專利名稱：聚乙二醇化重組人DesB30胰島素及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及去B^重組人胰島素(重組人DesB30胰島素)制備方法及 采用化學(xué)修飾的方法使該胰島素的合適部位結(jié)合聚乙二醇。具體涉及DesB30人胰島素的 P. Pastoris表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、發(fā)酵、純化、酶切以及聚乙二醇化人DesB30 胰島素的制備方法。
技術(shù)背景胰島素是胰島13細(xì)胞所分泌的一種激素，胰島素通過與體內(nèi)細(xì)胞膜 上受體的相互作用，調(diào)節(jié)血糖維持在正常水平。Kjeldsen(A卯l Microbiol Biotechnol， 2000,54(3) :277 286)在S. cerevisiae中表達(dá)人胰島素原時，最終不能有效地分泌 胰島素原或胰島素，但若在在編碼胰島素原cDNA的分子中去除B3°蘇氨酸(T)，并使之與 S. cerevisiae的前導(dǎo)肽a因子相連，然后將人胰島素原的C肽用短C肽代替或直接將 B29賴氨酸(K)與A 1甘氨酸(G)相連，能有效提高單鏈胰島素原類似物的分泌表達(dá)水平。 Annibali(US Patent, 7091032. 2006-08-15)用巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)分泌表達(dá)出 短C肽人胰島素原B(l-30)-Yl-Y2-A(l-21)，其中Yl、 Y2可以是賴氨酸(K)或精氨酸(R)。 本發(fā)明選用P. pastoris作為基因表達(dá)系統(tǒng)，是因為與以往的基因表達(dá)系統(tǒng)相比，它具有高 表達(dá)特性，被認(rèn)為是最具有發(fā)展前景的生產(chǎn)蛋白質(zhì)的工具之一。在P.pasoris中表達(dá)的蛋 白既可存在于胞內(nèi)，又可分泌至胞外。P. pasoris自身分泌的蛋白非常少，十分有利于純化。 分泌表達(dá)的短C肽人胰島素原類似物的純化和酶切的工藝相對簡單，具有實際價值，本發(fā) 明建立了僅用胰蛋白酶單一酶切除去短C肽AEDAK的方法和條件，建立的純化工藝回收率 高，為工業(yè)化制備和研究重組胰島素具有重要意義 長效胰島素的理想效果是通過盡可能少的胰島素注射次數(shù)，在糖尿病患者體內(nèi) 重建胰島素基礎(chǔ)分泌。頻繁地注射胰島素，給糖尿病患者帶來諸多的不便和痛苦，臨床上 需要注射間隔時間更長的超長效胰島素?；瘜W(xué)修飾是獲得長效胰島素的途徑之一，經(jīng)過化 學(xué)修飾，可使胰島素在保持生物活性的同時，半衰期延長，抗原性降低。化學(xué)修飾劑的結(jié) 構(gòu)必須穩(wěn)定、無毒性、無抗原性并具有合適大小的分子量。諾沃挪第克公司(中國專利， 200480021733. 8，
公開日2006年9月6日)發(fā)明了一種新型胰島素衍生物，該胰島素衍生 物是在母體胰島素B鏈N-末端氨基酸殘基的a -氨基處或者在母體胰島素B鏈上存在的 Lys殘基的e -氨基處連接了側(cè)鏈的天然存在的胰島素或其類似物，該胰島素衍生物在生 理pH值下可溶。聚乙二醇(PEG)是一種具有較好生物相容性的高分子化合物，對人體無毒 性。用PEG活性酯修飾蛋白質(zhì)或多肽藥物，可在蛋白質(zhì)或多肽分子上形成保護(hù)層，增大相對 分子質(zhì)量并增加藥物的水溶性。相對分子質(zhì)量的增大會降低腎小球的清除速率，增加藥物 在體內(nèi)循環(huán)的半衰期，從而獲得長效。耐科塔醫(yī)藥公司(中國專利，200710085552. 7，公開 日2007年10月3日)發(fā)明了具有活性的親水聚合物修飾的胰島素衍生物。郁正艷等(中 國專利，200410089050. 8，
公開日2005年8月10日)發(fā)明了一種單甲氧基聚乙二醇-胰島 素復(fù)合物，胰島素和單甲氧基聚乙二醇通過前者的游離氨基和后者的具有活性的丙醛基團(tuán) 連接在一起，分子量介于10. 8 25. 8KD。印春華等(中國專利，200610118923. 2，
公開日: 2007年5月30日)發(fā)明了一種單修飾的聚乙二醇化胰島素(PheBl-PEG-胰島素)，聚乙二 醇與胰島素以碳氮鍵相連，分子量范圍6. 55 10. 8KD。本發(fā)明選用單甲氧基聚乙二醇通過琥珀酰亞胺基活性基團(tuán)與重組人DesB30胰島素的LysB29或LysB29和GlyA1的游離氨基形成 酰氨鍵，制備而成的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素性質(zhì)穩(wěn)定，保留了胰島素降血糖生物 活性。經(jīng)糖尿病動物模型證明本發(fā)明的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素可維持48-72小 時的降血糖作用，可作為一種治療I型和II型糖尿病的長效胰島素藥物。

發(fā)明內(nèi)容
1、目的基因獲得 選擇DesB30人胰島素(HIDesB30)的氨基酸序列，在A鏈與B鏈間加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰島素原(HMPIDesB30)的氨基酸序列。根據(jù)酵母偏愛密碼子，在 5'端引入畢赤酵母表達(dá)載體的分泌信號肽a因子的Stel3識別位點和XhoI位點，3'端引 入Notl位點和終止子，合成全基因。
2、畢赤酵母表達(dá)載體構(gòu)建 上述基因合成后，用Xhol， Notl雙酶切后，與Xhol， Notl雙酶切后的pPIC9用T4 連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5 a菌，涂布LB-Ampicillin平板，培養(yǎng)LB-Ampicillin平板上長 出的菌落，提質(zhì)粒，用XhoI，NotI雙酶切鑒定。再用Sail和Sacl雙酶切pPIC9重組質(zhì)粒獲 得小片段，與Sail和Sacl雙酶切后的pPIC9K大片段用T4連接酶進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化DH5 a菌， 涂布LB-Ampicillin平板，培養(yǎng)LB-Ampicillin平板上長出的菌落，提質(zhì)粒，用Xhol， Notl 雙酶切鑒定。 3 、酵母表達(dá)工程菌的獲得 用Sail單酶切線性化質(zhì)粒pPIC9K-HMPIDesB30，回收，電轉(zhuǎn)酵母GS115，將電轉(zhuǎn)后 的GS115涂MD平板，各菌落進(jìn)行培養(yǎng)和表達(dá)，經(jīng)電泳檢測和G418高拷貝篩選，獲得高效表 達(dá)工程菌。 4、重組酵母工程菌發(fā)酵和純化 畢赤酵母工程菌經(jīng)發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)72h后菌液0D6。。達(dá)到300以上后，培養(yǎng)液過濾， 上樣大孔吸附樹脂，再用陽離子交換層析獲得純度大于95X的重組人DesB30胰島素原。
5、酶切獲得重組人DesB30胰島素 胰蛋白酶單酶切重組人DesB30胰島素原，酶切效率大于90%。
6、重組人DesB30胰島素聚乙二醇修飾 胰島素分子中有三個裸露的氨基，即GlyA、pKa " 8. 0) 、 PheB1 (pKa < 7. 0 =的 a-氨基和Lys^(pKa"9.5)的e_氨基，都可作為胰島素的化學(xué)修飾位點。由于人胰島素 的B29位不直接參與與受體結(jié)合，mPEG與人胰島素LysB29共價結(jié)合不會影響蛋白的生物活 性[Murray-Rust Jet al BioEssays， 1992， 14 (5) :325-331.]。在pH值> 9. 5時LysB29上 e-氨基的單修飾占主要[Hinds K et al Bioconjug Chem. 2000， 11 (2) : 195-201.]。通過 控制反應(yīng)緩沖的pH值通過調(diào)節(jié)胰島素與修飾劑的摩爾比及修飾后的純化得到比較均一的 LysB29單修飾產(chǎn)物以及GlyA1和LysB29雙修飾產(chǎn)物。本發(fā)明的單分子聚乙二醇化及兩分子聚 乙二醇化重組人DesB30胰島素的制備方法如下 (1)將1份DesB30人胰島素溶于Na2PH04溶液(pH值為10. 0)(份數(shù)以摩爾計)；
(2)將3. 0份mPEG-SPA (5k)溶于Na2PH04溶液(pH值為10. 0)(份數(shù)以摩爾計)；
(3)胰島素溶液與mPEG-SPA(5k)溶液混合，室溫攪拌20 30min，稀釋后調(diào)pH值至3終止反應(yīng)； (4)反相HPLC回收修飾產(chǎn)物。 所說的磷酸鹽緩沖液的pH值為8. 5 11. O，優(yōu)選的pH值為10. 0。所說的mPEG-SPA和胰島素的用量摩爾比為2. 0 5. O，mPEG-SPA和胰島素的用量
摩爾比過低，胰島素不能充分被修飾，過高，則其他位點被更多修飾。 所說反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)溫度過低會使反應(yīng)速度慢，但過高則會使蛋白質(zhì)變性。
所說的反應(yīng)時間為20 30min，低于20min，大量胰島素不能被修飾，超過 30minmPEG-SPA水解，修飾不能繼續(xù)進(jìn)行。
本發(fā)明具有以下的創(chuàng)新和實用性。 (1)采用P. Pastoris分泌表達(dá)短C肽AEDAK的人胰島素原類似物HMPIDesB3°。表 達(dá)產(chǎn)物未產(chǎn)生糖基化，未出現(xiàn)二聚體和多聚體。這種分泌表達(dá)的短C肽DesB30人胰島素原 的純化和酶切的工藝相對簡單。 (2)本發(fā)明克服傳統(tǒng)的酵母分泌表達(dá)產(chǎn)物超濾濃縮工藝無法除去大量色素的缺 點，選用大孔吸附樹脂代替超濾建立了 P. Pasotoris酵母分泌表達(dá)純化工藝。建立的純化 工藝回收率高。 (3)建立了僅用胰蛋白酶單一酶切除去短C肽的方法和條件，為工業(yè)化制備和研 究重組人DesB30胰島素具有實用價值。 (4)單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素保持了胰島素 原有的生物活性，延長了降血糖作用時間，代謝平穩(wěn)，使胰島素的生物利用度提高；
(5)mPEG與胰島素連接的酰氨鍵比較穩(wěn)定，單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇 化重組人DesB30胰島保留了重組胰島素的降血糖生物活性。 (6)單分子聚乙二醇化及雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，通過控制pH、 反應(yīng)時間及修飾劑比例可實現(xiàn)胰島素的定位修飾。 (7)聚乙二醇化重組人DesB30胰島素可作為一種治療糖尿病的長效胰島素制劑。


圖1為實施例2-3中畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30
構(gòu)建示意圖。 圖2為實施例5中重組人DesB30胰島素原蛋白的純化過程高效液相色譜圖，檢測 波長214nm，目的蛋白吸收峰保時間在14min左右。(a)發(fā)酵液上清；(b)60X (v/v)乙醇大 孔吸附樹脂洗脫液；(c) 25mMol/LTris-HCl pH 9SP柱洗脫液；(d) ZnCl2沉淀目的蛋白溶解 于含5mMol/L EDTA的25mMol/L Tris-HCl。 圖3為實施例5中胰蛋白酶酶切獲得重組人DesB30胰島素的高效液相色譜圖，檢 測波長214nm。 (a)酶切前HMPIDesB30 ; (b)HMPIDesB30與胰蛋白酶按質(zhì)量比5000 : 1，4°C 酶切過夜，酶切后吸收峰后移，酶切效率大于90%。 圖4為酶切后回收產(chǎn)物重組人DesB30胰島素分子量質(zhì)譜結(jié)果酶切產(chǎn)物的理論分 子量為5694. 5，質(zhì)譜測定分子量為5705. 43，測定值在誤差允許的范圍內(nèi)與理論值一致。
圖5為實施例9中重組人DesB30胰島素單分子聚乙二醇修飾后的高效液相色譜 圖，檢測波長214nm，峰1為單分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。
7
圖6為實施例8中重組人DesB30胰島素雙分子聚乙二醇修飾后的高效液相色譜 圖，檢測波長214nm，峰2為雙分子聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。 圖7為實施例7中重組人DesB30胰島素LysB29單分子聚乙二醇修飾并純化后，質(zhì) 譜測定結(jié)果與DesB30-PEGl分子量一致。 圖8為實施例8中重組人DesB30胰島素LysB29和GlyA1雙分子聚乙二醇修飾并純 化后，質(zhì)譜測定結(jié)果與DesB30-PEG2分子量一致。 圖9為實施例9中二種PEG修飾DesB30胰島素降血糖持續(xù)時間的比較。
圖10為實施例10中DesB30-PEG2的代謝特征。
具體實施例方式
通過下面的具體實施例可進(jìn)一步了解本發(fā)明。但它們不是對本發(fā)明的限定。
實施例l:目的基因的獲得 選擇DesB30人胰島素(HIDesB30)的氨基酸序列，在A鏈與B鏈間加入短C肽 (AEDAK)，形成DesB30人胰島素原(HMPIDesB30)的氨基酸序列。根據(jù)酵母偏愛密碼子，在 5'端引入畢赤酵母表達(dá)載體的分泌信號肽a因子的Stel3識別位點和XhoI位點，3'端引 入Notl位點和終止子，合成全基因。單鏈核苷酸序列如下 5' CTC GAG AAA AGA GAG GCT GAA GCT TTC GTT AAC CAA CAC TTG TGT GGT TCCCAC TTG GTT GM GCT TTG TAC TTG GTT TGT GGT GAA AGA GGT TTC TTC TAC ACTCCA MG GCT GAG GAT GCT MG GGT ATC GTT GM CAA TGT TGT ACT TCC ATC TGTTCC TTG TAC CAATTG GAAAAC TAC TGTAAC TGATAA GCGG CCGC 3' 畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-HMPIDesB30及pPIC9K-HMPIDesB30構(gòu)建(重組質(zhì)粒的
設(shè)計和構(gòu)建見示意圖1) 實施例2 :pPIC9-HMPIDesB30構(gòu)建 上述基因合成后，用XhoI，NotI雙酶切后，與XhoI，NotI雙酶切后的pPIC9在16°C 下用T4連接酶反應(yīng)過夜。用CaCl2法轉(zhuǎn)到DH5 a中，并均勻涂布LB-Ampicillin平板，37°C ， 20h，挑取長出的菌落，經(jīng)培養(yǎng)后提質(zhì)粒，用Xhol， Notl雙酶切鑒定，選出嵌合上HMPIDesB30 片段的菌(命名為pPIC9-HMPIDesB30)，培養(yǎng)并提取質(zhì)粒。 實施例3 :pPIC9K-HMPIDesB30構(gòu)建用Sail和Sacl雙酶切pPIC9-HMPIDesB30獲得 小片段，與Sail和Sacl雙酶切后的pPIC9K大片段在16。C下用T4連接酶反應(yīng)過夜。用CaCl2 法轉(zhuǎn)到DH5 a中，并均勻涂布LB-Ampici 11 in平板，37 °C ， 20h，挑取長出的菌落，提質(zhì)粒，用 Xhol， Notl雙酶切鑒定，選出嵌合上HMPIDesB30片段的菌(命名為pPIC9K-HMPIDesB30)，測序。 實施例4 :HMPIDesB30的誘導(dǎo)表達(dá)及酵母表達(dá)工程菌的獲得 將pPIC9K-HMPIDesB30質(zhì)粒用Sail線性化后電轉(zhuǎn)入畢赤酵母宿主菌GS115，電轉(zhuǎn) 后立即向電轉(zhuǎn)杯中加lmL lmol/L預(yù)冷的山梨醇懸浮菌體，取200iiL菌液涂布含有G418濃 度差(0. 5， 1， 2， 3， 4)的MD板，30。C烘箱培養(yǎng)5-7天，長出的菌落數(shù)分別為75， 30， 11， 6， 3 個，說明多拷貝篩選成功。從含G4184mg/mL MD平板上選出一個高表達(dá)菌株，經(jīng)過72h誘導(dǎo)， 采用HPLC法檢定，獲得一株表達(dá)量相對較高的菌定為工程菌。
實施例5 :重組人DesB30胰島素的純化(純化結(jié)果見示意圖2)
步驟1 :大孔吸附樹脂層析 發(fā)酵液經(jīng)高速冷凍離心機(23，000g，4°C )連續(xù)流離心后，收集上清。為防止微 小顆粒堵塞填料，發(fā)酵上清液用0. 45 m濾紙過濾。平衡緩沖用乙酸調(diào)去離子水pH值至 3-4，上樣后用25%乙醇(乙酸調(diào)pH值至3-4)清洗雜質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物由60%乙醇(乙酸調(diào)pH 至3-4)洗脫。平衡速率30mL/min ;上樣速率10mL/min洗脫速率20mL/min。
步驟2 :陽離子交換層析選用5mMol/L乙酸-乙酸鈉作為平衡緩沖，25mMol/L Tris-HCl pH 9. 0洗脫。平 衡速率25mL/min，上樣速率13mL/min，洗脫速率13mL/min。
步驟3 :ZnCl2沉淀 向SP柱的洗脫液中加入lmMol/LZnCl2，4t:靜置過夜。高速冷凍離心棄沉淀，再向 上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4。C靜置過夜，離心后將沉淀溶解于含10-20mMol/L EDTA 的25mMol/L Tris—HCl (pH9. 0)中。
步驟4:胰蛋白酶酶切 酶切緩沖25mMol/LTris-HCl (pH9. 0)，按酶/蛋白質(zhì)量比1 : 5000加入經(jīng)TPCK 處理過的胰蛋白酶，混勻，4t:酶切過夜。用lmol/L HCl調(diào)整pH至3.0以下終止反應(yīng)。反 相回收酶切產(chǎn)物獲得重組人DesB30胰島素樣品后凍干。(酶切效率見示意圖3，4)
實施例6 :重組人DesB30胰島素LysB29單分子聚乙二醇修飾(DesB30-PEGl)
(1)將1份DesB30人胰島素溶于DMF和Na2PH04混合溶液(pH值為9. 5 10. 5) (份數(shù)以摩爾計)； (2)將2份mPEG-SPA (5K)溶于DMF (份數(shù)以摩爾計)； (3)胰島素溶液與mPEG-SPA溶液冰上混合，室溫攪拌20 30min， DDW稀釋10倍 加稀HC1至pH值為3終止反應(yīng)；(修飾結(jié)果見示意圖5、7) [OOes] (4)反相HPLC回收修飾產(chǎn)物(圖4峰1)。 實施例7 :重組人DesB30胰島素LysB29和GlyA1雙分子聚乙二醇修飾 (DesB30-PEG2) (1)將1份DesB30人胰島素溶于DMF和Na2PH04混合溶液(pH值為9. 5 10. 5) (份數(shù)以摩爾計)； (2)將4份mPEG-SPA(5K)溶于DMF(份數(shù)以摩爾計)； (3)胰島素溶液與mPEG-SPA溶液冰上混合，冷卻至室溫攪拌20 30min， DDW稀 釋10倍加稀HC1至pH值為3終止反應(yīng)；(修飾結(jié)果見示意圖6、8)
(4)反相HPLC回收修飾產(chǎn)物(圖5峰2)。
實施例8 :STZ致小鼠糖尿病模型的建立 按200mg/kg劑量腹腔注射STZ (用0. lmol/L檸檬酸鈉緩沖液pH 4. 4現(xiàn)用現(xiàn)配成 20mg/mL的溶液)進(jìn)行損傷。注射后提供充足的食物和水，觀察是否有多飲、多食、多尿及體 重減輕的現(xiàn)象。注射STZ 72h后，測定體重和空腹(6h)血糖值，體重明顯減輕，并且血糖值 > 16. 7mmol/L確定為模型 實施例9 :幾種修飾胰島素藥效持續(xù)時間的比較 將成模小鼠，隨機分為4組A陰性對照組(不注射任何藥物)，B陽性對照組 (Detemir)組，C DesB30-PEGl組，D DesB30-PEG2組。B、 C、 D、組按0. 5me/kg給藥，給藥后4、8U2、24、36、48h斷尾測空腹(6h)血糖值，采血時若血糖值高于成模時血糖值則終止取
樣。藥效持續(xù)時間長短排序DesB30-PEG2 > DesB30-PEGl > Detemir
空腹血糖值 體重
胰島素-成模前成模后4h8h12h24 h36 h48 h成模前成模后
不注射 (陰性對照)3.7±0.419.4±2.120.8±2.323.3±1.725.5土1.226.2±0.526.3±0.722.2士2.418-5±2-7"
Detemir (陽性對照)3.7±0.220.肚3.0"16.4土2甲88113.0±2.3*17.9±3 0*22.0±2.222.5±2.219.8±2.0**
DesB30-PEG23.8±0.218.9±2.3**8.5±2-5*8.7±2.4*8.2±2.4*17.7±2.4*23.9土3.821.2±2.317.3士2.1"
DesB30-PEG13.8±0.219.3±3.0**13.5±2.7*14.2±2.116.4±2.522.3±1.823,3±1.919.7士1.9" 血糖濃度與時間關(guān)系見附圖9 實施例10 :DesB30-PEG2的代謝特征實驗將成模小鼠，隨機分為2組ADesB30-PEG2，B Detemir組?？崭?h后按0. 5mg/kg 給藥。給藥后1、2、3、4、6h斷尾測血糖值。DesB30-PEG2未出現(xiàn)代謝的波峰與波谷，代謝特 征與Detemir類似。(見附圖10)
_成模時 1 h_^_^_￡^_6h
Detemir 19.0±1.8 16.3±1.9 13.2±2.0 10.2±2.1 8.9±1.9 9.5±2.0
DesB30-PEG2 19.6±2.0 17.3±2.0 14.6±2.1 11.7±2.2 9.4±2.0 9.4±1.9
權(quán)利要求
聚乙二醇化重組人DesB30胰島素包括(1)重組人DesB30胰島素的制備方法。(2)重組人DesB30胰島素的LysB29或者GlyA1和LysB29的聚乙二醇修飾。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l所述的中重組人DesB30胰島素由基因工程重組表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)化、發(fā) 酵、純化、酶切而制得。
3. 權(quán)利要求1或2所述的重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞為P. Pastoris酵母。
4. 權(quán)利要求1或2所述的重組人DesB30胰島素的制備方法，其特征在于純化和酶切具 體步驟如下(1) 發(fā)酵液經(jīng)離心和O. 45iim濾紙過濾后上樣非極性大孔吸附樹脂。用乙酸調(diào)pH值至 3-4，上樣后用25%乙醇(乙酸調(diào)pH值至3-4)清洗雜質(zhì)，表達(dá)產(chǎn)物由60%乙醇(乙酸調(diào)pH 至3-4)洗脫；(2) 強陽離子柱層析。選用5mMol/L乙酸-乙酸鈉(pH3-4)作為平衡緩沖，20mMol/L Tris-HCl(pH 9)洗脫目的蛋白；(3) ZnCl2沉淀。向洗脫液中加入lmMol/L ZnCl2， 4。C靜置過夜。高速冷凍離心棄沉淀，再 向上清中加入10-20mMol/L ZnCl2， 4"靜置過夜，離心后將沉淀溶解于含10-20mMol/LEDTA 的25mMol/L Tris—HCl(pH9. 0)中；(4) 酶切。按質(zhì)量比1 : 5000加入經(jīng)TPCK處理過的胰蛋白酶，4t:酶切過夜。用1Mo1/ LHC1調(diào)整pH至3. 0以下終止反應(yīng)。
5. 權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素由DesB30胰島素與單甲氧基 聚乙二醇(mPEG)琥珀酰亞胺基活性基因，通過胰島素上的游離氨基結(jié)合形成酰氨鍵而成。 單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺基活性基因包括琥珀酰亞胺基包括琥珀酰亞胺基琥珀酸酯 (SS)、琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC)、琥珀酰胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亞胺基丁酸酯(SBA)、琥 珀酰亞胺基甲酸酯(SCM)、琥珀酰亞胺基琥珀酰胺(SSA)或N-羥基-琥珀酰亞胺(NHS)。
6. 權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素包括LysB29單修飾聚乙二醇化 DesB30重組人胰島素和GlyA1和LysB29雙修飾聚乙二醇化重組人DesB30胰島素。
7. 權(quán)利要求1的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素具有下式<formula>formula see original document page 3</formula>
8.權(quán)利要求1的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素具有下式
9. 權(quán)利要求7，8所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，式中(OCH2CH2)n的n代表 20-200。
10. 權(quán)利要求1所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素的修飾方法，其特征在于具體 步驟如下(1) 將1份人DesB30胰島素溶于0. 2mol/L Na2ra04混合溶液(pH值為9. 0-10. 5)(份 數(shù)以摩爾計)；(2) 將1 : 2 5份mPEG溶于DMF (份數(shù)以摩爾計)；(3) 胰島素溶液與mPEG溶液混合，室溫攪拌20 30min，稀釋并將pH降至3終止反應(yīng)；(4) 反相HPLC回收修飾產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求5 9中所述的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素適應(yīng)I和II型糖尿病 的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種去B30人胰島素(重組人DesB30胰島素)的重組制備方法及采用化學(xué)修飾的方法對該胰島素LysB29或者GlyA1和LysB29結(jié)合聚乙二醇。本發(fā)明制備的聚乙二醇化重組人DesB30胰島素，聚乙二醇與胰島素以酰氨鍵相連，其中聚乙二醇分子量范圍為500-10000。經(jīng)動物實驗證明聚乙二醇化重組人DesB30胰島素保留了胰島素的生物活性，在被試動物體內(nèi)代謝平穩(wěn)，降血糖持續(xù)作用時間延長?？勺鳛橐环N治療糖尿病的長效胰島素制劑。
文檔編號C07K1/30GK101717442SQ200810232828
公開日2010年6月2日 申請日期2008年10月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月9日
發(fā)明者張益 , 范開, 陳海容, 高劍坤 申請人:重慶富進(jìn)生物醫(yī)藥有限公司