擬南芥過氧化氫酶基因cat的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及擬南芥過氧化氫酶基因以7植物表達(dá)載體及其在制備吸收甲醛能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]甲醛(HCHO)被廣泛的用于化工合成、工業(yè)制造、醫(yī)藥合成等所涉及的化學(xué)領(lǐng)域及其他工業(yè)領(lǐng)域，尤其是在化學(xué)農(nóng)藥及其中間體合成領(lǐng)域甲醛有著舉足輕重的作用?，F(xiàn)代化學(xué)農(nóng)藥的生產(chǎn)過程中不能避免的要產(chǎn)生大量含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水，這些農(nóng)藥生產(chǎn)廢水中普遍含有大量的甲醛以及醇、苯、酚、三聚甲醛、甲縮醛等物質(zhì)，由于廢水中甲醛的存在使得其處理變得十分困難。而且按照國家標(biāo)準(zhǔn)《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)(GB8978-1996)》規(guī)定:二級(jí)排放標(biāo)準(zhǔn)的甲醛含量不得高于2mg/L，所以含甲醛的農(nóng)藥生產(chǎn)廢水要直接排放不僅不符合環(huán)保要求，并且對(duì)動(dòng)植物都具有嚴(yán)重的危害性。由于甲醛在工業(yè)生產(chǎn)中的用途很廣，完全的限制是不現(xiàn)實(shí)的，所以必須對(duì)工業(yè)生產(chǎn)中甲醛廢水進(jìn)行無害化處理。另一方面隨著生活質(zhì)量的不斷提高裝修已成為現(xiàn)代生活的一部分，而裝修所用的材料膠合板、細(xì)木工板、中密度纖維板和刨花板等含有大量HCH0，這是因?yàn)槟壳吧a(chǎn)人造板材使用的多種膠粘劑比如脲醛樹脂、三聚氰甲醛、胺基甲醛樹酯、酚醛樹脂等多以HCHO為主要成分，所以HCHO氣體成為裝修房間中空氣污染的主要化學(xué)物質(zhì)之一。
[0003]HCHO是一種廣泛存在的有毒化學(xué)物質(zhì)，它可以溶于水中以液態(tài)存在，也可以揮發(fā)成為氣體以氣態(tài)形式存在。HCHO可以被還原為甲醇也可以被氧化為甲酸，而這三種物質(zhì)對(duì)生物都具有一定的毒性。其中HCHO由于含有羰基基團(tuán)因此具有較強(qiáng)的親電特征，其具有十分活潑的化學(xué)性質(zhì)能與各種脂類、核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生非特異性反應(yīng)，并能導(dǎo)致生物體內(nèi)各種相關(guān)物質(zhì)失去生物活性。HCHO對(duì)人和動(dòng)物具有較強(qiáng)毒性，它能導(dǎo)致皮膚敏感并能引起皮膚炎癥；HCH0也能進(jìn)入呼吸系統(tǒng)并引起該系統(tǒng)出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)，通過血液循環(huán)被運(yùn)輸?shù)饺硪鸱尾坎∽?、肝臟器官損傷、免疫調(diào)節(jié)能力下降等。如果我們長期使用含有HCHO的水，會(huì)引發(fā)胃部不適、免疫障礙、貧血以及引起神經(jīng)性病變，會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生急性或慢性的危害。如果人們暫時(shí)逗留在含有低劑量HCHO氣體的室內(nèi)時(shí)會(huì)使人產(chǎn)生不舒服的感覺，而長時(shí)間呼吸微量的HCHO會(huì)導(dǎo)致慢性呼吸道疾病，鼻咽癌、結(jié)腸癌、腦癌、月經(jīng)紊亂、妊娠綜合癥、新生兒染色體異常、細(xì)胞核的基因突變，DNA單鏈內(nèi)交連和DNA與蛋白質(zhì)交連、白血病、青少年記憶力和智力下降等。當(dāng)房間內(nèi)HCHO氣體濃度升高時(shí)，可刺激人眼使人流眼淚并引起咽喉不適或疼痛。而人體接觸更高濃度HCHO氣體可引起咳嗽、惡心或肺水腫等不良反應(yīng)，如果HCHO氣體濃度達(dá)到30mg/m3時(shí)可致人死亡。相對(duì)于油漆中的苯、甲苯、二甲苯、TD1、VOC等有害物質(zhì)來說，甲醛具有潛伏周期長(3-15年)、隱藏深、分布廣、易揮發(fā)、治理難、危害大等特性。
[0004]H2O2是植物體內(nèi)的一種抗逆信號(hào)因子，在植物體中有雙重作用:一方面，適量的H2O2作為一種信號(hào)，通過誘導(dǎo)一系列防御機(jī)制來保護(hù)植物細(xì)胞免受氧化脅迫；另一方面，過量的H2O2導(dǎo)致過氧化損傷，對(duì)植物體造成傷害。當(dāng)植物受到外界脅迫，如甲醛脅迫，氣體甲醛主要通過植物的氣孔被吸收進(jìn)入植物體內(nèi)。已有研宄證明甲醛脅迫增加植物葉片中H2O2積累，
逆境信號(hào)分子H202、ABA等因素通過影響PM H+ -ATPase的磷酸化水平來影響它與14-3-3蛋白的結(jié)合，從而降低PM H+ -ATPase的活性和氫泵活性，降低了跨質(zhì)膜內(nèi)部的負(fù)電勢(shì)梯度使K+、陰離子等從保衛(wèi)細(xì)胞中流出，細(xì)胞滲透勢(shì)減小，水分從細(xì)胞中排出，膨壓減少，細(xì)胞收縮，氣孔關(guān)閉。而CATs作為過氧化物的重要清除劑，可清除積累在植物體內(nèi)的過量的過氧化氫，減少甲醛脅迫對(duì)植物的傷害。因氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞含有葉綠體，葉綠體是植物細(xì)胞H2O2的最大來源處，本研宄嘗試?yán)霉庹T導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和葉綠體信號(hào)肽(*T)在野生型煙草(WT)葉片的葉綠體中過量表達(dá)擬南芥以7；解除過氧化氫大量積累帶來的負(fù)影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥過氧化氫酶基因CA71的植物表達(dá)載體pk2-PrbcS-*T-U7；所述載體含有擬南芥以堪因的cDNA、卡那霉素篩選標(biāo)記基因(Kan )、光誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子(PrbcS )和葉綠體定位信號(hào)肽(*T )，以堪因cDNA來源于擬南芥，GenBank登錄號(hào)為145353262，過氧化氫酶基因CAr cDNA的上游為CaMV 35S的光誘導(dǎo)型表達(dá)啟動(dòng)子。
[0006]本發(fā)明另一目的是提供一種含有擬南芥過氧化氫酶基因(即以堪因)的植物表達(dá)載體pk2-PrbcS-*T-以洶新用途，即其在制備吸收甲醛能力增強(qiáng)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
[0007]上述載體中，用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載體的起始載體為PK2GW7 (購自FlandersInteruniversity Institute for B1technology, VIB)。
[0008]本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:
1、植物表達(dá)載體的構(gòu)建
(1)從GenBank中查找擬南芥以堪因的cDNA序列，并設(shè)計(jì)序列如下的一對(duì)引物:
上游引物 5’ GCatgc ATGGATCCTTACAAGTATCGTCCAG 3’ (含有 5^1 位點(diǎn))；
下游引物 5’ CTCGAG TTAGATGCTTGGTCTCACGTTCAGA 3’ (含有通ol 位點(diǎn))；上游引物5’端加GCATGC特征序列，并由此形成Sphl酶切位點(diǎn)；下游引物3’末端加ZAoI酶切位點(diǎn)，以擬南芥第一鏈cDNA為模板擴(kuò)增，通過PCR擴(kuò)增得到以堪因的全長cDNA (1479bp)；
(2)回收并純化全長基因cDNA片段，并將其連接到PMD-18T載體上，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pMD18T-C^;
(3)構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-*T-^7；用 Sphl 和 ZAoI 酶切 pMD18T-C4辨口pENTR*-PrbcS-*T-GFP，回收以7片段和載體片段pENTR*-PrbcS_*T-，進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到入門載體pENTR*-PrbcS-*T-C^;
(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pK2-PrbcS-*T-C47；通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把克隆到植物表達(dá)載體PK2GW7中，獲得以堪因的植物表達(dá)載體pK 2-PrbcS-*T-^ro
[0009]本發(fā)明的植物表達(dá)載體對(duì)那些能實(shí)施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、矮牽牛、非洲菊等。在本發(fā)明的實(shí)施中以煙草為例說明該表達(dá)載體的應(yīng)用過程。
[0010]1、煙草的轉(zhuǎn)化
采用電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pK2-PrbcS-*T-U7進(jìn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布在Spe平板上生長兩天后，用菌落PCR檢測(cè)質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。PCR擴(kuò)增用以7的上下游引物，擴(kuò)增片段理論長度為1.5kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示與理論值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。制備煙草、Nicotiana tabacum cv.Xanthi)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，篩選具有卡那霉素(Kan)抗性植株，將其轉(zhuǎn)移到MS培養(yǎng)基(含有3 %蔗糖)上繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得無菌的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0011]2、6?7?因插入情況的檢測(cè)
為了檢測(cè)目的基因以r是否插入有卡那霉素抗性植株煙草的基因組，以抗性苗的基因組為模板，利用以r上下游引物做PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段理論長度為1.5kb，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示與理論值相符，說明目的基因以7已插入到煙草基因組中。
[0012]3、6?/?因轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)
為了檢測(cè)目的基因以7?轉(zhuǎn)基因煙草中是否轉(zhuǎn)錄，提取抗性苗RNA，利用以7土下游引物進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，RT-PCR擴(kuò)增片段理論長度為1.5kb，RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)顯示與理論值相符，說明目的基因以7已在轉(zhuǎn)基因煙草中正常轉(zhuǎn)錄。
[0013]4、以堪因表達(dá)后植物過氧化氫酶比活力的檢測(cè)
為了檢測(cè)目的基因以靡§碼的蛋白在煙草中是否表達(dá)、其酶活性是否提高，選取經(jīng)RT-PCR檢測(cè)正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，提取總蛋白，測(cè)定CAT的比活力，測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植物CAT比活力明顯高于野生型，說明以7?碼的蛋白在煙草中已成功表達(dá)，選取I號(hào)轉(zhuǎn)基因煙草(Cl)和3號(hào)轉(zhuǎn)基因煙草(C3)用于后續(xù)氣體甲醛處理。
[0014]5、轉(zhuǎn)基因煙草甲醛吸收能力檢測(cè)
根據(jù)酶活測(cè)定的水平，選擇活性較高的轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行甲醛吸收能力檢測(cè)，分別用10 ppm,20 ppm,40 ppm氣體HCHO處理野生型煙草(WT)植株和轉(zhuǎn)基因煙草(Cl、C3)植株30min，每5min記錄一次甲醛處理裝置中剩余HCHO的含量。結(jié)果說明，10 ppm、20 ppm、40 ppm處理時(shí)，野生型煙草和轉(zhuǎn)基因煙草HCHO吸收能力出現(xiàn)明顯差異，且CAT比活力越大其吸收氣體甲醛的能力越強(qiáng)，明顯可見WT吸收氣體甲醛的能力最弱。10 ppm時(shí)，Cl吸收的甲醛為85.1%，C3吸收的甲醛為79.9%，WT吸收的甲醛為70% ;三株煙草葉片總面積在0.095-0.105 cm2。轉(zhuǎn)基因煙草甲醛吸收能力明顯高于野生型煙草，Cl、C3、WT平均甲醛吸收速率約為 2.84 ppm/m2.min、2.66 ppm/m2.min、2.33 ppm/m2.min。20 ppm 時(shí)，Cl 吸收的甲醛為60%，C3吸收的甲醛為51%，WT吸收的甲醛為42% ;三株煙草葉片總面積在0.145-0.155cm2。轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)氣體甲醛的吸收效率仍顯著高于野生型煙草，它們的平均甲醛吸收速率約為 2.68 ppm/m2.min、2.27