狗牙根‘C299’脫水素蛋白Dehydrin-L及其編碼基因和探針的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明狗牙根'C299'干旱脅迫響應(yīng)過(guò)程中的一種重要保護(hù)蛋白脫水素蛋白 Dehydrin-L及其編碼基因和探針，具體涉及一種狗牙根'C299'脫水素蛋白Dehydrin-L及 其編碼基因和探針。
【背景技術(shù)】
[0002] 狗牙根（Cynodon dactylon)是非常重要的暖季型草坪草，為禾本科多年生草本植 物，具有發(fā)達(dá)的根莖和匍匐莖，生長(zhǎng)速度快、再生能力強(qiáng)、成坪快、耐熱、耐踐踏、質(zhì)地纖細(xì)、 色澤好等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)內(nèi)外廣泛用于運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、游憩場(chǎng)、公園及固土護(hù)坡草坪等。因此是暖季型 草坪草中應(yīng)用價(jià)值最高、應(yīng)用最廣的草種之一，享有暖季型草坪草"當(dāng)家草種"之稱，極具社 會(huì)、經(jīng)濟(jì)和生態(tài)價(jià)值。狗牙根的抗旱能力十分強(qiáng)，年蒸散量低于400mm，僅是玉米、小麥等農(nóng) 作物年需水量的四分之一左右，因此是建植節(jié)水草坪的優(yōu)良材料。在狗牙根中，'C299'屬 于觀賞性最佳的品種之一，但是其抗旱性較其他品種稍弱，因此提高狗牙根'C299'的耐旱 性，對(duì)暖季型草坪草的應(yīng)用性及觀賞性具有非常重要的意義。
[0003] 脫水素（dehydrin)屬于LEA- II家族，是植物體內(nèi)的一種具有高度熱穩(wěn)定性、親水 性的LEA蛋白（late embryogensis abundant proteins)，能夠在植物胚胎發(fā)育后期以及逆 境下大量表達(dá)，廣泛存在于植物界。它能在植物處于干旱等逆境條件下表達(dá)，其在逆境下表 達(dá)的強(qiáng)弱與植物抗逆能力有密切聯(lián)系，在抗性植株中的表達(dá)量要高于對(duì)逆境敏感的植株。 由此顯示，它與植物的抗旱有著密切的關(guān)系。我們根據(jù)異源克隆的方法從狗牙根'C299'中 用克隆獲得相似的脫水素基因，Q-PCR結(jié)果證明，該基因在'C299'中隨著干旱程度的增大 而表達(dá)量升高，證實(shí)該基因在'C299'抗旱過(guò)程中起重要作用。
[0004] 脫水素的編碼基因已從多種植物中克隆出來(lái)，包括：擬南芥、水稻、大麥、橡樹(shù)、紅 海欖等。但對(duì)于草坪草植物脫水素的克隆、表達(dá)模式及蛋白序列尚不清楚。目前，未有任何 與狗牙根'C299'脫水素蛋白結(jié)構(gòu)及其編碼基因序列相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于填補(bǔ)狗牙根'C299' Dehydrin-L基因的克隆、表達(dá)模式分析 以及狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白的空白，本發(fā)明還提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核 酸序列以及檢測(cè)所述核酸序列的探針；本發(fā)明公開(kāi)了狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白及 其核酸序列在狗牙根'C299'干旱脅迫過(guò)程中的表達(dá)模式，為今后利用基因工程技術(shù)對(duì) Dehydrin-L基因表達(dá)的時(shí)空特性進(jìn)行調(diào)控，從而為提高狗牙根抗干旱脅迫能力與育種工作 提供了理論依據(jù)，具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
[0006] -方面，本發(fā)明提供了具有干旱脅迫響應(yīng)功能及保護(hù)功能的狗牙根'C299'脫水素 Dehydrin-L蛋白，所述蛋白質(zhì)是由如SEQ ID N0.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；或由 SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有狗牙根 'C299'脫水素Dehydrin-L蛋白特征的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)在不同干旱脅迫階段過(guò)程中在細(xì) 胞中的表達(dá)量存在較大差異。
[0007] 優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列經(jīng)過(guò)1~50個(gè)氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個(gè)以內(nèi)氨基酸而得到的序列。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選的，所述蛋白質(zhì)為SEQ ID N0. 4所示氨基酸序列中1~10個(gè)氨基酸被 性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0009] 另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼上述蛋白質(zhì)的核酸序列。
[0010] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為：（a)堿基序列如SEQ ID N0. 3第1~546位所示； 或（b)與SEQ ID N0. 3第1~546位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能與 SEQ ID N0. 3第1~546位所示的核酸進(jìn)行雜交的序列。
[0011] 優(yōu)選的，所述核酸序列具體為SEQ ID N0. 3第1~546位所示的核酸序列中1~ 90個(gè)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加60個(gè)以內(nèi)核苷酸形成的 序列。
[0012] 此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述核酸 序列8~100個(gè)連續(xù)核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼狗牙根 'C299' Dehydrin-L基因相關(guān)的核酸分子。
[0013] 在本發(fā)明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位 于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)， 而且已經(jīng)與在細(xì)胞中相伴隨的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
[0014] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白編碼序列"指編碼具有狗牙根 'C299'脫水素Dehydrin-L蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID N0. 3所示的第1~ 546位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID N0. 3所示的第1~546位 核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。 由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID N0. 3所示的第1~546位核苷酸序列同源性低至約 70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID N0. 4所示的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID N0. 3所示 的核苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0015] 該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼天然狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個(gè)核苷酸的 缺失、插入和/或取代，以及在5'和/或3'端添加為60個(gè)以內(nèi)核苷酸。
[0016] 在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白"指具有狗牙根 'C299'Dehydrin-L蛋白活性的SEQ ID N0. 4所示序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然 狗牙根'C299'Dehydrin-L蛋白相同功能的、SEQ ID N0. 4序列的變異形式。這些變異形式 包括（但并不限于）：通常為1~50個(gè)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一個(gè)或?yàn)?0個(gè)以內(nèi)氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸 進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè) 氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白的活 性片段和活性衍生物。
[0017] 本發(fā)明的狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白的變異形式包括：同源序列、保守 性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與狗牙根 'C299'Dehydrin-L相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用狗牙根'C299'Dehydrin-L 蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。
[0018] 在本發(fā)明中，"狗牙根'C299' Dehydrin-L保守性變異多肽"指與SEQ ID N0. 4所 示的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。 這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
[0019] 表 1
[0020]

[0022] ^發(fā)明還包括狗牙根'C299' Dehydrin-L蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與狗牙 根'C299' Dehydrin-L相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列 的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異 體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘 變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如 D-氨基酸）的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如0、y-氨基酸）的類(lèi) 似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
[0023] 修飾（通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu)）形式包括：體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙