干擾素突變體及其聚乙二醇衍生物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明一般的涉及干擾素突變體及其聚乙二醇衍生物，后者的制備方法，兩者的 藥物組合物和在制備治療病毒性疾病的藥物中的用途；特別的涉及干擾素A的去半胱氨 酸突變體及其聚乙二醇衍生物，后者的制備方法，兩者的藥物組合物和在制備治療病毒性 疾病的藥物中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 干擾素（interferon, IFN)是一種最初由動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生的兼具抗病毒、抗增殖與 免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子蛋白質(zhì)類藥物，根據(jù)其產(chǎn)生部位、作用機(jī)理、藥效特點(diǎn)等的不同可 以分為I、II、III三種大的類型。其中I型干擾素主要是指干擾素a與干擾素0，干擾素 a又有包括干擾素a 2a、干擾素a 2b、干擾素a lb在內(nèi)的超過20種的天然亞型；II型干 擾素主要是指干擾素y ;iii型干擾素主要是指干擾素a，包括干擾素a1、干擾素a2、干 擾素A 3三種天然亞型。
[0003] 相較于1、11型干擾素，III型干擾素的發(fā)現(xiàn)與報(bào)道較晚。其中干擾素A 1最早由 津莫吉尼蒂克斯公司公開于其國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2001/021087(國(guó)際公布日2002年1月 10日）中。其由181個(gè)氨基酸構(gòu)成，并在自N端計(jì)的第15位、第49位、第112位、第145 位、第171位有5個(gè)半胱氨酸。這5個(gè)半胱氨酸形成兩對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
[0004] 干擾素X2與干擾素A3隨后亦由津莫吉尼蒂克斯公司公開于其國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/US2002/012887(國(guó)際公布日2002年10月31日）中。它們均由175個(gè)氨基酸構(gòu)成，并 在自N端計(jì)的第16位、第48位、第50位、第115位、第148位、第167位、第174位有7個(gè) 半胱氨酸。這7個(gè)半胱氨酸形成三對(duì)分子內(nèi)二硫鍵。
[0005] 對(duì)比研究結(jié)果表明，在三種干擾素A分子中，干擾素A 3的抗病毒活性最高，干擾 素A2的抗病毒活性最低，而干擾素A 1的抗病毒活性居中。
[0006] 干擾素X 1在最初公開時(shí)的代號(hào)為zcyto21，干擾素A 2在最初公開時(shí)的代號(hào)為 2〇又1:〇20，干擾素13在最初公開時(shí)的代號(hào)為2〇71:〇22。在隨后的研究中由于發(fā)現(xiàn)它們的基 因、蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)與白介素10 (IL-10)非常接近，因此它們被歸于白介素10家族，分別被 重新命名為 IL-29、IL-28A 與 IL-28B。
[0007] 盡管zcyt〇21、zcyt〇20與干擾素a的氨基酸序列一致性（也即同源性）只有 17%，與干擾素0的氨基酸序列一致性只有14%，與干擾素Y的氨基酸序列一致性只有 4% ;ZCyt〇22與干擾素a的氨基酸序列一致性只有16%，與干擾素0的氨基酸序列一致 性只有13%，與干擾素丫的氨基酸序列一致性只有4%，但它們?cè)陔S后的研究中都發(fā)現(xiàn)和 確認(rèn)與傳統(tǒng)的干擾素有相似的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，有很多類干擾素性質(zhì)。因此從功能的角度出 發(fā)，它們最終分別被命名為干擾素M、干擾素A 2與干擾素入3。
[0008] 作為最早發(fā)現(xiàn)與最重要研究開發(fā)干擾素X的公司，津莫吉尼蒂克斯公司在發(fā)現(xiàn) 三種天然的干擾素A分子并研究其作用機(jī)理與藥理活性后，又研究了干擾素A的突變 體、干擾素A或其突變體的聚乙二醇衍生物、干擾素A或其突變體或其衍生物的制備 方法、干擾素A或其突變體或其衍生物的醫(yī)藥用途、干擾素A或其突變體或其衍生物 的聯(lián)合用藥等，并在此基礎(chǔ)上形成了一系列的各國(guó)專利申請(qǐng)與授權(quán)專利。例如國(guó)際專利 申請(qǐng)PCT/US2004/025864(國(guó)際公布日2005年3月17日）公開了諸多的干擾素A的 突變體及其聚乙二醇衍生物；國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US2005/026951(國(guó)際公布日2006年2 月2日）公開了 IL-28和IL-29治療癌癥和自身免疫性疾病的方法；國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/ US2006/039139(國(guó)際公布日2007年4月12日）公開了生產(chǎn)IL-29的方法；國(guó)際專利申請(qǐng) PCT/US2009/046451 (國(guó)際公布日 2009 年 12 月 10 日）公開了 IL-28A、IL-28B 和 IL-29 治 療丙型肝炎的方法。
[0009] 雖然現(xiàn)有技術(shù)中與干擾素A相關(guān)的絕大多數(shù)研究和/或開發(fā)工作由津莫吉尼蒂 克斯公司從事與完成，并在此基礎(chǔ)上形成了眾多的專利與非專利公開文獻(xiàn)，但國(guó)內(nèi)外亦有 一些其它公司/研究機(jī)構(gòu)在從事干擾素X的研究和/或開發(fā)工作，并報(bào)道了研究和/或開 發(fā)成果。例如申請(qǐng)人帝國(guó)創(chuàng)新有限公司在其國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/GB2006/050281 (國(guó)際公布 日2007年3月15日）中公開了干擾素A治療呼吸道疾病的方法；申請(qǐng)人汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 在其中國(guó)專利申請(qǐng)200410052377. 8 (公布日2005年9月21日）中公開了 IL-29的生產(chǎn)方 法及重組IL-29工程菌；申請(qǐng)人武漢大學(xué)在其中國(guó)專利申請(qǐng)200910062246. 0 (公布日2009 年11月11日）中公開了干擾素A在抗人類免疫缺陷病毒中的應(yīng)用；申請(qǐng)人北京凱因科技 股份有限公司在中國(guó)專利申請(qǐng)201110020949. 4 (公布日2012年7月18日）中公開了 PEG 化的干擾素A，其是由巰基聚乙二醇修飾劑修飾干擾素A得到。
[0010] -系列的研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的1、11型干擾素相比，干擾素X有獨(dú)特的細(xì)胞靶 向性與受體分布的組織特異性，而且很多臨床不良反應(yīng)如骨髓抑制、ALT/AST升高、發(fā)熱、惡 寒、惡心、關(guān)節(jié)痛等明顯降低，因此干擾素X在治療上呼吸道感染疾病中有明顯的優(yōu)勢(shì)。但 是由于干擾素A本身的體內(nèi)外活性低于傳統(tǒng)的1、11型干擾素，加之干擾素A作為細(xì)胞因 子蛋白質(zhì)類藥物存在穩(wěn)定性差、半衰期短的特點(diǎn)，這些缺點(diǎn)都限制了其臨床推廣應(yīng)用的前 景。因此，有必要在已有干擾素A及其突變體的基礎(chǔ)上研究新的干擾素A突變體，以進(jìn)一 步改善干擾素A的穩(wěn)定性，并提高其生物學(xué)活性（抗病毒活性）。在此基礎(chǔ)上，有必要優(yōu)選 與優(yōu)化蛋白質(zhì)的長(zhǎng)效技術(shù)用于干擾素A的突變體，以在盡可能高的保留干擾素A的生物 學(xué)活性的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善其穩(wěn)定性，并延長(zhǎng)其體內(nèi)藥代半衰期。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的首要目的是提供一種干擾素X的去半胱氨酸突變體，以解決現(xiàn)有的干 擾素A1氨基酸序列中有奇數(shù)個(gè)半胱氨酸，造成其性質(zhì)不穩(wěn)定，抗病毒活性偏低的缺點(diǎn)。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)此目的，在基礎(chǔ)的實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾素X的去半胱氨酸突變體將 干擾素A 1氨基酸序列中從N端計(jì)的第112位的半胱氨酸（Cys，C)突變?yōu)樯彼幔⊿er，S)， 具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
[0013] 為了獲得干擾素A的去半胱氨酸突變體，需要先后進(jìn)行表達(dá)干擾素A去半胱氨 酸突變體分子的基因工程菌或基因工程細(xì)胞的構(gòu)建、基因工程菌或基因工程細(xì)胞的發(fā)酵和 發(fā)酵產(chǎn)物的純化，優(yōu)選進(jìn)行表達(dá)干擾素A去半胱氨酸突變體分子的大腸桿菌工程菌的構(gòu) 建、發(fā)酵和發(fā)酵產(chǎn)物的純化。
[0014] 在基因工程菌或基因工程細(xì)胞的構(gòu)建過程中，首先需要獲得并擴(kuò)增表達(dá)干擾素入 去半胱氨酸突變體的基因，采用的方法包括但不局限于全基因合成、PCR法（包括重疊延伸 PCR法）。在大量獲得表達(dá)干擾素A去半胱氨酸突變體的基因后選擇適宜的載體，用本領(lǐng)域 技術(shù)人員公知的構(gòu)建重組載體的方法將表達(dá)干擾素A去半胱氨酸突變體的基因轉(zhuǎn)入所述 載體從而構(gòu)建重組載體。所述重組載體優(yōu)選質(zhì)粒載體，一般含有啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)（MCS) 和終止子，并應(yīng)具有一組或多組雙酶的各自單一的酶切位點(diǎn)，適宜被轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的宿主菌或 宿主細(xì)胞。當(dāng)選擇的宿主菌或宿主細(xì)胞為真核宿主菌或真核宿主細(xì)胞時(shí)，還需進(jìn)一步選擇 分泌表達(dá)或胞內(nèi)可溶性表達(dá)的載體。例如當(dāng)用畢赤酵母作為表達(dá)系統(tǒng)時(shí)前者包括但不局 限于 pHIL-Sl、pPIC9、pPIC9K、pPICZ a、pGAPZ a、pYAM75P，后者包括但不局限于 pHIL-D2、 pA0815、pPIC3K、pPIC3. 5K、pPICZ、pHWOlO、pGAPZ。
[0015] 然后利用電穿孔法、PEG法、氯化鋰法、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法等本領(lǐng)域技術(shù)人員公知 的方法將重組載體轉(zhuǎn)入宿主菌或宿主細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)干擾素A去半胱氨酸突變體的基因 工程菌或基因工程細(xì)胞。所述的宿主菌或宿主細(xì)胞可以選擇原核宿主菌，例如大腸桿菌 (Escherichia coli)、乳酸桿菌（Lacticacid bacteria)等，優(yōu)選大腸桿菌；也可以選擇真 核宿主菌或宿主細(xì)胞，例如畢赤酵母（Pichia. pastoris)、漢遜酵母（Hansenula anomala)、 CH0細(xì)胞等，優(yōu)選畢赤酵母。
[0016] 工程菌或工程細(xì)胞的發(fā)酵應(yīng)選擇適宜其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基組成、pH、溫度、通氣量、培 養(yǎng)時(shí)間與補(bǔ)料操作等條件。
[0017] 對(duì)于大腸桿菌工程菌的發(fā)酵條件：優(yōu)選LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程中的溫度控制在 30-37°C之間；pH控制在6. 0-8. 0之間（必要時(shí)選擇pH調(diào)節(jié)劑控制pH，所述的pH調(diào)節(jié)劑包 括但不限于NaOH、氨水及各種有機(jī)氮源，優(yōu)選氨水）；通氣量（溶氧）應(yīng)滿足菌體或細(xì)胞的 生長(zhǎng)需要及產(chǎn)物表達(dá)合成的需要；培養(yǎng)時(shí)間與補(bǔ)料操作的方式相關(guān)，在采取適宜的補(bǔ)料操 作條件的情況下培養(yǎng)時(shí)間為6-48小時(shí)之間。
[0018] 而對(duì)于真核表達(dá)系統(tǒng)工程菌的發(fā)酵條件，尤其是畢赤酵母工程菌的發(fā)酵條件：常 用的誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基包括但不局限于LB培養(yǎng)基、YH)培養(yǎng)基、YPDS+Zeocin培養(yǎng)基、MGY培 養(yǎng)基、MGYH培養(yǎng)基、BMG培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基、BSM培養(yǎng)基、RD培養(yǎng)基、RDH培養(yǎng)基、MD培養(yǎng) 基、MDH培養(yǎng)基、S0C培養(yǎng)基、MM培養(yǎng)基；誘導(dǎo)表達(dá)后的培養(yǎng)基中需含有一定濃度的甲醇以全 部替代或部分替代誘導(dǎo)表達(dá)前培養(yǎng)基中的碳源物質(zhì)，由于甲醇濃度過低不利于產(chǎn)物的誘導(dǎo) 表達(dá)，而甲醇濃度過高時(shí)會(huì)對(duì)產(chǎn)物的誘導(dǎo)表達(dá)形成抑制，所以培養(yǎng)基中甲醇的濃度優(yōu)選在 0. l-l〇g/L之間，并更優(yōu)選在0. 5-5g/L之間；菌體生長(zhǎng)過程中的溫度一般應(yīng)控制在28-30°C 之間，不可超過32°C，而誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)的溫度一般應(yīng)低于菌體生長(zhǎng)過程中的溫度，在20-28°C 之間；培養(yǎng)過程中的pH應(yīng)控制在3. 0-7. 0之間（必要時(shí)選擇pH調(diào)節(jié)劑控制pH，所述的pH 調(diào)節(jié)劑包括但不限于NaOH、氨水及各種有機(jī)氮源，優(yōu)選氨水），且菌體生長(zhǎng)和誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)適 宜的pH往往有所不同；通氣量（溶氧）應(yīng)滿足菌體生長(zhǎng)需要及產(chǎn)物表達(dá)合成的需要，一般 應(yīng)控制在20-30%之間；培養(yǎng)時(shí)間與補(bǔ)料操作的方式相關(guān)，在采取適宜的補(bǔ)料操作條件的 情況下培養(yǎng)時(shí)間為12-180小時(shí)之間。
[0019] 干擾素A去半胱氨酸突變體蛋白如果表達(dá)在工程菌或工程細(xì)胞內(nèi)，需要對(duì)發(fā)酵 培養(yǎng)收獲的菌體或細(xì)胞進(jìn)行破碎處理以釋放出其中的干擾素X去半胱氨酸突變體蛋白。 而對(duì)于大腸桿菌等原核的工程菌，更需要破碎處理以釋放出以包涵體形式表達(dá)的干擾素入 去半胱氨酸突變體蛋白。常用的破碎方法包括但不局限于超聲波破碎、球磨機(jī)破碎、溶菌酶 處理等。
[0020] 對(duì)于以包涵體形式表達(dá)的干擾素X去半胱氨酸突變體蛋白，需要對(duì)破碎處理得 到的粗包涵體進(jìn)行洗滌操作以盡可能除去其中含有的少量菌體蛋白、膜蛋白等雜蛋白。洗 滌過程中使用