本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有心血管疾病預(yù)防和治療活性的黃芪甲苷衍生物黃芪苷酸或其可藥用鹽、酯和酰胺的制備方法及用途。

背景技術(shù)：

黃芪甲苷是中藥黃芪的主要活性成分之一，也是《中國藥典》中多種中藥復(fù)方制劑的定性定量指標(biāo)成分。藥理學(xué)研究表明，黃芪甲苷具有可改善心肺功能、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抗病毒、抗應(yīng)激等多種功效(Ren S,et al.Pharmacological effects of Astragaloside IV:a literature review.Journal of Traditional Chinese Medicine,2013,33(3):413-416)。雖然黃芪甲苷藥效顯著，但其水溶性差、胞膜通透性差，決定了其吸收不好，生物利用度低，成藥性很差。如黃芪甲苷在大鼠模型中的絕對(duì)生物利用度僅有2.2％(Gu Y,et al.Transport and bioavailability studies of Astragaloside IV,an active ingredient in Radix Astragali.Basic&Clinical Pharmacology&Toxicology,2004,95(6):295–298)。這些嚴(yán)重阻礙了其單方制劑的開發(fā)，尤其是注射液、大輸液等水溶性劑型的開發(fā)。目前有少量研究通過制劑的方式來增加其水溶性，如將其制成糊精包合物(CN100393319C；陳國廣,陳振華,劉伯成,等.羥丙基-β-環(huán)糊精對(duì)黃芪甲苷包合作用的研究.時(shí)珍國醫(yī)國藥,2007,18(6):1457-1458)或磷脂復(fù)合物(劉愛娜,陳昊,唐星.黃芪甲苷脂質(zhì)微球注射液的制備及其物理穩(wěn)定性研究.中國藥劑學(xué)雜志:網(wǎng)絡(luò)版,2009(4):290-298)。

眾多學(xué)者希望通過引入水溶性基團(tuán)的方法直接增加黃芪甲苷水溶性，以更適合于藥物(尤其是一類新藥)的開發(fā)。但是，由于黃芪甲苷分子活性反應(yīng)位點(diǎn)較多：涉及伯、仲、叔三種不同類型9個(gè)羥基的保護(hù)與脫保護(hù)、兩個(gè)糖鏈在反應(yīng)過程中極易脫落、母核中的環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)和四氫呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)均極易開環(huán)，因此，到目前為止尚無一個(gè)切實(shí)可行的方法制備黃芪甲苷水溶性衍生物。如任戎嘗試合成了水溶性的黃芪甲苷-C6”-O-磷酸酯衍生物，但是該合成路線副反應(yīng)多、收率低、分離純化復(fù)雜，而且藥代預(yù)試驗(yàn)表明該衍生物并不具有前藥性質(zhì)(任戎.黃芪甲苷的提取及其磷酸酯水溶性前藥的合成研究[D].天津大學(xué)碩士學(xué)位論文,2009)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的在于提供一種具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(我們將其命名為黃芪苷酸)或其可藥用鹽、酯和酰胺，其結(jié)構(gòu)式為：

本發(fā)明的第二目的在于提供具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，巧妙地實(shí)現(xiàn)了將黃芪甲苷分子中特定醇羥基定向氧化為羧基，得到黃芪苷酸。該方法步驟簡單、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)小、收率高，適合規(guī)?；a(chǎn)。

本發(fā)明的第三目的在于提供具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽、酯和酰胺的應(yīng)用，即用該化合物來預(yù)防與治療心血管疾病。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，主要包括如下步驟：

取一定量的黃芪甲苷，加入到0.1～10倍質(zhì)量的第一溶劑中，依次加入0.01～5倍質(zhì)量的鹵化堿、0.01～5倍質(zhì)量的哌啶類氮氧化合物、0.01～5倍質(zhì)量的次鹵酸或其鹽，在-10℃～100℃中反應(yīng)10～600min，過濾，濾液用酸調(diào)pH至酸性，待固體析出后，濃縮，固液分離，固體用第二溶劑溶解、轉(zhuǎn)移、濃縮至干，得白色粉末即為具有式1結(jié)構(gòu)的化合物。

根據(jù)上述制備方法制得的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺，包括：具有式1結(jié)構(gòu)的化合物與堿金屬、堿土金屬、無機(jī)氨、有機(jī)胺在常規(guī)的成鹽條件下所形成的鹽，具有式1結(jié)構(gòu)的化合物與醇在常規(guī)的酯化條件下所形成的酯，和具有式1結(jié)構(gòu)的化合物與無機(jī)氨、有機(jī)胺在常規(guī)的成酰胺條件下所形成的酰胺。具體而言，指其鉀鹽、鈉鹽、鈣鹽、鋰鹽、鐵鹽、鋅鹽、鎂鹽、銨鹽、一甲胺鹽、二甲胺鹽、三甲胺鹽、乙二胺鹽、一乙醇胺鹽、二乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、一乙胺鹽、二乙胺鹽、三乙胺鹽，以及甲酯、乙酯、丙酯、異丙醇酯、丙二醇酯、丁酯、叔丁酯、甘油酯、甲酰胺、乙酰胺、哌嗪酰胺、氫化吡啶酰胺、咪唑酰胺、吡咯酰胺或哌啶酰胺。

本發(fā)明還提供了具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺在心血管疾病預(yù)防和(或)治療中的應(yīng)用。

通過對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)具有式1結(jié)構(gòu)的化合物可顯著提高急性缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率和線粒體活性，降低心肌酶釋放，減輕細(xì)胞氧化損傷，對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧損傷表現(xiàn)出亦具有顯著的保護(hù)作用，提示了具有式1結(jié)構(gòu)的化合物在制備抗急性心肌缺血藥物中的用途。

本發(fā)明還提供了一種可用于心血管疾病預(yù)防和(或)治療作用的藥物組合物，它是由有效量的所述的化合物為活性成分，加入藥學(xué)上可接收的輔料制備而成的制劑。其中，所述的制劑是口服制劑或者注射制劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

①明顯增加了黃芪皂苷類化合物的水溶性，大大改善了黃芪甲苷的成藥性，可以將所得到的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺為單方制劑開發(fā)，尤其是注射液、大輸液等水溶性劑型的開發(fā)。

②經(jīng)檢索，本發(fā)明所得的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺是全新結(jié)構(gòu)的化合物，可作為活性先導(dǎo)化合物開發(fā)成一類新藥。

③本發(fā)明提供的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺的制備方法，巧妙地一步反應(yīng)即實(shí)現(xiàn)了黃芪甲苷分子中特定醇羥基的定向氧化，步驟簡單、反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)小、收率高，容易實(shí)現(xiàn)，適合工業(yè)大生產(chǎn)。

④藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，具有式1結(jié)構(gòu)的化合物或其可藥用鹽、酯和酰胺具有保護(hù)心肌細(xì)胞缺氧損傷作用，可用于心血管疾病的預(yù)防和(或)治療。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，以下將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1為具有式1結(jié)構(gòu)化合物部分關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元的HMBC相關(guān)信號(hào)；

圖2為具有式1結(jié)構(gòu)化合物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)損傷心肌細(xì)胞細(xì)胞存活率的影響(X土s，n＝6～8)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，***P<0.001；

圖3為具有式1結(jié)構(gòu)化合物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)損傷心肌細(xì)胞線粒體活性的影響(X土s，n＝6～12)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，*P<0.05,***P<0.001；

圖4為具有式1結(jié)構(gòu)化合物對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)損傷心肌細(xì)胞LDH、CK的影響(X土s，n＝3)與NOEMOXIA組比較，###P<0.001，與H/R組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1

本實(shí)施例提供權(quán)利要求1所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法及其結(jié)構(gòu)鑒定：

(1)化合物制備：取100mg黃芪甲苷，加入到500mL的10％吡啶中，依次加入25mg溴化鈉、5mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、1mL次氯酸鈉，在0℃中反應(yīng)120min，過濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH 3，待固體析出后，濃縮至20mL，固液分離，固體用甲醇溶解轉(zhuǎn)移，濃縮至干，得白色粉末89.7mg即為具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(HPLC純度98.8％)。

(2)結(jié)構(gòu)鑒定：

白色無定形粉末；TLC展開后噴5％濃硫酸/乙醇顯紫紅色；(c,1.0,MeOH)；IR(KBr)：Vmax：3417,2968,1732,1621,1378,1156,1066,1045cm^-1。HR-ESI-MS準(zhǔn)分子離子峰m/z[M+Na]⁺821.4294(Calcd.forC₄₁H₆₆NaO₁₅:821.4294)，推斷該化合的分子式為：C₄₁H₆₆O₁₅。

¹H NMR顯示有2個(gè)糖基異頭氫信號(hào)：δ_H 5.05和δ_H 4.83，¹³C NMR也顯示了2個(gè)相應(yīng)的碳信號(hào)：δ_C 107.4和105.4，據(jù)此推測化合物含有2個(gè)糖基片段。負(fù)離子ESI-MS顯示m/z 797[M-H]^-，MSⁿ碎片峰分別為m/z 621[(M-H)-177]^-(掉一個(gè)葡萄糖醛酸基)、665[(M-H)-132]^-(掉一個(gè)木糖基)；將該化合物酸水解后，TLC顯示在葡萄糖醛酸和木糖相同位置處有顯色斑點(diǎn)；這些結(jié)果表明糖鏈由葡萄糖醛酸和木糖兩種構(gòu)成。

¹H-NMR譜圖上在δ_H 1.96、1.53、1.35、1.29、1.26、1.24和0.96處顯示7個(gè)甲基信號(hào)峰，通過與黃芪甲苷的¹³C NMR數(shù)據(jù)對(duì)照，確定該化合物的母核未變化，仍然為環(huán)阿屯烷型。結(jié)合上述2個(gè)糖基的分析，表明苷元為黃芪皂苷元。

與黃芪甲苷相比，化合物的¹³C NMR顯示有一個(gè)的羧基信號(hào)峰δ_C172.7，沒有黃芪甲苷的葡糖基6”信號(hào)峰；化合物的¹³C NMR顯示苷元的C-3和C-6均產(chǎn)生了苷化位移，分別是δ_C88.2和δ_C 79.0，從而確定化合物糖基應(yīng)該連接在苷元的C-3和C-6位；HMBC譜上木糖H-1與苷元C-3、葡萄糖醛酸H-1與苷元C-6之間的遠(yuǎn)程相關(guān)證實(shí)這種推測。HMBC譜的關(guān)鍵遠(yuǎn)程相關(guān)見圖1。

綜合ESI-MSⁿ、HR-ESI-MS、¹H NMR、¹³C NMR、DEPT、¹H-¹H COSY、HMBC、HMQC等波譜分析，并與黃芪甲苷對(duì)照，鑒定化合物結(jié)構(gòu)為式1。經(jīng)查，該化合物為一個(gè)新化合物，命名為黃芪苷酸。式1化合物的NMR數(shù)據(jù)見表1。

表1黃芪苷酸¹³C-NMR(150MHz)及DEPT數(shù)據(jù)(C₅D₅N)

實(shí)施例2

本實(shí)施例提供權(quán)利要求1所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，與實(shí)施例1相比不同之處在于調(diào)整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到50mL的水中，依次加入25mg溴化鈉、10mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、0.25mL次氯酸鈉，在20℃中反應(yīng)120min，過濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH 2，待固體析出后，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉(zhuǎn)移，濃縮至干，得白色粉末91.3mg即為具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(HPLC純度99.1％)。

實(shí)施例3

本實(shí)施例提供權(quán)利要求1所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，與實(shí)施例1相比不同之處在于調(diào)整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到10mL的10％DMF中，依次加入20mg溴化鈉、8mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、0.20mL次氯酸鈉，在0℃中反應(yīng)120min，過濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH 3，待固體析出后，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉(zhuǎn)移，濃縮至干，得白色粉末82.7mg即為具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(HPLC純度97.9％)。

實(shí)施例4

本實(shí)施例提供權(quán)利要求1所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物的制備方法，與實(shí)施例1相比不同之處在于調(diào)整了溶劑和試劑的比例：

取100mg黃芪甲苷，加入到1L水中，依次加入500mg溴化鈉、500mg的2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基、5mL次氯酸鈉，在0℃中反應(yīng)120min，過濾，濾液用濃鹽酸調(diào)pH 2，待固體析出后，濃縮至10mL，固液分離，固體用乙醇溶解轉(zhuǎn)移，濃縮至干，得白色粉末86.8mg即為具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(HPLC純度98.2％)。

實(shí)施例5

本實(shí)施例提供權(quán)利要求13所述的具有式1結(jié)構(gòu)的化合物(本實(shí)施例中以DQ798作代號(hào))對(duì)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞缺氧損傷的保護(hù)作用：

1、實(shí)驗(yàn)方法：

1.1大鼠心室肌細(xì)胞系H9c2細(xì)胞培養(yǎng)：H9c2細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基中,于5％CO₂，飽和濕度及37℃條件下培養(yǎng)，每2～3d更換一次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80-90％融合時(shí)傳代或凍存或進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞以8×10⁴或1.2×10⁵cells/ml的密度分別接種于96或6孔板中，于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2心肌細(xì)胞缺氧再復(fù)氧模型建立：取培養(yǎng)48h的H9c2細(xì)胞，用K-B buffer(預(yù)先充入95％N₂-5％CO₂混合氣飽和30min)替代正常培養(yǎng)基，而后迅速將培養(yǎng)板移入通有95％N₂-5％CO₂混合氣的缺氧裝置中，37℃缺氧培養(yǎng)3h。取出培養(yǎng)板，更換正常培養(yǎng)基并置于常規(guī)培養(yǎng)箱復(fù)氧3h。

1.3實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組(Normoxia)、缺氧復(fù)氧組(H/R)、DQ798預(yù)處理組高、中、低劑量組(2.5、5和10mg/L)，共5組，每組設(shè)6復(fù)孔。除正常對(duì)照組外，其他各組均缺氧處理3h再復(fù)氧3h，正常對(duì)照組則于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中同步孵育6h。

1.4 MTT檢測方法：取出各組樣本，每孔加入20ul MTT(5g/L)，于37℃、5％CO₂箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，倒板。加入150ul DMSO振搖15min，使結(jié)晶充分溶解，于測定波長570nm、參考波長630nm處，測定各孔吸亮度(OD)值。

MTT代謝率(％)＝實(shí)驗(yàn)組OD值/正常對(duì)照組OD值X 100％

1.5線粒體活性檢測:按照線粒體活性試劑盒(Abcam,USA)標(biāo)準(zhǔn)操作，多孔讀板儀(Infinite M200pro microplate reader)讀取熒光強(qiáng)度(590nm/550nm)計(jì)算活性強(qiáng)度。

1.6生化指標(biāo)檢測：取培養(yǎng)于24孔板的各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用比色法測定LDH、CK活性，用黃嘌呤氧化酶法測定細(xì)胞內(nèi)SOD活性；用硫代巴比妥酸比色法測定細(xì)胞內(nèi)MDA含量，具體檢測過程及操作方法按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

2.1 DQ798顯著提高心肌細(xì)胞存活率

與Normoxia組比較，H/R組細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01)。2.5、5和10mg/L DQ798預(yù)處理組能夠提高細(xì)胞存活率，其作用并呈濃度依賴關(guān)系。5和10mg/L DQ798預(yù)處理組明顯提高細(xì)胞存活率為76.04％(P<0.01)和82.44％(P<0.001)，結(jié)果如圖2所示。

2.2 DQ798顯著提高心肌細(xì)胞線粒體活性

體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞由缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)損失后，線粒體功能異常，氧化呼吸鏈?zhǔn)軗p，ATP產(chǎn)生減少。通過快速檢測細(xì)胞內(nèi)線粒體活性，可以提示化合物對(duì)線粒體損失的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：2.5、5和10mg/L DQ798預(yù)處理組，熒光分光亮度計(jì)測得熒光強(qiáng)度顯著高于H/R組，表明均可顯著增加線粒體活性(P<0.01)，結(jié)果如圖3所示，說明DQ798能對(duì)抗缺氧復(fù)氧對(duì)心肌細(xì)胞線粒體的損害，可能通過保護(hù)線粒體功能發(fā)揮心肌細(xì)胞保護(hù)作用。

2.3 DQ798顯著降低缺氧誘導(dǎo)心肌酶升高

缺氧復(fù)氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷時(shí)，心肌損傷標(biāo)志物L(fēng)DH和CK將明顯升高。2.5、5和10mg/L DQ798預(yù)處理組的3個(gè)劑量組與H/R組相比，LDH、CK均明顯降低，表明DQ798可在急性缺氧條件下保護(hù)心肌細(xì)胞，上述結(jié)果見圖4。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)論

DQ798可顯著提高急性缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活率和線粒體活性，降低心肌酶釋放，減輕細(xì)胞氧化損傷，對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞缺氧損傷表現(xiàn)出具有顯著的保護(hù)作用，提示了DQ798在制備抗急性心肌缺血藥物中的用途。