本發(fā)明涉及淋巴毒素衍生物lt008的新用途，屬于醫(yī)藥新用途技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

本發(fā)明所說(shuō)的核輻射指原子核從一種結(jié)構(gòu)或一種能量狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N結(jié)構(gòu)或另一種能量狀態(tài)過(guò)程中所釋放出來(lái)的微觀粒子流。由于目前環(huán)境污染、能源緊缺，核能作為一種高效清潔的能源，在全球被廣泛運(yùn)用。但是，核泄露導(dǎo)致的安全隱患卻對(duì)人類的生存產(chǎn)生巨大的影響。核輻射可導(dǎo)致急性、慢性的組織損傷甚至嚴(yán)重的器官功能障礙，尤其對(duì)增殖更新迅速的細(xì)胞構(gòu)成的組織造成的損傷更為嚴(yán)重。輻射后病人死亡的主要原因是由于骨髓抑制導(dǎo)致的造血功能障礙以及外周血白細(xì)胞下降，繼而使免疫功能損傷，導(dǎo)致繼發(fā)性感染。因此，保護(hù)和恢復(fù)骨髓功能是關(guān)系到輻射損傷患者預(yù)后的關(guān)鍵因素之一，但目前對(duì)核輻射導(dǎo)致的骨髓損傷尚缺乏有效的防護(hù)手段和治療方法。

美國(guó)genentech公司早在1996年就發(fā)現(xiàn)野生型淋巴毒素α（lymphotoxinα，ltα）對(duì)核輻射造成的小鼠骨髓損傷具有保護(hù)作用，但由于在隨后的臨床前動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)野生型ltα可以引起明顯的不良反應(yīng)，如嚴(yán)重的毛細(xì)血管滲漏、低血壓和寒戰(zhàn)發(fā)熱等，從而使ltα的應(yīng)用研究未能深入進(jìn)行。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了淋巴毒素衍生物lt008（別名lta-55）的新用途，特別是在制備治療輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴(yán)重的器官功能障礙的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明在野生型ltα的基礎(chǔ)上，最初從降低野生型ltα的毒副作用的角度出發(fā)，開(kāi)發(fā)n端缺失27個(gè)氨基酸殘基的ltα衍生物（ltα-27）用于聯(lián)合化療。臨床前動(dòng)物試驗(yàn)表明，ltα-27聯(lián)合化療藥物能夠發(fā)揮明顯的協(xié)同殺傷上皮來(lái)源腫瘤的作用，而不會(huì)誘導(dǎo)骨髓來(lái)源細(xì)胞凋亡的發(fā)生，反而會(huì)保護(hù)骨髓來(lái)源細(xì)胞對(duì)抗化療藥物的細(xì)胞毒作用。但ltα-27在臨床i期階段仍有70%的受試者出現(xiàn)比較嚴(yán)重的寒戰(zhàn)發(fā)熱，限制了它的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)，然而令人意外的發(fā)現(xiàn)是臨床i期聯(lián)合使用ltα-27的化療病人，其血小板、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞下降幅度明顯低于單獨(dú)使用化療藥物的患者，即ltα-27顯現(xiàn)出明顯的骨髓/造血細(xì)胞保護(hù)作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)ltα通過(guò)與腫瘤壞死因子受體1(tumornecrosisfactorreceptor1,tnfr1)和tnfr2結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)通路發(fā)揮其生物學(xué)作用，其中毒副作用主要與tnfr2結(jié)合有關(guān)。因此在此研究基礎(chǔ)上，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和實(shí)驗(yàn)篩選，得到與tnfr1特異性結(jié)合，但親和力適中的淋巴毒素衍生物lt008。初步的藥效學(xué)結(jié)果顯示：lt008在獼猴上能夠使血小板和淋巴細(xì)胞上升，對(duì)抗化療藥物的骨髓損傷作用，在小鼠上能夠?qū)购溯椛涔撬钃p傷使生存率顯著增加。為開(kāi)拓淋巴毒素衍生物的新用途提供了依據(jù)。具體生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)論包括以下方面：

（1）lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的小鼠損傷有保護(hù)作用：lt008能使小鼠的生存率顯著增加；能夠促進(jìn)血象的回升；促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)；增加脾臟的髓外造血；

（2）lt008能保護(hù)核輻射導(dǎo)致的thp-1細(xì)胞的損傷：lt008能減少核輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡；減少核輻射導(dǎo)致的ros的產(chǎn)生；逆轉(zhuǎn)核輻射導(dǎo)致的細(xì)胞周期的阻滯，促進(jìn)細(xì)胞增殖；

（3）lt008在thp-1細(xì)胞和小鼠體內(nèi)均能激活nlrp3炎癥小體，lt008在小鼠骨髓還能促進(jìn)p52核轉(zhuǎn)位，激活nf-κb；

（4）lt008對(duì)三種基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核輻射后導(dǎo)致的損傷保護(hù)作用下降,表明lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的小鼠損傷的保護(hù)作用與nlrp3炎癥小體有關(guān)；

（5）lt008能在小鼠脾臟中促進(jìn)凋亡抑制因子bcl-xl的表達(dá)，該作用可能與血小板的再生，進(jìn)而機(jī)體重新啟動(dòng)免疫有關(guān)；

因此，lt008在防治核輻射性疾病，特別是治療輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴(yán)重的器官功能障礙疾病方面具有良好的效果，可制備成應(yīng)用于此方面的新藥。

附圖說(shuō)明

圖1為野生型小鼠輻照后生存率曲線圖：a:雌性小鼠的生存率曲線圖；b:雄性小鼠的生存率曲線圖；c:雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后的生存率曲線圖；

圖2為野生型小鼠輻照后體重變化圖：a:雌性小鼠體重變化圖；b:雄性小鼠體重變化圖；c:雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后體重變化圖；

圖3為lt008對(duì)wt小鼠rbc影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠rbc的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠rbc的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后rbc的影響曲線圖；

圖4為lt008對(duì)wt輻照小鼠hgb影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠hgb的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠hgb的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后hgb的影響曲線圖；

圖5為lt008對(duì)wt輻照小鼠retic%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠retic%的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠retic%的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后retic%的影響曲線圖；

圖6為lt008對(duì)輻照小鼠plt影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后的影響曲線圖；

圖7為lt008對(duì)小鼠wbc影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后的影響曲線圖；

圖8為lt008對(duì)小鼠lymph%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后的影響曲線圖；

圖9為lt008對(duì)小鼠neut%影響曲線圖：a:野生型雌性小鼠的影響曲線圖；b:野生型雄性小鼠的影響曲線圖；c:野生型雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后的影響曲線圖；

圖10.lt008對(duì)輻照后wt小鼠骨髓損傷的保護(hù)作用（骨髓涂片）w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對(duì)照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當(dāng)天為d0，輻照后24小時(shí)為d1，以此類推；

圖11.lt008對(duì)wt小鼠輻照后骨髓病理組織學(xué)的影響：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對(duì)照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當(dāng)天為d0，輻照后24小時(shí)為d1，以此類推；

圖12.lt008對(duì)wt小鼠輻射后脾臟髓外造血的影響：w3：野生型c57bl/6小鼠pbs對(duì)照組；w4：野生型c57bl/6小鼠lt008組；d0~d28：輻照當(dāng)天為d0，輻照后24小時(shí)為d1，以此類推；

圖13.lt008對(duì)thp-1細(xì)胞增殖的影響（a）及對(duì)輻照致細(xì)胞損傷后保護(hù)作用觀察（b）；

圖14.lt008對(duì)輻射后thp-1細(xì)胞的細(xì)胞周期的影響；

圖15.在輻射情況下lt008對(duì)thp-1細(xì)胞內(nèi)ros產(chǎn)生的影響；

圖16.lt008對(duì)輻射導(dǎo)致thp-1細(xì)胞焦亡的影響；

圖17.lt008對(duì)nlrp3炎癥小體相關(guān)基因mrna表達(dá)的影響；

圖18.lt008對(duì)thp-1細(xì)胞上清分泌il-1β的影響；

圖19.電鏡下觀察lt008和/或核輻射對(duì)thp-1細(xì)胞炎癥小體的影響a：對(duì)照組；b：10μg/mllt008處理細(xì)胞8小時(shí)；c：10gy輻射后即刻；d：lt00810μg/ml處理細(xì)胞8小時(shí)+10gy輻射后即刻；

圖20.野生小鼠脾臟免疫熒光染色效果圖(il-1β)；

圖21.lt008促進(jìn)輻照后小鼠脾臟il-1β和il-18的表達(dá)，a:lt008在輻射后d3~d5天促進(jìn)野生型小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達(dá)；b:lt008在輻射后d3~d5天對(duì)nlrp3^-/-小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達(dá)無(wú)明顯作用；

圖22.lt008對(duì)三種基因敲除小鼠輻照后生存率影響曲線圖a:lt008對(duì)雌性nlrp3^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；b:lt008對(duì)雄性asc^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；c:lt008對(duì)caspase-1^-/-小鼠輻照后生存率影響曲線圖；d:lt008對(duì)野生型和三種基因敲除小鼠輻照后生存率影響曲線圖；

圖23.lt008對(duì)對(duì)三種基因敲除小鼠輻照后體重影響曲線圖a:lt008對(duì)雌性nlrp3^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；b:lt008對(duì)雄性asc^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；c:lt008對(duì)雌性雌、雄小鼠合并統(tǒng)計(jì)后caspase-1^-/-小鼠輻照后體重影響曲線圖；

圖24.野生型小鼠胸骨免疫熒光染色（nf-κb和nlrp3）；

圖25.lt008促進(jìn)小鼠脾臟bcl-xl的表達(dá)a:lt008在輻射后d7~d18天促進(jìn)野生型小鼠脾臟bcl-xl的蛋白表達(dá)；b:lt008在輻射后d7~d18天促進(jìn)nlrp3^-/-小鼠脾臟bcl-xl的蛋白表達(dá)，但是幅度低于野生型。

具體實(shí)施方式

以下所列實(shí)施例，僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。

實(shí)施例1lt008的制備

根據(jù)公開(kāi)號(hào)為cn101084238b專利文獻(xiàn)實(shí)施例1的工藝來(lái)制備，其氨基酸序列（seqidno：1）為：

mhstlkpaahligdpskqnsllwrantdraflqdgfslsnnsllvptsgiyfvysqvvfsgkayspkatssplylahevqlfsseypfhvpllssqkmvypglqepwlhsmyhgaafqltqgdqlsthtdgiphlvlspstvffgafal。

實(shí)施例2lt008在體內(nèi)能促進(jìn)野生型c57bl/6小鼠核輻射導(dǎo)致的損傷的恢復(fù)

2.1研究方法

野生c57bl/6小鼠購(gòu)入后在spf動(dòng)物房檢疫飼養(yǎng)3周，在分組前用bs124天平稱量體重后，采用耳標(biāo)法進(jìn)行編號(hào)標(biāo)記，并根據(jù)體重隨機(jī)分組。分為pbs對(duì)照組（w1）和lt008組（w2），每組20只，雌雄各半，用于生存率的測(cè)定。另外用pbs對(duì)照組（w3）和lt008組（w4），每組60只，雌雄各半，用于血象、骨髓細(xì)胞學(xué)、骨髓病理學(xué)以及相關(guān)機(jī)制的研究。

所有l(wèi)t組小鼠在輻照前兩天和輻照當(dāng)天，75%酒精消毒后，連續(xù)三天尾靜脈注射給予250μg/kglt008。給藥濃度25μg/ml，給藥體積10ml/kg。對(duì)照組給予10ml/kg的pbs。所有組別的小鼠在第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系輻射中心進(jìn)行輻照，動(dòng)物整體暴露于60co-γ輻射下，按照1.63gy/min的輻射率進(jìn)行輻照，整體輻射量達(dá)到9.5gy，進(jìn)行生存率研究和體重監(jiān)測(cè)，1.63gy/min的輻射率進(jìn)行輻照，整體輻射量達(dá)到9.0gy，用于血象、骨髓細(xì)胞學(xué)、骨髓病理學(xué)以及相關(guān)機(jī)制的研究。

2.2研究結(jié)果

一般情況：對(duì)照組小鼠（w1）輻照當(dāng)天就出現(xiàn)活動(dòng)明顯減少，攝食及飲水也減少，但給予lt008的小鼠（w2組）輻照當(dāng)天活動(dòng)如常，攝食及飲水均無(wú)明顯減少，輻照后第二天（d1）w1組所有小鼠均靜臥，活動(dòng)進(jìn)一步減少，w2組小鼠活動(dòng)開(kāi)始略減少，輻照后第三天（d3），w1組小鼠毛發(fā)開(kāi)始蓬松，到第五天（d5），w1組小鼠幾乎全部出現(xiàn)毛發(fā)蓬松，軀體松軟無(wú)力，而w2組小鼠一直沒(méi)有明顯的毛發(fā)蓬松以及肌肉無(wú)張力現(xiàn)象。w1組小鼠第八天（d8）開(kāi)始出現(xiàn)死亡，死亡集中發(fā)生在d8~d9天，至d12天，w1組小鼠全部死亡。w2組小鼠，雌性小鼠在d14死亡兩只，雄性小鼠d18死亡一只，其余小鼠均存活至觀察期結(jié)束（d28天）。

生存率曲線顯示：lt008組小鼠的生存率顯著高于pbs對(duì)照組，在雌性小鼠、雄性小鼠分別統(tǒng)計(jì)以及雌雄小鼠一起統(tǒng)計(jì)時(shí)的結(jié)果是一致的（圖1）。

（3）體重監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：lt008對(duì)輻射后小鼠的體重恢復(fù)是有促進(jìn)作用的（圖2）。

（4）lt008對(duì)野生型c57bl/6小鼠核輻射后血象恢復(fù)有促進(jìn)作用：9.0gy輻照后，野生型pbs組（w3）的紅細(xì)胞（rbc）、血紅蛋白（hgb）的數(shù)目和紅細(xì)胞比容（hct）在輻射后均迅速降低，且無(wú)好轉(zhuǎn)趨勢(shì)，野生型lt008250μg/kg組（w4）小鼠在輻射初期上述指標(biāo)均有降低，在d10到達(dá)最低點(diǎn)，之后開(kāi)始回升，在d21左右基本恢復(fù)正常。該結(jié)果表明lt008對(duì)野生小鼠核輻射后造血功能的損傷有保護(hù)作用（圖3至圖5）。

網(wǎng)織紅細(xì)胞（retic）是尚未完全成熟的紅細(xì)胞，在周圍血液中的數(shù)值可反映骨髓紅細(xì)胞的生成功能，從原始紅細(xì)胞階段增殖到晚幼紅細(xì)胞階段共分裂3~4次，約需72小時(shí)，紅細(xì)胞數(shù)由一個(gè)變?yōu)?~16個(gè)。晚幼紅細(xì)胞階段以后的細(xì)胞不再分裂，發(fā)育過(guò)程中核被排出而成為網(wǎng)織紅細(xì)胞。從晚幼紅細(xì)胞發(fā)育到成熟紅細(xì)胞約需48小時(shí)。在正常情況下骨髓中有核紅細(xì)胞并不釋放至血循環(huán)，只有網(wǎng)織紅細(xì)胞和成熟紅細(xì)胞才釋入血中，檢查末梢血中網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)，可以推知骨髓產(chǎn)生紅細(xì)胞的能力。因此，網(wǎng)織紅細(xì)胞是反映骨髓紅系造血功能以及判斷貧血和相關(guān)疾病療效的重要指標(biāo)。因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了retic的改變，結(jié)果如圖5所示，輻射后d1，w3和w4組小鼠的網(wǎng)織紅細(xì)胞均開(kāi)始降低，最低時(shí)均幾乎降低至0，但是w4組小鼠的網(wǎng)織紅細(xì)胞降到谷底后，于d10開(kāi)始逐漸代償性升高，比例大幅度上升至18%-30%，至d28左右基本恢復(fù)正常。該結(jié)果顯示lt008對(duì)紅細(xì)胞的生長(zhǎng)有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。

血小板壽命約7~14天，每天約更新總量的1/10，衰老的血小板大多在脾臟中被清除。電離輻射、烷化劑、抗代謝劑、細(xì)胞毒性制劑等理化因素可抑制骨髓，這些物質(zhì)常被用來(lái)治療惡性腫瘤，或者直接損害骨髓細(xì)胞，或者引發(fā)免疫反應(yīng)，甚至使骨髓出現(xiàn)彌漫性損傷，導(dǎo)致全血細(xì)胞減少。有少數(shù)患者的巨核細(xì)胞對(duì)輻射較敏感，可只表現(xiàn)為血小板和巨核細(xì)胞減少。因此我們也檢測(cè)了血小板的改變，結(jié)果如圖6所示，與w3組相比，w4組（lt008組）小鼠輻射前plt略低于w3組（pbs對(duì)照組），在輻射后d1，w3組較輻射前有顯著升高以外，w4組plt迅速下降，兩組均在d5降至最低值，隨后w4組小鼠的plt有所恢復(fù)，在d21左右基本恢復(fù)正常，而pbs組的小鼠無(wú)恢復(fù)，直至最后死亡。

對(duì)野生小鼠血象白細(xì)胞系監(jiān)測(cè)的結(jié)果顯示：對(duì)野生型小鼠，lt008組（w4組）和pbs對(duì)照組（w3組）白細(xì)胞總數(shù)（wbc）在輻射后d1均開(kāi)始急速下降，d3降至最低，w4組小鼠在d14開(kāi)始有恢復(fù)的趨勢(shì)，存活小鼠在d21~d28基本恢復(fù)正常，而w3組小鼠的wbc持續(xù)至觀察終點(diǎn)（動(dòng)物死亡）未有明顯恢復(fù)趨勢(shì)（圖7）。小鼠lymph%和neut%的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)lt008組和pbs輻射對(duì)照組之間未見(jiàn)明顯的趨勢(shì)性差異，這有可能和輻射后小鼠白細(xì)胞總數(shù)下降至極低值以及個(gè)體之間的差異而導(dǎo)致（圖8和9）。

（5）lt008對(duì)野生型c57bl/6小鼠核輻射后的骨髓恢復(fù)有促進(jìn)作用

用同樣的9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續(xù)三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對(duì)照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時(shí)間點(diǎn)脫頸椎處死小鼠后，取下肢股骨做骨髓涂片，進(jìn)行骨髓細(xì)胞學(xué)檢查，取胸骨做病理切片，行病理組織學(xué)檢查。結(jié)果顯示輻射前（d0），w3組和w4的骨髓情況接近，輻射后d1（24h），w3組損傷情況較w4組輕，但是d3天開(kāi)始，骨髓損傷程度兩者接近，d7開(kāi)始，w4組骨髓損傷開(kāi)始有明顯的好轉(zhuǎn)，骨髓有核細(xì)胞增生較活躍，但是w3組骨髓有核細(xì)胞增生仍舊低下，直至d14開(kāi)始，w3組存活小鼠的骨髓有核細(xì)胞才顯示出增生較活躍，而此時(shí)w4組的骨髓各系的細(xì)胞形態(tài)、比例以及染色均呈現(xiàn)出恢復(fù)趨勢(shì)。至d18，w4組各系細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，而w3組則仍顯示出骨髓有核細(xì)胞增生欠活躍，僅可見(jiàn)少量有核紅細(xì)胞。d21，w4組骨髓完全恢復(fù)正常，而w3組動(dòng)物均死亡，未采集到d21天的骨髓。從骨髓涂片結(jié)果顯示，w4組較w3有明顯的保護(hù)作用（圖10）。

野生型小鼠骨髓切片的病理結(jié)果顯示：在輻射的作用下，w3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開(kāi)始，骨髓的增生開(kāi)始降低，至d3極度降低，該情況一直持續(xù)至d18，并且骨髓的淤血、出血和水腫程度加深。在lt008作用下，w4組野生型小鼠的骨髓切片顯示在d1仍然增生活躍，d3開(kāi)始，骨髓增生極度降低，d10骨髓增生降低程度緩解，d14骨髓增生開(kāi)始恢復(fù)，局灶性造血細(xì)胞恢復(fù)，而至d18，骨髓相恢復(fù)正常，骨髓增生增強(qiáng)。由于w3組動(dòng)物在d18后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結(jié)果。以上結(jié)果顯示，在lt008的作用下，輻照后的野生型小鼠的骨髓造血功能恢復(fù)較pbs對(duì)照組有明顯的增強(qiáng)（圖11）。

（6）、lt008對(duì)野生型c57bl/6小鼠核輻射后脾臟的髓外造血有促進(jìn)作用

用同樣的9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續(xù)三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對(duì)照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時(shí)間點(diǎn)脫頸椎處死小鼠后，取脾臟做病理切片，行病理組織學(xué)檢查。脾臟的病理組織學(xué)結(jié)果表明：野生型小鼠lt008組（w4）和pbs組（w3）均在輻照后d1就出現(xiàn)白髓淋巴細(xì)胞減少，從d7開(kāi)始，w4組開(kāi)始出現(xiàn)淋巴樣增生，d10開(kāi)始出現(xiàn)髓外造血，說(shuō)明在lt008的作用下，由于骨髓功能的抑制，脾臟開(kāi)始代償性出現(xiàn)髓外造血，以彌補(bǔ)機(jī)體造血能力的不足，而pbs組僅出現(xiàn)淋巴樣增生，未出現(xiàn)明顯的髓外造血現(xiàn)象（圖12）。以上結(jié)果說(shuō)明，lt008對(duì)輻射后小鼠的脾臟髓外造血功能有促進(jìn)作用。

以上研究結(jié)果表明，lt008能通過(guò)促進(jìn)輻照后的野生型小鼠的一般狀況和體重的恢復(fù)，增加輻照后小鼠的生存率，促進(jìn)輻照小鼠外周血象、骨髓造血功能的恢復(fù)以及增加其脾外造血功能進(jìn)而彌補(bǔ)機(jī)體因輻照造成的骨髓造血功能的不足來(lái)發(fā)揮輻射保護(hù)作用。

實(shí)施例3lt008體外對(duì)核輻射導(dǎo)致人單核細(xì)胞thp-1損傷的保護(hù)作用

3.1lt008能促進(jìn)thp-1細(xì)胞的增殖并促進(jìn)輻照下thp-1細(xì)胞的存活

（1）方法：不同濃度的lt008（0、0.1、1、10和50μg/ml）處理thp-1細(xì)胞不同的時(shí)間（0、1、4、8、24、48和72小時(shí)）后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)來(lái)做細(xì)胞的增殖曲線；用上述不同濃度的lt008作用于細(xì)胞后即刻進(jìn)行總量6gy60co-γ的輻照（1.63gy/min），0、1、4、8、24、48、72h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果見(jiàn)圖13。

（2）試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖13a所示，與對(duì)照組相比，0~10μg/mllt008處理細(xì)胞不同時(shí)間細(xì)胞數(shù)沒(méi)有明顯改變，但50μg/mllt008處理細(xì)胞4h后thp-1細(xì)胞數(shù)目明顯開(kāi)始增多，約為對(duì)照的1.26倍（p<0.05），72小時(shí)約為對(duì)照的1.55倍（p<0.05），以上結(jié)果表明在50μg/mllt008對(duì)thp-1細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。進(jìn)行總量6gy60co-γ的輻照（1.63gy/min）后，0、1、4、8、24、48、72h進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果如圖13b所示，1μg/ml和10μg/mllt008處理組在72h檢測(cè)點(diǎn)細(xì)胞數(shù)明顯多于對(duì)照組（p<0.05）。而50μg/mllt008處理組4小時(shí)開(kāi)始細(xì)胞數(shù)就明顯多于對(duì)照組，一直到觀察的72小時(shí)均高于對(duì)照組。以上結(jié)果表明在體外，lt008對(duì)輻射導(dǎo)致的thp-1細(xì)胞損傷有一定的保護(hù)作用。

3.2lt008能夠逆轉(zhuǎn)輻照導(dǎo)致的thp-1細(xì)胞g2期的阻滯

（1）方法：不同濃度的lt008（0、1、10和50μg/ml）處理thp-1細(xì)胞8小時(shí)，除對(duì)照組細(xì)胞外，所有細(xì)胞用6gy60co-γ的輻射，分別在0min、5min、1h、4h、8h、24h、48h、72h，1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。

（2）試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖14所示，輻射后8小時(shí)，與對(duì)照組相比，不同濃度的lt008處理的細(xì)胞g0/g1期細(xì)胞開(kāi)始降低，g2期開(kāi)始增加，24小時(shí)時(shí)g0/g1期降低十分顯著（從對(duì)照的60%降低到20%，p<0.05），g2期顯著增加（從對(duì)照的16%增加至48%左右，p<0.05），但在48小時(shí)時(shí)，50μg/mllt008處理組細(xì)胞與0μg/mllt008處理組相比g0/g1期比例顯著增加，基本恢復(fù)到無(wú)輻照時(shí)候的比例（p<0.05），g2期顯著減少至無(wú)輻照時(shí)候的比例（p<0.05）。

以上研究結(jié)果表明：輻照后細(xì)胞發(fā)生g2期阻滯，50μg/mllt008可以幫助細(xì)胞在48小時(shí)可完全逆轉(zhuǎn)g2期阻滯，恢復(fù)正常細(xì)胞周期。

3.3lt008對(duì)輻照后細(xì)胞內(nèi)ros的影響

（1）方法：用50μg/ml的lt008作用于thp-1細(xì)胞，在總量10gy60co-γ

（1.63gy/min）的輻照后5min、24h、48h、72h用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的ros。

（2）試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖15所示，在單純輻照的情況下，隨著核輻射時(shí)間的增加，ros逐漸增加，72h時(shí)為對(duì)照的5.6倍（p<0.01），50μg/ml的lt008處理細(xì)胞可以降低10gy60co-γ的輻照后細(xì)胞內(nèi)72hros的含量（p<0.05）。

3.4lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的細(xì)胞焦亡的影響

（1）方法：分別用pbs（0μg/ml）或10μg/mllt008處理thp-1細(xì)胞8小時(shí)后，10gy60co-γ的輻照（ir組）或不輻照（con組），分別在即刻、24h、48h和72h1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞焦亡。

（2）試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖16所示，細(xì)胞輻照24小時(shí)后，細(xì)胞焦亡明顯增加（p<0.01），10μg/mllt008組細(xì)胞在輻射后24h、48h以及72h和單純輻射組相比，細(xì)胞焦率均顯著降低（p<0.05，p<0.01），該結(jié)果顯示：lt008能顯著降低輻射后thp-1細(xì)胞的焦亡比率，lt008對(duì)輻射后的thp-1細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

實(shí)施例4lt008對(duì)核輻射損傷保護(hù)的機(jī)制研究

核輻射對(duì)機(jī)體致死性損傷的主要原因是骨髓抑制、免疫系統(tǒng)抑制、胃腸道損傷等，這些損傷都會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)，因此炎癥損傷是核輻射的重要環(huán)節(jié)。機(jī)體在感受到急性損傷信號(hào)或者狀態(tài)失穩(wěn)時(shí)會(huì)啟動(dòng)炎癥反應(yīng)機(jī)制^[4-6]，炎癥小體是一蛋白質(zhì)復(fù)合物，它們能夠識(shí)別各種不同的炎癥刺激信號(hào)，其中包括damp信號(hào)，并通過(guò)多個(gè)信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫和炎癥相關(guān)基因表達(dá)，從而使機(jī)體能抵御應(yīng)激造成的損傷^[7-8]。而nlrp3炎癥小體活化后產(chǎn)生的il-1β和il-18在機(jī)體的適應(yīng)性免疫中起著重要作用，前面的細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)表明lt008對(duì)輻射導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ros的產(chǎn)生、細(xì)胞焦亡等均有影響，而細(xì)胞內(nèi)ros和細(xì)胞焦亡都和nlrp3炎癥小體相關(guān)，因此接下來(lái)我們研究lt008對(duì)nlrp3炎癥小體有何影響。

4.1ltα-5能在體外和體內(nèi)激活nlrp3炎癥小體，并且對(duì)輻射后的細(xì)胞有保護(hù)作用。

4.1.1lt008能促進(jìn)nlrp3炎癥小體相關(guān)基因的表達(dá)的影響

方法：不同濃度的lt008（0、0.1、1、10、50和100μg/ml）處理thp-1細(xì)胞，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)（1、3、8和24小時(shí)），1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，rt-pcr檢測(cè)nlrp3、asc、caspase-1、il-1β和il-18mrna的表達(dá)

研究結(jié)果：lt008能快速增加il-1βmrna的表達(dá)，0.1μg/ml的lt008處理細(xì)胞1小時(shí)，il-1βmrna的表達(dá)增加至對(duì)照細(xì)胞的27.1倍（p<0.01），并隨著lt008濃度的增加而逐漸增加，50μg/ml濃度時(shí)達(dá)峰值，為對(duì)照的50.6倍（p<0.01）隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，il-1βmrna的表達(dá)逐漸下降，不同濃度的lt008處理細(xì)胞3小時(shí)時(shí)，il-1βmrna為對(duì)照的3倍左右，并維持至24小時(shí)仍沒(méi)有明顯降低。lt008也能增加nlrp3和caspase-1的mrna表達(dá)，給藥后8小時(shí)開(kāi)始升高，24小時(shí)時(shí)仍沒(méi)有降至正常水平。而il-18在給藥后24小時(shí)，并且lt008大于（包含）10μg/ml的濃度水平才檢測(cè)到升高，而asc在所有濃度下的不同時(shí)間點(diǎn)均未檢測(cè)到mrna表達(dá)的升高（圖17）。

4.1.2lt008能夠促進(jìn)thp-1細(xì)胞分泌il-1β

方法：不同濃度的lt008（0、1μg/ml、100μg/ml和1mg/ml）處理thp-1細(xì)胞，24小時(shí)后1000rpm離心細(xì)胞5分鐘取上清，elisa法檢測(cè)上清中il-1β的含量。

試驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果如圖18所示，與對(duì)照組相比，1μg/ml的lt008處理細(xì)胞24小時(shí)就能增加il-1β的分泌，為對(duì)照的3.26倍（p<0.05），100μg/ml和1mg/ml的lt008處理細(xì)胞24小時(shí)能明顯增加thp-1細(xì)胞分泌il-1β，分別為對(duì)照的25.6倍（p<0.01）和29.8倍（p<0.01）。以上結(jié)果表明lt008不但能夠上調(diào)il-1β的表達(dá)，還能夠增加thp-1細(xì)胞il-1β的分泌。說(shuō)明lt008激活了nlrp3炎癥小體。

4.1.3電鏡結(jié)果顯示lt008能夠激活nlrp3炎癥小體，并對(duì)核輻射作用下thp-1細(xì)胞有保護(hù)作用

方法：將細(xì)胞分為四組，lt組（圖19b）lt00810μg/mllt008處理細(xì)胞8小時(shí)，對(duì)照組（圖19a）用等量pbs處理細(xì)胞8小時(shí)，核輻射組（圖19c）10gy60co-γ輻射即刻，lt和核輻射聯(lián)合組（圖19d）10μg/mllt008處理細(xì)胞8小時(shí)后行10gy60co-γ輻射即刻。1000rpm離心5分鐘收集細(xì)胞，pbs洗細(xì)胞兩次，4℃戊二醛固定細(xì)胞3天后電鏡下觀察。

試驗(yàn)結(jié)果：如圖19所示，與對(duì)照組相比，lt008能夠迅速激活細(xì)胞內(nèi)的nlrp3炎癥小體，電鏡下可見(jiàn)黑色致密圓點(diǎn)（圖19b）細(xì)胞基質(zhì)基本正常，核輻射也可以激活炎癥小體，但輻射后即刻收集的細(xì)胞，就可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)有較多碎片，并且有大小不等的空泡（圖19c）。lt008作用后的細(xì)胞再經(jīng)歷核輻射，可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)空泡明顯減少（圖19d），細(xì)胞的狀態(tài)好于單純輻射細(xì)胞組。

以上結(jié)果表明，lt008能激活thp-1細(xì)胞中nlrp3炎癥小體，且對(duì)核輻射導(dǎo)致的該細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用。

4.1.4lt008能夠激活促進(jìn)野生小鼠脾臟il-1β表達(dá)升高，而且該升高和nlrp3炎癥小體相關(guān)

lt008能促進(jìn)野生小鼠脾臟il-1β免疫熒光的增強(qiáng)。

方法：由于在細(xì)胞學(xué)水平lt008能夠激活nlrp3炎癥小體，因此我們進(jìn)一步研究lt008能否在體內(nèi)激活nlrp3炎癥小體。由于前期的病理檢查發(fā)現(xiàn)脾臟有明顯的髓外造血，因此我們進(jìn)一步研究lt008對(duì)脾臟的作用。我們?nèi)∫吧偷腸57bl/6小鼠，尾靜脈分別注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后處死小鼠并解剖取脾臟，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫熒光染色測(cè)定脾臟組織中的il-1β。

結(jié)果：如圖20所示，lt008能顯著增強(qiáng)小鼠脾臟il-1β的免疫熒光的增強(qiáng)。

lt008能夠促進(jìn)輻射后小鼠脾臟il-1β和il-18的蛋白表達(dá)，且該表達(dá)和nlrp3炎癥小體相關(guān)。

方法：用9.0gy60co-γ的輻照劑量作用于野生型小鼠，lt008組（w4組）輻射前連續(xù)三天給予250μg/kg劑量尾靜脈注射，pbs對(duì)照組（w3組）給予10ml/kg的容積靜脈注射pbs。在不同的時(shí)間點(diǎn)脫頸椎處死小鼠后，取脾臟組織，提取蛋白，用western-blot檢測(cè)il-1β和il-18的蛋白表達(dá)。nlrp3-/-組小鼠經(jīng)過(guò)同樣的處理后檢測(cè)。

結(jié)果：如圖21所示，在野生型小鼠中，lt008能增加輻射小鼠脾臟中il-1β和il-18的蛋白表達(dá)，lt008組小鼠在輻射1天和3天后il-1β和il-18分別開(kāi)始升高，3~5天為高峰，7天仍然明顯高于對(duì)照，而在nlrp3-/-小鼠脾臟中il-1β和il-18表達(dá)水平均很低。

以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)lt008在體內(nèi)和體外都能激活nlrp3炎癥小體，并且lt008對(duì)輻射后的細(xì)胞有顯著的保護(hù)作用，該保護(hù)作用有可能和lt008激活nlrp3炎癥小體有關(guān)。

4.1.5進(jìn)一步利用nlrp3炎癥小體（nlrp3、asc、caspase-1）相關(guān)的三種基因敲除小鼠來(lái)驗(yàn)證lt008對(duì)核輻射的保護(hù)作用和nlrp3炎癥小體相關(guān)

方法：具體見(jiàn)實(shí)例1的方法。我們進(jìn)一步選用了nlrp3炎癥小體復(fù)合體中三種成分nlrp3、asc和caspase-1基因敲除的小鼠（nlrp3-/-、asc-/-、caspase-1-/-）研究lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的小鼠骨髓損傷的保護(hù)作用是否通過(guò)炎癥小體。三種基因敲除小鼠均根據(jù)體重隨機(jī)分組，每種基因敲除小鼠分為四組，9.5gy致死劑量下，進(jìn)行小鼠生存率和體重的監(jiān)測(cè)研究，分為9.5gy模型組（組1）和9.5gylt008250μg/kg組（組2）；在9.0gy輻射劑量下，監(jiān)測(cè)小鼠的血象、骨髓涂片和主要臟器的組織病理學(xué)檢查，分別為：9.0gy模型組（組3）、9.0gylt008250μg/kg組（組4）。在輻射前兩天和輻射當(dāng)天，組1和組3小鼠尾靜脈注射給予10ml/kg的pbs，組2和組4給予250μg/kg的lt008。

結(jié)果：生存率測(cè)定：nlrp3-/-、asc-/-、caspase-1-/-三種基因敲除小鼠的生存率研究結(jié)果顯示：lt008對(duì)三種基因敲除小鼠的生存率無(wú)顯著影響，和野生小鼠相比，未見(jiàn)明顯的保護(hù)作用。因此我們可以得到這樣的結(jié)論，lt008對(duì)輻射的保護(hù)作用和nlrp3炎癥小體復(fù)合體相關(guān)（圖22）。

體重結(jié)果顯示：lt008對(duì)三種基因敲除小鼠的體重恢復(fù)和對(duì)照組之間無(wú)顯著性差異（圖23）。

骨髓細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)結(jié)果顯示：

nlrp3-/-小鼠骨髓細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明：輻射后d1，n3組的骨髓損傷程度較n4組輕，d3時(shí)骨髓損傷程度兩組接近，d7開(kāi)始，n4組骨髓損傷開(kāi)始稍有好轉(zhuǎn)，骨髓有核細(xì)胞增生較活躍，但是n3組骨髓有核細(xì)胞增生仍舊低下，直至d14。而直至d21開(kāi)始，存活n4組小鼠的骨髓有核細(xì)胞才顯示出增生活躍。而n3組因動(dòng)物均死亡，未采集到d21天的骨髓，n4組小鼠未采集到d28天骨髓。以上結(jié)果提示，lt008對(duì)輻照所致nlrp3-/-小鼠骨髓損傷具有一定的保護(hù)作用。nlrp3-/-小鼠骨髓切片的病理結(jié)果顯示：在輻射的作用下，n4組和n3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開(kāi)始，骨髓的增生開(kāi)始降低，至d3明顯降低，該情況持續(xù)至d5。在lt008作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開(kāi)始，骨髓增生開(kāi)始恢復(fù)，d14天部分恢復(fù)正常的骨髓相，而至d21，骨髓相已經(jīng)完全恢復(fù)正常。然而n3組小鼠骨髓增生顯著降低一直持續(xù)至d14。由于n3組動(dòng)物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結(jié)果，而n4組則在d21解剖后，動(dòng)物完全死亡，故未曾采集到28天的骨髓結(jié)果。以上結(jié)果顯示，在lt008的作用下，nlrp3-/-小鼠的骨髓造血功能恢復(fù)較n3組有明顯的增強(qiáng)。

asc-/-小鼠骨髓細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明：a4組輻射后當(dāng)天，a3組的骨髓損傷程度較lt008組輕，d5時(shí)骨髓損傷程度兩組接近，d7開(kāi)始，a4組骨髓損傷較對(duì)照組稍有的好轉(zhuǎn)，從d10開(kāi)始，a4組小鼠的骨髓有核細(xì)胞增生活躍，但是a3組骨髓有核細(xì)胞增生仍舊低下持續(xù)至d21，且后期由于a3組動(dòng)物全部死亡，故未能進(jìn)行后續(xù)a3組的骨髓檢查。直至d21開(kāi)始，a4組的骨髓各系的細(xì)胞形態(tài)、比例以及染色呈現(xiàn)基本正常，以上結(jié)果提示，lt008對(duì)輻照所致asc-/-小鼠骨髓損傷具有一定的保護(hù)作用。asc-/-小鼠骨髓切片的病理結(jié)果顯示：在輻射的作用下，a4組和a3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開(kāi)始，骨髓的增生開(kāi)始降低，至d5增生極度降低，該情況持續(xù)至d7。在lt008作用下，asc-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開(kāi)始，骨髓增生降低程度開(kāi)始恢復(fù)，d14部分恢復(fù)正常的骨髓相，而至d21，骨髓增生活躍，至d28天骨髓增生恢復(fù)正常。然而a3組的asc-/-小鼠骨髓增生極度降低一直持續(xù)至d14，至d21增生降低情況略有好轉(zhuǎn)，后續(xù)由于a3組的小鼠全部死亡，未有d28的骨髓結(jié)果。以上結(jié)果顯示，在lt008的作用下，a4組小鼠的骨髓造血功能恢復(fù)較a3組有明顯的增強(qiáng)。

caspase-1-/-小鼠骨髓細(xì)胞學(xué)動(dòng)態(tài)檢測(cè)結(jié)果表明：c4組輻射后當(dāng)天與c3組的骨髓損傷程度相似，直至d10天，c4組和c3組小鼠的骨髓細(xì)胞增生都仍舊欠活躍，至d14，c4組小鼠的骨髓有核細(xì)胞增生開(kāi)始活躍，直至d28才完全恢復(fù)正常。但是c3組由于動(dòng)物全部死亡，從d14起故未能進(jìn)行后續(xù)對(duì)照組的骨髓檢查。以上結(jié)果提示，lt008對(duì)輻照所致caspase-1-/-小鼠骨髓損傷具有較明顯的保護(hù)作用。

caspaase-1-/-小鼠骨髓切片的病理結(jié)果顯示：在輻射的作用下，c4組和c3組小鼠的骨髓切片顯示從d1開(kāi)始，骨髓的增生開(kāi)始降低，至d5極度降低，該情況持續(xù)至d5。在lt008作用下，caspaase-1-/-小鼠的骨髓切片顯示在d7開(kāi)始，骨髓增生降低程度開(kāi)始恢復(fù)，d10天開(kāi)始骨髓增生活躍，d14天1/3骨髓腔開(kāi)始出現(xiàn)增生的造血細(xì)胞，d21開(kāi)始恢復(fù)正常的骨髓相，而至d28天，骨髓相已經(jīng)完全恢復(fù)正常。然而c3組的caspaase-1-/-小鼠骨髓增生極度降低一直持續(xù)至d14。由于c3組動(dòng)物在d14后全部死亡，故未采集到d21的骨髓結(jié)果。以上結(jié)果顯示，在lt008的作用下，c4小鼠的骨髓造血功能恢復(fù)較c3組有明顯的增強(qiáng)。對(duì)于d10兩只瀕死動(dòng)物的骨髓切片結(jié)果顯示骨髓增生極度降低，特別是c3組的動(dòng)物骨髓顯示出明顯的出血征象，因此我們可以推測(cè)動(dòng)物的死亡和骨髓的損傷密切相關(guān)。

以上三種基因敲除小鼠的骨髓結(jié)果顯示：lt008對(duì)輻射后的基因敲除小鼠的骨髓恢復(fù)有一定的促進(jìn)作用，但是從小鼠骨髓相的恢復(fù)時(shí)間看，基本在輻射后d14天左右才開(kāi)始有恢復(fù)的趨勢(shì)，低于野生型lt008組的輻射后d7天骨髓細(xì)胞學(xué)檢查就顯示出增生活躍。因此，nlrp3、asc、caspase-1炎癥小體相關(guān)因子被敲除以后，骨髓恢復(fù)的時(shí)間延遲。

4.1.6lt008能在體內(nèi)能同時(shí)激活nf-κb和nlrp3炎癥小體

前期研究表明ltα與tnfr1和tnfr2結(jié)合后能誘導(dǎo)正常細(xì)胞線粒體產(chǎn)生錳超氧化物歧化酶對(duì)抗放化療引起的氧化應(yīng)激，保護(hù)骨髓細(xì)胞免受放化療的損傷，同時(shí)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性。ltα對(duì)腫瘤細(xì)胞和骨髓來(lái)源細(xì)胞的不同反應(yīng)是由于上皮來(lái)源腫瘤和骨髓來(lái)源細(xì)胞中nf-κb表達(dá)水平的差異。ltα激活tnfr1信號(hào)后又可通過(guò)進(jìn)一步激活nf-κb分子而起到抗凋亡的作用，從而增強(qiáng)了骨髓來(lái)源細(xì)胞對(duì)抗化療藥物毒性的能力。

方法：我們?nèi)∫吧偷腸57bl/6小鼠，尾靜脈分別注射lt008（25μg/ml，10ml/kg）和等量pbs，三天后處死小鼠并解剖取胸骨，經(jīng)固定、脫水、石蠟包埋、切片后進(jìn)行免疫熒光染色nf-κb的p52亞基（紅色）和nlrp3（綠色）。

結(jié)果：nf-κb的p52亞基，未激活時(shí)在細(xì)胞漿表達(dá)，激活后轉(zhuǎn)位入核，結(jié)果如圖24所示。對(duì)照組nf-κb（p52）紅色熒光主要表達(dá)在胞漿，lt008處理組可見(jiàn)紅色熒光轉(zhuǎn)位入核，表明lt008在小鼠體內(nèi)激活了nf-κb。同時(shí)與對(duì)照相比，lt008處理組的nlrp3炎癥小體的表達(dá)明顯增高（綠色熒光增強(qiáng)）。

3.1.7lt008在核輻射小鼠脾臟中通過(guò)上調(diào)bcl-xl抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血小板的生成，從而促進(jìn)機(jī)體對(duì)輻射導(dǎo)致的損傷的恢復(fù)

bcl-xl是bcl-2凋亡相關(guān)蛋白家族中的一種抗凋亡蛋白，多項(xiàng)研究表明，bcl-xl在血小板的生成和破壞中都發(fā)揮作用，bcl-xl在巨核細(xì)胞的分化、成熟及血小板產(chǎn)生過(guò)程都發(fā)揮作用。bcl-xl可能在造血干細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過(guò)程中，尤其在維持未成熟巨核細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中具有重要作用；而在達(dá)到成熟的巨核細(xì)胞中表達(dá)明顯降低，則可能與巨核細(xì)胞成熟后發(fā)生特殊的凋亡以至血小板形成有關(guān)，我們進(jìn)一步觀察了核輻射和/或lt008處理后野生型小鼠和nlrp3-/-小鼠脾臟中bcl-xl的表達(dá)。

方法：研究方法見(jiàn)效果實(shí)例1里的研究方法，在不同的時(shí)間點(diǎn)取小鼠的脾臟進(jìn)行western-blot進(jìn)行檢測(cè)。

研究結(jié)果：lt008能在第七天開(kāi)始明顯增加核輻射小鼠脾臟中bcl-xl的表達(dá)，維持至18天，在nlrp3-/-小鼠中bcl-xl的表達(dá)也有升高，但是沒(méi)有野生型小鼠明顯，該結(jié)果也和血象監(jiān)測(cè)中的血小板監(jiān)測(cè)結(jié)果一致（見(jiàn)圖25）。

5結(jié)論

從實(shí)施例1～4的試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)：（1）lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的小鼠損傷有保護(hù)作用：lt008能使小鼠的生存率顯著增加；能夠促進(jìn)血象的回升；促進(jìn)骨髓造血功能的恢復(fù)；增加脾臟的髓外造血；

（2）lt008能保護(hù)核輻射導(dǎo)致的thp-1細(xì)胞的損傷：lt008能減少核輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞焦亡；減少核輻射導(dǎo)致的ros的產(chǎn)生；逆轉(zhuǎn)核輻射導(dǎo)致的細(xì)胞周期的阻滯，促進(jìn)細(xì)胞增殖；

（3）lt008在thp-1細(xì)胞和小鼠體內(nèi)均能激活nlrp3炎癥小體，lt008在小鼠骨髓還能促進(jìn)p52核轉(zhuǎn)位，激活nf-κb；

（4）lt008對(duì)三種基因的敲除小鼠（nlrp3-/-、asc-/-和caspase-1-/-）核輻射后導(dǎo)致的損傷保護(hù)作用下降,表明lt008對(duì)核輻射導(dǎo)致的小鼠損傷的保護(hù)作用與nlrp3炎癥小體有關(guān)；

（5）lt008能在小鼠脾臟中促進(jìn)凋亡抑制因子bcl-xl的表達(dá)，該作用可能與血小板的再生，進(jìn)而機(jī)體重新啟動(dòng)免疫有關(guān)；

因此，lt008在防治核輻射性疾病，特別是輻射所致的急性、慢性組織損傷甚至嚴(yán)重的器官功能障礙疾病方面具有良好的效果，可制備成應(yīng)用于此方面的新藥。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出：對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

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