本發(fā)明涉及一種具有很好的抗酶解穩(wěn)定性的含D型非天然抗菌肽類似物，本發(fā)明同時還涉及該含D型非天然抗菌肽類似物的和成功及其在制備抗菌藥物的應(yīng)用，屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

近年來，濫用抗生素產(chǎn)生的耐藥性問題日益嚴重，對人類疾病造成了巨大的威脅。尋找新的可替代抗生素的新藥迫在眉睫?？咕模ˋntimicrobial peptides），是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類具有抗菌活性的小分子多肽，來源廣泛，其分子量小，大約在 3~6 kD 之間，有耐熱、 耐酸性強，水溶性好，快速的殺菌能力等特點（Hancock REW， Scott MG. Proc Natl AcadSci USA，2000，97（16）：8856~ 8861）?？咕牡目咕鷻C制不同于普通抗生素，抗菌機制一般包括①快速破壞菌膜，使菌體內(nèi)容物泄露，細菌死亡②抗菌肽與細菌細胞內(nèi)容物（如DNA或RNA）作用，干擾細菌細胞正常的合成和代謝，導(dǎo)致菌體死亡（劉立偉，鄧磊. 抗菌肽作用機制研究進展[J].河北化工，2012,35（7）：13-15）。所以，抗菌肽不易誘導(dǎo)耐藥性的產(chǎn)生，使其成為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱門研究內(nèi)容。

但是天然抗菌肽也存在一些弊端，比如：酶解穩(wěn)定性差，生物利用度低；選擇性不強，對哺乳動物細胞會產(chǎn)生破壞作用等，都會限制天然抗菌肽的進一步發(fā)展。因此，對天然抗菌肽進行改造成為研究的熱點，其中非天然的D型氨基酸的引入常被作為一種常用的手段，優(yōu)化抗菌肽，以提高耐受酶降解的能力（Di Grazia A， Cappiello F， Cohen H.et.al.D-Amino acids incorporation in the frog skin-derived peptide esculentin-1a(1-21)NH2 is beneficial for its multiple functions[J].Amino Acids，2015，47(12)：2505-19.）。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物；

本發(fā)明的另一目的是提供上述含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物的合成方法；

本發(fā)明的還有一個目的，就是提供上述含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物在制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

一、含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物的設(shè)計

本發(fā)明含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物，是在抗菌肽Anoplin的親水面、疏水面分別引入D型非天然氨基酸，對天然抗菌肽Anoplin進行修飾而得。

在抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型氨基酸為D型Leu，引入位點分別為9和10位，命名為Anoplin-D9,10；其結(jié)構(gòu)式為： GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型氨基酸為D型Leu，引入位點分別為9，10和3位，命名為Anoplin-D9,10,3；其結(jié)構(gòu)式為：GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的親水面引入的D型氨基酸為D型Lys，引入位點分別為4和7位，命名為Anoplin-D4,7；其結(jié)構(gòu)式為： GLLKRIKTLL-NH2。

在抗菌肽Anoplin的親水面引入的D型氨基酸為D型Arg和D型Lys，引入位點分別為5和7位，命名為Anoplin-D5,7；其結(jié)構(gòu)式為：GLLKRIKTLL-NH2 。

二、含D型非天然氨基酸的抗菌肽類似物的合成

以Rink-MBHA Resin 為起始原料, 采用Fmoc固相合成方法，按照設(shè)計的替換位點在天然抗菌肽Anoplin的相應(yīng)位置引入非天然D型氨基酸，然后按序列延長肽鏈即得。

在天然抗菌肽Anoplin的親水面引入的D型非天然型氨基酸為D型Arg或/和D型Lys：在天然抗菌肽Anoplin的疏水面引入的D型非天然氨基酸 為D型Leu。

三、含D型氨基酸抗菌肽類似物的體外抑菌實驗

1. 對標準菌株的抑菌實驗

采用常見的二倍稀釋法測定藥物的最小抑菌濃度，即MIC值。結(jié)果重復(fù)三次以上的、平行實驗。結(jié)果見表1:

2. 酶解穩(wěn)定性試驗

具體方法： 將胰蛋白酶或糜蛋白酶配成一系列濃度 2000，200，20，2， 0.2， 0.02μg/ml。將抗菌肽Anoplin; Anoplin-D9,10；Anoplin-D9,10,3；Anoplin-D4,7; Anoplin-D5,7 用PBS配成相應(yīng)濃度，將母液與不同濃度的胰酶孵育（1:4, v/v），不含胰酶的PBS做對照，孵育物37℃孵育6小時，隨后，取出60℃烘箱滅活10min， 后用MH肉湯稀釋到2×MIC，加入96孔板中，每孔100μl，設(shè)定3個復(fù)孔，然后加菌，每孔加菌100μl, 37℃孵育過夜，隨后酶標儀測定OD600nm， 根據(jù)給藥組的OD值比陰性組的OD值作為細菌存活率。

圖1為耐受胰酶6小時穩(wěn)定性試驗結(jié)果?？梢钥闯?，Anoplin-D5,7和Anoplin-D4,7 耐受胰酶降解的能力顯著提高，跟母肽Anoplin相比，耐受胰酶分別提高10⁴和10⁵倍。

圖2 為耐受糜蛋白酶6小時穩(wěn)定性試驗結(jié)果?？梢钥闯?，四條D型類似物耐受糜蛋白酶的能力較母肽Anoplin顯著提高，Anoplin-D5,7和Anoplin-D4,7 耐受糜蛋白酶降解的能力提高100倍，Anoplin-D9,10和Anoplin-D9,10,3 耐受糜蛋白酶降解的能力提高10倍。

3. RP-HPLC降解率曲線

抗菌肽Anoplin，與其D型類似物D-4,7; D-5,7 與200 μg/ml的胰酶37攝氏度孵育，在不同時間段，吸取孵育液，進行RP-HPLC分析，繪制降解率-時間曲線（圖3）?？梢钥闯觯鸽腁noplin在120min時間內(nèi)就被完全快速100%降解，而類似物D-5,7和D-4,7 降解率顯著降低，在共孵育24小時（1440min），降解率僅為20%左右。

抗菌肽Anoplin，與其D型類似物D-4,7; D-5,7 與20μg/ml的糜蛋白酶37攝氏度孵育，在不同時間段，吸取孵育液，進行RP-HPLC分析，繪制降解率-時間曲線（圖4）。可以看出，母肽Anoplin在300min時間內(nèi)就被完全快速100%降解，而類似物D-5,7和D-4,7 降解率顯著降低，在共孵育24小時（1440min），降解率僅為20%和15%左右。

抗菌肽Anoplin，與其D型類似物D-9,10; D-9,10,3與2μg/ml的糜蛋白酶37攝氏度孵育，在不同時間段，吸取孵育液，進行RP-HPLC分析，繪制降解率-時間曲線（圖5）?？梢钥闯觯谙嗤瑫r間間隔，母肽Anoplin的降解率均高于類似物D-9，10和D-9,10,3。

4. 抑制生物膜形成試驗

孵育方法：將標準銅綠假單孢菌分別用胰蛋白胨大豆肉湯含0.5%葡萄糖（TSBG）培養(yǎng)到中間對數(shù)期，最終用TSBG稀釋到5×105 CFU/ml. 將其加到96孔板中，每孔20 μl, 然后將抗菌肽按二倍稀釋的方法，使其濃度分別是2×MIC，1×MIC, 0.5×MIC, 0.25×MIC, 0.125×MIC, 0.0625×MIC. 然后將藥物分別加到孔中，每個濃度6個平行，將共孵育物37℃孵育24小時。

處理方法：到時間后將平板取出，吸去上清液，加入PBS洗，每孔洗2遍，然后加無水甲醇固定生物膜，固定15min，然后吸去，空氣中晾干，然后每孔加入200μl ,0.1% 結(jié)晶紫染色15min, 染色后，將其吸去，用去離子水洗，每孔洗2遍，最后加入95%無水乙醇，釋放染料15min, 快速測定595nm處的吸光值。

生物膜形成率=（OD給藥組-OD陰性組）/OD陰性組

抑制生物膜形成率%= 1-生物膜的形成率

試驗結(jié)果見圖6。橫坐標是藥物濃度，縱坐標是抑制銅綠假單胞菌生物膜形成率，發(fā)現(xiàn)生物膜抑制率呈現(xiàn)出劑量依賴性，母肽Anoplin和類似物D-9,10; D-9,10,3; D-4,7; D-5,7在高濃度2×MIC時，呈現(xiàn)出98%以上的抑膜形成率。在低濃度1×MIC時，母肽Anoplin 和類似物D-9,10; D-5,7抑膜形成率有所降低，但D-9,10,3仍然保留了很強的抑制率。在0.5×MIC時， 母肽Anoplin，D-4,7, D-5,7幾乎喪失了抑膜能力，抑制膜形成率低于10%。只有類似物D-9,10和D-9,10,3仍然可以抑制生物膜的形成，抑制率40%。在濃度低于0.5×MIC時，所有肽都不能表現(xiàn)出抑制生物膜形成的能力。

附圖說明

圖1為本發(fā)明含D型氨基酸抗菌肽類似物耐受胰酶6小時穩(wěn)定性試驗。

圖2為本發(fā)明含D型氨基酸抗菌肽類似物耐受糜蛋白酶6小時穩(wěn)定性。

圖3為Anoplin、D型類似物D-4,7、D-5,7 與200 μg/ml的胰酶37攝氏度孵育不同時間的RP-HPLC降解率曲線。

圖4為Anoplin、D型類似物D-4,7、D-5,7 與20 μg/ml的胰酶37攝氏度孵育不同時間的RP-HPLC分析。

圖5為Anoplin、D型類似物D-9,10、D-9,10,3與2μg/ml的糜蛋白酶37攝氏度孵育不同時間的RP-HPLC分析。

圖6為本發(fā)明含D型氨基酸抗菌肽類似物抑制生物膜形成試驗。

圖7為純肽Anoplin-D9,10的RP-HPLC分析譜圖。

圖8為純肽Anoplin-D9,10,3的RP-HPLC分析譜圖。

圖9為純肽Anoplin-D4,7的RP-HPLC分析譜圖。

圖10為純肽Anoplin-D5,7的RP-HPLC分析譜圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明D型氨基酸抗菌肽類似物的結(jié)構(gòu)、合成作進一步說明。

實施例1、類似物Anoplin-D9,10的合成

稱取Rink-MBHA 樹脂，取代值為0.43mmol/g, 合肽量為0.15mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分攪拌溶脹樹脂，時間為30min, 然后加入10%的六氫吡啶脫樹脂F(xiàn)moc保護，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗樹脂，同樣每次2min, 共洗4遍，最后使用茚檢指示劑（苯酚：氰化鉀吡啶：茚三酮=1:2:1）檢驗樹脂是否脫去Fmoc保護基團，沸水煮樹脂1min，立即觀察，樹脂顯藍色，則證明Fmoc基團已脫出，按合肽的序列，從C末端開始，稱取第一個氨基酸為d-Leu，1.5倍過量，加入HOBT (1倍過量)，HBTU(1倍過量)，待氨基酸溶解后，加入啟動劑DIEA (4倍過量)。上述氨基酸與樹脂共同攪拌反應(yīng)，時間1h，反應(yīng)結(jié)束后，茚檢試劑檢驗，沸水煮樹脂1min, 樹脂變?yōu)闊o色，說明D型Leu氨基酸成功接上，如此重復(fù)操作，直至后續(xù)接完d-leu-Thr-Lys-Ile-Arg-Lys-Leu-Leu-Gly氨基酸序列。經(jīng)RP-HPLC制備純化，使用C18柱純化，洗脫條件為20%-60%乙腈，8ml/min。純肽Anoplin-D9,10的RP-HPLC分析譜圖見附圖說明7。

實施例2 類似物Anoplin-D9,10,3的合成

稱取Rink-MBHA 樹脂，取代值為0.43mmol/g, 合肽量為0.25mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分攪拌溶脹樹脂，時間為30min, 然后加入15%的六氫吡啶脫樹脂F(xiàn)moc保護，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗樹脂，同樣每次2min, 共洗4遍，然后茚檢指示劑（苯酚：氰化鉀吡啶：茚三酮=1:2:1）檢驗，樹脂顯藍色，證明樹脂上的Fmoc基團已脫出，按合肽的序列，從C末端開始，稱取第一個氨基酸d-Leu氨基酸，2倍過量，加入HOBT (3倍過量)，HBTU(3倍過量)，待氨基酸溶解后，加入啟動劑DIEA (6倍過量)。上述氨基酸與樹脂共同攪拌反應(yīng)，時間1.5h，反應(yīng)結(jié)束后，茚檢試劑檢驗，樹脂變?yōu)闊o色，說明第一個氨基酸成功接上，如此重復(fù)操作，后續(xù)接完d-leu-Thr-Lys-Ile-Arg-Lys-d-Leu-Leu-Gly氨基酸序列。經(jīng)RP-HPLC制備純化，使用C18柱純化，洗脫條件為20%-60%乙腈，8ml/min。純肽Anoplin-D9,10,3的RP-HPLC分析譜圖見附圖說明8。

實施例3、類似物Anoplin-D4,7的合成

稱取Rink-MBHA 樹脂，取代值為0.43mmol/g, 合肽量為0.2mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分攪拌溶脹樹脂，時間為30min, 然后加入15%的六氫吡啶脫樹脂F(xiàn)moc保護，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗樹脂，同樣每次2min, 共洗4遍，然后茚檢指示劑（苯酚：氰化鉀吡啶：茚三酮=1:2:1）檢驗，樹脂顯藍色，證明Fmoc基團已脫出，按合肽的序列，從C末端開始，稱取第一個氨基酸Leu，3倍過量，加入HOBT (5倍過量)，HBTU(5倍過量)，待氨基酸溶解后，加入啟動劑DIEA (6倍過量)。上述氨基酸與樹脂共同攪拌反應(yīng)，時間1h，反應(yīng)結(jié)束后，茚三酮檢驗，若樹脂變?yōu)闊o色，說明氨基酸成功接上，如此重復(fù)操作，直至接完后面的序列l(wèi)eu-Thr-d-Lys-Ile-Arg-d-Lys-Leu-Leu-Gly。經(jīng)RP-HPLC制備純化，使用C18柱純化，洗脫條件為20%-60%乙腈，8ml/min。純肽Anoplin-D4,7的RP-HPLC分析譜圖見附圖說明9.

實施例4、類似物Anoplin-D5,7的合成

稱取Rink-MBHA 樹脂，取代值為0.43mmol/g, 合肽量為0.2mmol，加入重蒸的二氯甲烷溶液，充分攪拌溶脹樹脂，時間為30min, 然后加入15%的六氫吡啶脫樹脂F(xiàn)moc保護，每次洗2min, 共洗4遍，然后用重蒸DMF溶液洗樹脂，同樣每次2min, 共洗4遍，然后然后茚檢指示劑（苯酚：氰化鉀吡啶：茚三酮=1:2:1）檢驗，樹脂顯藍色，顯藍色，證明Fmoc基團已脫出，按合肽的序列，從C末端開始，稱取第一個氨基酸Leu，3.4倍過量，加入HOBT (6倍過量)，HBTU(6倍過量)，待氨基酸溶解后，加入啟動劑DIEA (8倍過量)。上述氨基酸與樹脂共同攪拌反應(yīng)，時間2h，反應(yīng)結(jié)束后，茚檢指示劑檢驗，若樹脂變?yōu)闊o色，說明氨基酸成功接上，如此重復(fù)操作，直至按序列接完剩下的氨基酸leu-Thr-d-Lys-Ile-d-Arg- Lys-Leu-Leu-Gly。經(jīng)RP-HPLC制備純化，純肽Anoplin-D5,7的RP-HPLC分析譜圖見附圖說明10。