 微注射、電激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化 植物細(xì)胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可 包括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。
[0021] 本發(fā)明將編碼AtTIEl基因的核酸序列在擬南芥中過量表達(dá)，并統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植物 的分枝數(shù)目發(fā)現(xiàn)，AtTIEl基因具有增加擬南芥分枝數(shù)目的功能。因此，本發(fā)明所提供的 AtTIEl基因在植物形態(tài)建成的優(yōu)化中有重要的應(yīng)用價(jià)值，利用該基因進(jìn)行分子育種有望培 育出具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值的理想株型的植物。
【附圖說明】
[0022] 圖1顯示了實(shí)施例3通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)TIEl-GFP融合基因在轉(zhuǎn)基因株系3-6 和野生型植株中的表達(dá)水平。
[0023] 圖2顯示了實(shí)施例3中TIEl-GFP融合基因過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系3-6和野生型 具有代表性的植株的分枝表型，圖中所示植株均為成熟植株。
[0024] 圖3顯示