Artalbic acid衍生物的組合物用于制備抗菌藥物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其在制備抗菌藥物上的用途。本發(fā)明公開(kāi)了一種組合物及其制備方法。藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有抗菌作用，具有開(kāi)發(fā)抗菌藥物的價(jià)值。
【專利說(shuō)明】
Arta I b i c ac i d衍生物的組合物用于制備抗菌藥物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及有機(jī)合成和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及組合物、制備方法及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 致病菌的擴(kuò)散及其耐藥性的增強(qiáng)嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康和生命，抗菌藥物已作為 常規(guī)用藥廣泛用于艾滋病、器官移植以及慢性消耗性疾病(如癌癥、糖尿病、尿毒癥等)的治 療，雖然目前臨床上使用的抗菌藥劑(如酮康唑、阿米卡星、慶大霉素、活力康唑、伊曲康唑、 特比萘芬、二性霉素、氟康唑等)對(duì)皮膚及淺表部位感染的療效較好，但這些抗菌藥物的蓄 積毒性較強(qiáng)，常常引起肝腎損傷、消化道刺激、頭暈、過(guò)敏等，所以尋找作用機(jī)理獨(dú)特的新型 抗菌藥物成為當(dāng)今藥物研發(fā)的熱點(diǎn)之一。
[0003] 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種革蘭氏陰性螺旋狀細(xì)菌。研究顯 示，幽門(mén)螺桿菌是急、慢性胃炎以及胃、十二指腸潰瘍的主要致病原因，并可能與胃癌和胃 粘膜相關(guān)性淋巴樣組織(MALT)惡性淋巴瘤發(fā)病有關(guān)。最近，世界衛(wèi)生組織將Hp歸為I類(lèi)致癌 物，它在胃癌發(fā)展中起主導(dǎo)作用。目前流行的治療Hp感染的方案是同時(shí)服用質(zhì)子栗抑制劑 (PPI)加兩種抗生素(克拉霉素，阿莫西林、四環(huán)素、甲硝唑等選二種）的三聯(lián)療法。影響三聯(lián) 療法的最主要因素被認(rèn)為是Hp對(duì)抗菌劑的耐藥性;另一嚴(yán)重問(wèn)題是質(zhì)子栗抑制劑會(huì)誘發(fā)消 化不良，大量抗菌劑則導(dǎo)致消化道內(nèi)菌群的嚴(yán)重毀滅。因此，尋找高效、安全的抗Hp活性一 類(lèi)新藥物成為一個(gè)重要和迫切的任務(wù)。
[0004] 近年來(lái)全球結(jié)核病的發(fā)病呈增高趨勢(shì)，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，目前全球受結(jié) 核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染的人口占世界人口的三分之一，其中 5~10%的感染者成為結(jié)核病患者。我國(guó)每年出現(xiàn)活動(dòng)性肺結(jié)核病人130萬(wàn)例，其中傳染性 肺結(jié)核約60萬(wàn)例，其中傳染性肺結(jié)核約60萬(wàn)例，是全球結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一。
[0005] 自抗結(jié)核藥物相繼問(wèn)世，使結(jié)核病的治療起到劃時(shí)代的變化。然而由于結(jié)核病患 者的治療管理尚不十分規(guī)范，不規(guī)則化療，濫用抗結(jié)核藥物，使結(jié)核病耐藥情況日益嚴(yán)重， 且耐藥性的變化更趨向于多種藥物同時(shí)耐藥，這給結(jié)核病的防治工作造成極大困難。因此 尋找新的抗結(jié)核藥物，尤其是抗多藥耐藥性的抗結(jié)核藥物對(duì)保護(hù)人民身體健康，具有重要 意義。
[0006] 從天然產(chǎn)物中尋找化合物或先導(dǎo)化合物并進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾獲得其衍生物，從而得到 高效低毒的潛在藥物最有重要價(jià)值。
[0007] 本發(fā)明涉及的化合物I是一個(gè)2011年發(fā)表（Antonella Maggio et al ·， 2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily·Tetrahedron Letters,52(2011 )4543-4545)的化合物，我 們對(duì)化合物I進(jìn)行了結(jié)構(gòu)修飾，獲得了兩個(gè)新的衍生物即化合物III和化合物IV，并用化合 物III和化合物IV制備了組合物并對(duì)該組合物抗菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，其具有抗菌活性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]
[0008] 本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)新的組合物，該組合物由化合物III和化合物IV組成，該組合物 中化合物III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為55%和45%。
[0010]
[0011] 本發(fā)明公開(kāi)的組合物可以制成藥學(xué)上可接受的鹽或藥學(xué)上可接受的載體。
[0012] 藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的組合物具有較好的抗菌作用。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受 的鹽具有同樣的藥效。
[0013] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā) 明的組合物有望被用于制備新型抗人體真菌藥物。
[0014] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗幽門(mén)螺旋桿菌活性，說(shuō)明 對(duì)于與幽門(mén)螺旋桿菌密切相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，組合物是一 個(gè)極具開(kāi)發(fā)潛力的化合物。它可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。
[0015] 進(jìn)一步的，組合物的體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抑制大腸桿菌、熒光假單孢 菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌的作用，所以組合物可作為具有抗細(xì)菌作用的化 合物，并有望在制備抗細(xì)菌藥物中得到應(yīng)用。
[0016] 進(jìn)一步的，根據(jù)初步試驗(yàn)的結(jié)果，本發(fā)明用固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定了組合物對(duì)卡 介苗、結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌(MDR MTB)三種結(jié)核菌的最小抑 菌濃度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)組合物具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié) 核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物。
[0017]以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受具體實(shí) 施例的任何限制，而是由權(quán)利要求加以限定。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 實(shí)施例1化合物Artalbic acid的制備
[0019] 化合物Artalbic acid(I)的制備方法參照Antonella Maggio等人發(fā)表的文獻(xiàn) (Antonella Maggio et al.,2011.Artalbic acid,a sesquiterpene with an unusual skeleton from Artemisia alba(Asteraceae)from Sicily. Tetrahedron Letters ,52 (2011 )4543-4545)的方法。
[0020]
[0021] 實(shí)施例2 Artalbic acid的0-溴乙基衍生物（II)的合成
[0022] 將化合物I(266mg，l.OOmmol)溶于IOmL苯，向溶液中加入四丁基溴化銨（TBAB) (0.088)，1，2-二溴乙燒(3.76(^，20.00_〇1)和61]1]^的50%氫氧化鈉溶液?；旌衔镌?0攝氏 度攪拌Iehieh之后將反應(yīng)液倒入冰水中，立即用二氯甲烷萃取兩次，合并有機(jī)相溶液。然 后對(duì)有機(jī)相溶液依次用水和飽和食鹽水洗滌5次，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后減壓濃縮去除 溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100:1.0，v/V)， 收集棕色集中洗脫帶并揮去溶劑即得到化合物II的棕色粉末(272mg，73% )。
[0023] 1H NMR(500MHz,DMS0-d6)5ll.41(s,lH),6.06(s,lH),5.76(s,lH),4.99(s,lH), 4.71(s,1H),4.56(s,1H),3.86(s,2H),3.54(s,2H),2.65(s,1H),2.43(s,2H),2.33(s,2H), 2.10(s,lH),1.64(s,3H),1.54(s,lH),1.44(s,2H),0.95(s,3H).
[0024] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)S201.95(s),175.93(s),149.13(s),148.15(s),117.05 (s),109.43(s),81.86(s),70.27(s),57.68(s),41.26(s),39.07(s),38.86(s),35.69(s), 33.36(s),30.72(s),20.44(s),18.42(s).
[0025] HRMS(ESI)m/z[M+H]+calcd for Ci7H26BrO4:373.1014；found 373.1017.
[0026]
[0027] 實(shí)施例3 Artalbic acid的0-(苯并咪唑基）乙基衍生物（III)的合成 [0028] 將化合物II(187mg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(345mg， 2 · 5mmol)，碘化鉀(84mg，0 · 5mmol)和苯并咪唑（1180mg，IOmmol)，混合物加熱回流2h。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入冰水中，用等量二氯甲烷萃取2次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和食鹽 水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn)物粗 品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集棕色集中洗脫帶，濃縮 即得到化合物ΠI的棕色固體(80.0 mg，39 % )。
[0029] 1H MMR(500MHz，DMS0-d6)Sl6.65(s，lH)，8.22(s，lH)，7.61(d，J = 25.0Hz，2H)， 7.25(s，1H)，7.16(s，1H)，6.05(s，1H)，5.76(s，1H)，4.90(s，1H)，4.67(s，1H)，4.58(s，1H)， 4.12(s，1H)，4.00(s，1H)，3.85(s，2H)，2.63(s，1H)，2.43(s，2H)，2.35(s，2H)，1.95(s，1H)， 1.61(s，3H)，1.52(s，2H)，1.37(s，lH)，0.94(s，3H).
[0030] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5201.70(s),175.59(s),149.00(s),147.93(s),146.20 (s),139.75(s),133.40(s),123.95(s),123.48(s),118.46(s),116.84(s),110.97(s), 109.08(s),81,62(s),67.86(s),57.36(s),44.96(s),41.15(s),38.72(s) ,38.62(s), 35.56(s),30.41(s),20.19(s),18.28(s).
[0031] HRMS(ESI) :m/z[M+H]+calcd for C24H3IN2O4^ll .2284；found:411.2281 〇
[0032]
[0033] 實(shí)施例4 Artalbic acid的0-(二輕乙胺基）乙基衍生物的合成
[0034] 將化合物II(187mg，0.5mmo 1)溶于20mL乙腈當(dāng)中，向其中加入無(wú)水碳酸鉀(690mg， 5.0_31)，碘化鉀（25211^，1.5_31)和二乙醇胺（105111^，10_31)，混合物加熱回流111。反應(yīng) 結(jié)束后將反應(yīng)液倒入20mL冰水中，用等量二氯甲烷萃取3次，合并有機(jī)相。依次用水和飽和 食鹽水洗滌合并之后的有機(jī)相，再用無(wú)水硫酸鈉干燥，減壓濃縮去除溶劑得到產(chǎn)物粗品。產(chǎn) 物粗品用硅膠柱層析純化(流動(dòng)相為:石油醚/丙酮= 100: l.〇，v/v)，收集黃色集中洗脫帶 并揮去溶劑即得到化合物IV的淡黃色固體(146.9mg，74% )。
[0035] 1H NMR(500MHz，DMS0-d6)Sl8.72(s，lH)，S6.11(s，lH)，5.80(s，lH)，5.14(s，lH)， 4.73(s,lH),4.63(s,lH),3.57(s,2H),3.45(s,4H),2.70(d,J=15.6Hz,3H),2.60(s,4H), 2.50(s,2H),2.46(s,2H),2.33(s,lH),1.88(s,2H),1.68(s,3H),1.62(d,J=19.9Hz,3H), 1.02(s,3H).
[0036] 13C NMR(125MHz,DMS0-d6)5202.01(s),176.11(s),149.21(s),148.55(s),117.15 (s),109.60(s),81.93(s),67.25(s),59.28(s),57.88(s),56.83(s),53.74(s),41.36(s), 39.24(s),38.93(s),35.88(s),30.82(s),20.61(s),18.49(s).
[0037] HRMS(ESI) :m/z[M+H].calcd for C2iH36Ni〇6:398.2543;found:398.2547〇
[0038]
[0039] 實(shí)施例5組合物抗人體真菌活性
[0040] 組合物的制備：將研磨之后過(guò)200目網(wǎng)的55mg化合物III的粉末和研磨之后過(guò)200 目網(wǎng)的45mg化合物IV的粉末裝入帶蓋的小管中并用渦輪攪拌儀混合即得到IOOmg組合物， 使用時(shí)用水溶解這IOOmg的組合物即得到組合物的溶液。
[0041] 抗人體真菌活性實(shí)驗(yàn)是采用濃度稀釋的方法，每次測(cè)定重復(fù)三次，測(cè)試的病原菌 有紅色毛癬菌、羊毛狀小孢子菌和斷發(fā)癬菌，菌液濃度為IO 5個(gè)/mL。藥物的起始濃度為 50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMS0)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測(cè)試樣品混 合培養(yǎng)在96孔板中（形成的最終濃度有：25·00、12·50、6·25、3·13、1·56、0·78、0·39、0·20、 0.10和0.05yg/mL)，人體真菌培養(yǎng)溫度分別為28°C，培養(yǎng)時(shí)間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒(méi)有菌落 形成的處理孔中最低的那個(gè)濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。該實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照為酮康 唑，組合物抗人體真菌結(jié)果見(jiàn)表1。
[0042]表1組合物抗人體真菌MIC值(yg/mL)
[0044] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗人體真菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備 新型抗人體真菌藥物。化合物ΠI和化合物IV無(wú)抗人體真菌活性，因此不能用于制備新型抗 人體真菌藥物。
[0045] 實(shí)施例6組合物抗幽門(mén)螺桿菌活性
[0046] 1)供試菌株
[0047] 幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 43504購(gòu)于美國(guó)菌種保存 中心(American Type Culture Collectior^ATCC)。]^株Hp臨床菌株采自南京市鼓樓醫(yī)院 胃鏡室接受胃鏡檢查的患者;在連續(xù)胃鏡檢查中對(duì)消化性潰瘍、十二指腸球炎或疣狀胃炎 的患者，先經(jīng)快速尿素酶實(shí)驗(yàn)確定為Hp陽(yáng)性者，再取胃竇黏膜1-2塊，切碎后接種于含8%馬 血清、三甲氧節(jié)氨啼啶（1：1'；[11161:111'(^;[11，110 3)1.258凡、多粘菌素(。0150115^;[11)1325001]凡、萬(wàn)古 霉素 (vancomycin) 10mg/L的CoIumbia選擇性瓊脂培養(yǎng)基中，于37°C在微氧環(huán)境下（5%〇2， 10%〇)2和85%他)培養(yǎng)72小時(shí)。收集細(xì)菌，經(jīng)涂片革蘭氏染色，氧化酶、觸酶和尿素酶鑒定為 陽(yáng)性后，傳代純培養(yǎng)，所得菌株作為實(shí)驗(yàn)菌株。
[0048] 2)菌株培養(yǎng)
[0049]我們采用微需氧袋(購(gòu)自上海醫(yī)科大學(xué))進(jìn)行HP的菌株培養(yǎng)，它可通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn) 生Hp所需要的微需氧環(huán)境。
[0050] 3)生物活性測(cè)定
[0051 ] 采用紙片法(Microbiological paper method)測(cè)定藥物對(duì)幽門(mén)螺桿菌的抑制作 用，用瓊脂稀釋法來(lái)測(cè)定供試樣品的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)〇
[0052] I.紙片法實(shí)驗(yàn)
[0053] (A)準(zhǔn)備培養(yǎng)基將配制好的Columbia培養(yǎng)基經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，冷卻至50-60°C， 加8 %馬血清或綿羊血，混勾傾注于已經(jīng)滅菌的培養(yǎng)皿中，每皿7-10ml，培養(yǎng)基厚度為1.5mm (無(wú)菌操作）。
[0054] (B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌(涂菌）用微量取樣器取稀釋好的108CFU/ml(IOD 66q= IO8 CFU/ml) Hp的菌懸液0.1ml均勻地涂抹在適宜的培養(yǎng)皿表面。倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目 的使瓊脂表面干燥，備用。
[0055] (C)貼樣品紙片用微量取樣器取6μ1待測(cè)樣品（質(zhì)量濃度2mg/ml)注入已經(jīng)滅菌的 圓濾紙片上。用無(wú)菌鑷子鑷取含樣品的紙片和對(duì)照空白紙片，按無(wú)菌操作分別紙片緊貼于 含菌瓊脂表面，每隔一定距離貼一張紙片。每種菌做3皿，所得結(jié)果求其平均值。
[0056] (D)培養(yǎng)將各平皿置于微需氧袋中，封口，打開(kāi)氣體發(fā)生器，再置于37°C培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)72h。
[0057] (E)測(cè)抑菌圈直徑取出平板后，分別測(cè)量各紙片周?chē)志χ睆降拇笮?。參照?duì)照 組的結(jié)果，可得出待測(cè)樣品敏感實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。重復(fù)三次。
[0058] II.瓊脂稀釋法測(cè)定MIC
[0059] (A)藥物平板的制備首先將測(cè)試的藥物用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成0.5mg/ml 的母液，再用無(wú)菌水稀釋，最終配成 100·0,80·0,60·0,45·0,40·0,35·0,30·0,25·0,20·0， 15.0,10.0,5.0和2.5μg/ml的濃度系列，DMSO在介質(zhì)中的濃度小于1 %。將Iml配制好的測(cè)試 藥物溶液與保溫于50°C的8ml哥倫比亞培養(yǎng)基，另加 Iml保溫于50°C的馬血清充分混勻，澆 制入培養(yǎng)皿中冷卻即成(培養(yǎng)皿中藥物的終濃度為10.0,8.0,6.0,4.5,4.0,3.5,3.0,2.5， 2.0，1.5，1.0,0.5和0.25μg/ml，如果有抑菌作用，則MIC值即這些值當(dāng)中的一個(gè)）。
[0060] (B)轉(zhuǎn)接實(shí)驗(yàn)菌（涂菌）用微量取樣器吸取稀釋好的IX 108CFU/ml Hp的菌懸液 0.1ml均勻地涂抹在培養(yǎng)皿表面，倒置于37°C烘干箱中15min后取出，目的使瓊脂表面干燥， 備用。
[0061 ] (C)確定MIC將待測(cè)培養(yǎng)皿在微需氧袋(含:85%N2，10%C〇2和5%〇2)中，保溫37°C 培養(yǎng)72小時(shí)，觀察Hp生長(zhǎng)情況，與空白組相對(duì)照，以完全沒(méi)有菌生長(zhǎng)的樣品最低濃度為最低 抑菌濃度（minimal inhibitory concentration ,MIC)值。陽(yáng)性對(duì)照為氨節(jié)西林 (Ampicillin)0 [0062]實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0063] 體外實(shí)驗(yàn)表明，組合物具有很強(qiáng)的抗幽門(mén)螺旋桿菌活性，紙片法顯示其抑菌圈直 徑為32mm(ATCC43504)。用瓊脂稀釋法顯示它能完全抑制5個(gè)隨機(jī)的臨床菌株和1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)菌 株(ATCC43504)的生長(zhǎng)，最小抑菌濃度(MIC)均為2. Oμg/ml。用氨芐西林作陽(yáng)性對(duì)照，其對(duì)6 株測(cè)試菌完全抑制的最小濃度(MIC)為1.5μg/ml。化合物III和化合物IV無(wú)抗幽門(mén)螺旋桿菌 活性。
[0064] 結(jié)論:組合物具有較強(qiáng)的抑制幽門(mén)螺旋桿菌活性，說(shuō)明對(duì)于與幽門(mén)螺旋桿菌密切 相關(guān)的急、慢性胃炎、胃、十二脂腸潰瘍等疾病來(lái)講，組合物是一個(gè)極具開(kāi)發(fā)潛力的藥物。它 可直接用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備?；衔颕II和化合物IV無(wú)抗幽門(mén)螺旋桿 菌活性，不可以用于相應(yīng)疾病的治療以及相關(guān)藥物的制備。
[0065]實(shí)施例7組合物抗細(xì)菌活性
[0066]抗菌活性實(shí)驗(yàn)是采用濃度稀釋的方法，每次測(cè)定重復(fù)三次，測(cè)試病原菌有大腸桿 菌、熒光假單孢菌、金黃色葡萄球、變形桿菌、新生隱球菌，菌液濃度為IO5個(gè)/mL。藥物起始 濃度為50.00yg/mL(5%二甲基亞砜DMS0)，梯度稀釋至0.10yg/mL，等量體積的菌液和測(cè)試 樣品混合培養(yǎng)在96孔板中（形成的最終濃度有:25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、 0.20、0.10和0.05yg/mL)，細(xì)菌培養(yǎng)溫度分別為37°C，培養(yǎng)時(shí)間24h后觀察，若發(fā)現(xiàn)沒(méi)有菌落 形成的處理孔中最低的那個(gè)濃度為樣品最低抗菌濃度，即MIC值。組合物抗菌結(jié)果見(jiàn)表2。 [0067] 表2組合物抗細(xì)菌MIC值(yg/mL)
[0069] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗細(xì)菌活性，因此本發(fā)明的組合物有望被用于制備新型 抗細(xì)菌藥物?；衔颕II和化合物IV無(wú)抗細(xì)菌活性，不能被用于制備新型抗細(xì)菌藥物。
[0070] 實(shí)施例8組合物抗結(jié)核菌活性
[0071 ] (1)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定組合物抗卡介苗(BCG)絕對(duì)濃度
[0072] 從斜面上刮取卡介苗培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加入少 量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液。
[0073] 將藥物用DMSO配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至所需 濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基已經(jīng) 12TC高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C )，混勻，制成含藥物，濃度分別為6. Oug/ml， 4.Oug/ml，3 ·Oug/ml，2·Oug/ml，1 · 5ug/ml，I .Oug/ml，0· 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜面培 養(yǎng)基。
[0074] 將濃度為lmg/ml的卡介苗(BCG)菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含各個(gè)藥 物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果 如表3所示。
[0075] 本實(shí)施例中所用Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基和Middlebrook7Hll瓊脂培養(yǎng)基為本 領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)的常用培養(yǎng)基，其配方采用常規(guī)配方即可。
[0076] (2)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定組合物抗結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株絕對(duì)濃度
[0077] 從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv株培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9 肉湯培養(yǎng)基中，加入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)?比池管(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的H37Rv株菌懸液。
[0078] 將藥物分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基 已經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.Oug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0· 75ug/ml，0· 5ug/ml等濃度的斜 面培養(yǎng)基。
[0079] 將濃度為lmg/ml的H37Rv株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù)環(huán)，分別接種于含藥物系列濃 度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所 不。
[0080] (3)固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定藥物抗結(jié)核分支桿菌臨床分離耐ISRE MTB株絕對(duì)濃度 [0081]從斜面上刮取結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株(耐異煙肼、鏈霉素、利福平、 乙胺丁醇結(jié)核分枝桿菌臨床分離柱)培養(yǎng)物，加入到3ml Middlebrook7H9肉湯培養(yǎng)基中，加 入少量玻璃珠，旋緊試管蓋，于漩渦振蕩器上劇烈振動(dòng)研磨，與標(biāo)準(zhǔn)麥?zhǔn)媳葷峁?(MacFarland No. 1)比池，即配成lmg/ml的菌懸液。
[0082] 將藥物分別用DMSO配成高濃度的原液，用含5 %的吐溫-80無(wú)菌超純水稀釋原液至 所需濃度，將稀釋好的藥物按所需劑量加入到4ml Middlebr〇〇k7Hll瓊脂培養(yǎng)基(該培養(yǎng)基 已經(jīng)121°C高壓蒸汽滅菌15分鐘、冷卻至50~55°C)，混勻，制成含藥物，濃度分別為6.Oug/ ml，4·Oug/ml，3 ·Oug/ml，2 ·Oug/ml，1 · 5ug/ml，1 ·Oug/ml，0 · 75ug/ml，0 · 5ug/ml等濃度的斜 面培養(yǎng)基。
[0083] 將濃度為lmg/ml的結(jié)核分枝桿菌臨床分離耐ISRE MTB株菌懸液用接種環(huán)蘸取數(shù) 環(huán)，分別接種于含各個(gè)藥物系列濃度的培養(yǎng)基和空白對(duì)照培養(yǎng)基斜面上，置于37°C培養(yǎng)4~ 8周，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)果如表3所示。
[0084] 表3固體培養(yǎng)基稀釋法測(cè)定組合物抗結(jié)核菌絕對(duì)濃度結(jié)果
[0090] 結(jié)論:組合物具有很強(qiáng)的抗結(jié)核菌和抗耐藥性結(jié)核菌活性，可作為治療結(jié)核菌感 染疾病的先導(dǎo)化合物，也可用于制備治療結(jié)核病藥物?；衔颕II和化合物IV無(wú)抗結(jié)核菌和 抗耐藥性結(jié)核菌活性，不能作為治療結(jié)核菌感染疾病的先導(dǎo)化合物，也不能用于制備治療 結(jié)核病藥物。
[0091] 實(shí)施例9本發(fā)明所涉及組合物片劑的制備
[0092] 取2克組合物，加入制備片劑的常規(guī)輔料18克，混勻，常規(guī)壓片機(jī)制成100片。
[0093] 實(shí)施例10本發(fā)明所涉及組合物膠囊的制備
[0094] 取2克組合物，加入制備膠囊劑的常規(guī)輔料如淀粉18克，混勻，裝膠囊制成100粒。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種組合物，其特征為該組合物由化合物HI和化合物IV組成，該組合物中化合物 III和化合物IV的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為55%和45%，2. 如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征為:將化合物III的粉末和化合物IV 的粉末按照質(zhì)量百分?jǐn)?shù)分別為55%和45%充分混合。3. -種如權(quán)利要求1所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為細(xì)菌。5. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為真菌。6. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為幽口螺桿菌。7. 如權(quán)利要求3所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述菌為結(jié)核菌。8. 如權(quán)利要求5所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為：所述真菌為紅色毛癖 菌、羊毛狀小抱子菌或者斷發(fā)癖菌。9. 如權(quán)利要求4所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述細(xì)菌為大腸桿菌、 巧光假單抱菌、金黃色葡萄球、變形桿菌或者新生隱球菌。10. 如權(quán)利要求7所述的組合物在抗菌藥物中的應(yīng)用，其特征為:所述結(jié)核菌為卡介苗、 結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37RV株和耐多藥結(jié)核分枝桿菌。
【文檔編號(hào)】A61P31/10GK106074518SQ201610403677
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月8日
【發(fā)明人】丁秋菊
【申請(qǐng)人】南京海澳斯生物醫(yī)藥科技有限公司