尿酸酶多囊脂質(zhì)體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物制劑領域。本發(fā)明涉及尿酸酶多囊脂質(zhì)體的配方及制備方法。本發(fā)明制備得到的尿酸酶多囊脂質(zhì)體可以提高尿酸酶的活性、降低其免疫原性，并且能使尿酸酶緩慢釋放，延長藥物作用時間和藥效時間。
【專利說明】尿酸酶多囊脂質(zhì)體及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥制劑領域，涉及尿酸酶多囊脂質(zhì)體及其制備方法。
【背景技術】
[0002]尿酸是人體嘌呤堿基分解代謝終產(chǎn)物，經(jīng)腎臟排泄。體內(nèi)尿酸生成超過腎臟排泄時,血清尿酸會顯著升高,造成高尿酸血癥。高尿酸血癥與痛風、心血管疾病、腫瘤裂解綜合征及腎臟疾病的引發(fā)或加劇密切相關。因此，需要開發(fā)安全有效的藥物來治療高尿酸血癥。尿囊素的優(yōu)良水溶性和腎臟對其高效的排泄能力使尿酸酶可能成為治療高尿酸血癥的理想藥物。臨床研究表明尿酸酶可快速高效降低血尿酸，且專一性高，在治療腫瘤溶解綜合征的高尿酸血癥時，尿酸酶比別嘌呤醇更安全有效。尿酸酶還可以用于防治腫瘤化療時產(chǎn)生的高尿酸血癥，也可用于治療痛風，故將其用作降低血漿尿酸的藥物存在巨大需求。多囊脂質(zhì)體作為新型脂質(zhì)體，主要用于運載親水性化學藥物(阿米卡星，嗎啡，順鉬，阿昔洛韋等)和小分子肽(干擾素，胰島素樣生長因子，載脂蛋白E肽鏈和人表皮生長因子等)，注射后，作為藥物貯庫隨時間緩慢釋放被包封的藥物達到緩釋長效的作用。尿酸酶為大分子藥用酶，其本身具有體內(nèi)外活性低，體內(nèi)生理條件下易降解，具有免疫原性等缺點，所以有必要研制能提高尿酸酶活性且具有緩釋效果的尿酸酶多囊脂質(zhì)體。經(jīng)查詢專利及文獻，目前尚無藥用酶多囊脂質(zhì)體的任何研究報道，更無尿酸酶多囊脂質(zhì)體的任何研究報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種具有活性高、免疫原性低和緩釋效果的尿酸酶多囊脂質(zhì)體及其制備方法。尿酸酶多囊脂質(zhì)體具有給藥頻率低，刺激性小，免疫原性低的優(yōu)點。本發(fā)明制備得到的尿酸酶多囊脂質(zhì)體可用于治療高尿酸血癥、痛風等。尿酸酶多囊脂質(zhì)體能克服尿酸酶在體內(nèi)活性低，循環(huán)半衰期較短，易誘發(fā)機體免疫反應，產(chǎn)生免疫原性和抗原反應等缺點。尿酸酶多囊脂質(zhì)體可以保持較長時間的有效血藥濃度，有效地提高尿酸酶的活性和穩(wěn)定性，并能降低其免疫原性。本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體制備工藝簡單，成本較低，易于控制，易于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0004]本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體，其特征在于制劑中各組分重量百分比為:尿酸酶1-3份，磷脂1-3份，膽固醇1-3份，三油酸甘油酯1-3份，葡萄糖(I) 2-6份，泊洛沙姆F-683-7份，泊洛沙姆F-12715-30份，緩沖液(1)80-120份，L-賴氨酸1-3份，葡萄糖
(II)10-15份，緩沖液(11)200-500份，緩沖液(I)和緩沖液(II)指硼酸鹽緩沖液或Tris緩沖液或Bicine緩沖液，pH為8-9。本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體，可以采用復乳法制備，步驟如下:(I)初乳制備:取處方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖
(I)溶于處方量的內(nèi)水相中的緩沖液中，稱取處方量的磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作為油相，將緩沖液(I)與油相混合，在渦旋條件下制得W/0型初乳；(2)復乳制備:取處方量的L-賴氨酸與葡萄糖(II)溶于處方量的緩沖液(II)，將初乳快速加入到外水相中，機械分散制成W/0/W型復乳；(3)多囊脂質(zhì)體制備:將復乳于室溫下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，即得。
[0005]用本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的平均粒徑約為23 μ m，95%以上的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的粒徑在5~40 μ m范圍(圖1)。本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的體內(nèi)藥物代謝實驗結(jié)果表明尿酸酶多囊脂質(zhì)體在體內(nèi)可以緩慢釋放藥物，與普通尿酸酶脂質(zhì)體(藥時曲線下面積AU(V00)為196.4U/L*h ;半衰期t1/2為2.6h)相比，尿酸酶多囊脂質(zhì)體(AUCV00)為361.8Ug/L*h ；t1/2為4.5h)具有明顯的緩釋作用和較高的生物利用度(圖2)。本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的體內(nèi)藥效學實驗結(jié)果表明尿酸酶多囊脂質(zhì)體降尿酸的效果明顯優(yōu)于游離尿酸酶，尿酸酶多囊脂質(zhì)體將高尿酸血癥大鼠體內(nèi)的尿酸濃度降到正常水平只需要9小時左右，而游離尿酸酶卻需要36小時(圖3)。本發(fā)明提供的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的免疫原性實驗結(jié)果表明大鼠靜脈注射尿酸酶多囊脂質(zhì)體后體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平明顯低于靜脈注射游離尿酸酶后體內(nèi)的抗體水平，21天時大鼠靜脈注射游離尿酸酶是靜脈注射尿酸酶多囊脂質(zhì)體后體內(nèi)的抗體量的2倍多，說明尿酸酶多囊脂質(zhì)體的免疫原性低，與游離尿酸酶相比臨床應用更好(圖4)。
[0006]目前尚無藥用酶多囊脂質(zhì)體的任何研究報道，本專利首次報道尿酸酶多囊脂質(zhì)體及其制備方法。本專利不同于通常研究報道的化學藥物或小分子肽的多囊脂質(zhì)體的配方和制備工藝。由于尿酸酶的最適pH為8.5，本發(fā)明首次在尿酸酶多囊脂質(zhì)體的配方中用pH8-9的硼酸鹽緩沖液或Tris緩沖液或Bicine緩沖液替換普通多囊脂質(zhì)體配方中的蒸餾水(pH約為7.0)，使尿酸酶能在接近其最適pH環(huán)境中，將用本發(fā)明制備得到的尿酸酶多囊脂質(zhì)體靜脈注射入體內(nèi)后，體內(nèi)緩釋效果非常明顯。尿酸酶為多肽蛋白質(zhì)類藥物，可溶于水，我們曾米用以前文獻報道(Angst MS, Drover DR.Pharmacology of drugs formulated withDepoFoam:a sustained release drug delivery system for parenteral administrationusing multivesicular liposome technology[J].Clin Pharmacokinet.2006,45 (12):1153-1176 ；Davidson EM, Barenholz Y，Cohen R，et al.High-Dose bupivacaine remotelyloaded into multivesicular liposomes demonstrates slow drug release withoutsystemic toxic plasma concentrations after subcutaneous administration inhumans [J].AnesthAnalg.2010，110(4):1018-1023)的通常用于制備化學藥物或多肽類的多囊脂質(zhì)體的配方和制備工藝得到的普通尿酸酶多囊脂質(zhì)體，實驗結(jié)果表明尿酸酶的活性非常低，故本發(fā)明首次在尿酸酶多囊脂質(zhì)體的配方中用PH8-9的硼酸鹽緩沖液或Tris緩沖液或Bicine緩沖液替換普通配方中的蒸餾水，使尿酸酶能在接近其最適pH環(huán)境中，使得靜脈注射本發(fā)明制備得到的尿酸酶多囊脂質(zhì)體后，不但體內(nèi)保留的活性較游離酶高很多，而且緩釋效果也非常明顯，分析原因可能如下:當尿酸酶包裹于多囊脂質(zhì)體，其內(nèi)部的微環(huán)境接近尿酸酶的最適PH，其活性保留高。多囊脂質(zhì)體為多個非同心圓的囊泡結(jié)構，進入體內(nèi)后其囊泡由外到內(nèi)緩慢破裂，這樣便使易溶于水的尿酸酶達到了緩釋的目的。
【專利附圖】
【附圖說明】[0007]圖1為本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的粒徑
[0008]本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的平均粒徑約為23 μ m，95%以上的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的粒徑在5~40 μ m范圍.[0009]圖2為本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的體內(nèi)藥代動力學[0010]大鼠靜脈給予尿酸酶多囊脂質(zhì)體，普通脂質(zhì)體和游離尿酸酶后的體內(nèi)平均血藥濃度一時間曲線如圖2。實驗結(jié)果表明與普通脂質(zhì)體和游離尿酸酶比較，尿酸酶多囊脂質(zhì)體在體內(nèi)可以緩慢釋放藥物，具有緩釋作用。
[0011]圖3為本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的體內(nèi)藥效學
[0012]將大鼠造成高尿酸血癥模型后，靜脈給予尿酸酶多囊脂質(zhì)體和游離尿酸酶，采用尿酸試劑盒測定尿酸濃度，大鼠體內(nèi)尿酸水平變化如圖3。尿酸酶多囊脂質(zhì)體將高尿酸血癥大鼠體內(nèi)的尿酸濃度降到正常水平只需要9小時左右，而游離尿酸酶卻需要36小時，表明尿酸酶多囊脂質(zhì)體降尿酸效果明顯優(yōu)于游離尿酸酶。
[0013]圖4為本發(fā)明制得的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的免疫原性實驗
[0014]連續(xù)六周大鼠靜脈給予尿酸酶多囊脂質(zhì)體和游離尿酸酶后，采用ELISA方法測定大鼠體內(nèi)產(chǎn)生的抗體量，大鼠體內(nèi)抗體水平變化如圖4，陽性對照是卵白蛋白，陰性對照是生理鹽水。實驗結(jié)果表明結(jié)果表明大鼠靜脈注射尿酸酶多囊脂質(zhì)體后體內(nèi)產(chǎn)生的抗體水平明顯低于靜脈注射游離尿酸酶后體內(nèi)的抗體水平，21天時大鼠靜脈注射游離尿酸酶是靜脈注射尿酸酶多囊脂質(zhì)體后體內(nèi)的抗體量的2倍多，說明尿酸酶多囊脂質(zhì)體的免疫原性低，與游離尿酸酶相比更具有臨床應用價值。
【具體實施方式】
[0015]為了進一步說明本發(fā)明及其優(yōu)點，給出了下列特定的實施例，應理解這些實施例僅有于具體說明而不是作為本發(fā)明范圍的限制。
[0016]實施例1:
[0017]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂1份，膽固醇1份，三油酸甘油酯I份，葡萄糖(I) 2份，泊洛沙姆F-683.4份，泊洛沙姆F-12715份，硼酸鹽緩沖液pH8 (I) 80份，L-賴氨酸1份，葡萄糖(II) 10份，硼酸鹽緩沖液pH8(II) 200份。
[0018]制備方法包括下列步驟:(I)初乳制備:取處方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖(I)溶于處方量的硼酸鹽緩沖液(I)中，稱取處方量的磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作為油相，將硼酸鹽緩沖液(I)與油相混合，在渦旋條件下制得W/0型初乳；(2)復乳制備:取處方量的L-賴氨酸與葡萄糖溶于處方量的硼酸鹽緩沖液(II)，將初乳快速加入到硼酸鹽緩沖液(II)中，機械分散制成W/0/W型復乳；(3)多囊脂質(zhì)體制備:將復乳于室溫下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，即得。
[0019]實施例2:
[0020]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂1.3份，膽固醇1.4份，三油酸甘油酯1.3份，葡萄糖(1)4份，泊洛沙姆F-684.8份，泊洛沙姆F-12721份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.2 (I) 95 份，L-賴氨酸 2.2 份，葡萄糖(II) 12 份，Bicine 緩沖液 pH8.7 (II) 360 份。
[0021]制備方法基本同實施例1。
[0022]實施例3:
[0023]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂1.6份，膽固醇1.6份，三油酸甘油酯1.5份，葡萄糖(I) 5.5份，泊洛沙姆F-686.5份，泊洛沙姆F-12728份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.9 (I) 115 份，L-賴氨酸 1.2 份，葡萄糖(II) 10.5 份，Tris 緩沖液 pH8.3 (II) 230 份。
[0024]制備方法基本同實施例1。[0025]實施例4:
[0026]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂1.9份，膽固醇1.9份，三油酸甘油酯2.9份，葡萄糖(I) 4.5份，泊洛沙姆F-685.5份，泊洛沙姆F-12725份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.2 (I) 105份，L-賴氨酸2.8份，葡萄糖(II) 14.5份，硼酸鹽緩沖液pH8.2 (II) 420份。
[0027]制備方法基本同實施例1。
[0028]實施例5:
[0029]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂2份，膽固醇1.5份，三油酸甘油酯2.1份，葡萄糖(1)3份，泊洛沙姆F-685份，泊洛沙姆F-12722.5份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.5 (I) 100份，L-賴氨酸1.9份，葡萄糖(II) 13.3份，硼酸鹽緩沖液pH8.5 (II) 330份。
[0030]制備方法基本同實施例1。
[0031]實施例6:
[0032]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂2.1份，膽固醇2.2份，三油酸甘油酯2.2份，葡萄糖(I) 2.8份，泊洛沙姆F-683.8份，泊洛沙姆F-12717份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.7 (I) 85 份，L-賴氨酸 1.6 份，葡萄糖(II) 11.5 份，Tris 緩沖液 pH8.7 (II) 290 份。
[0033]制備方法基本同實施例1。
[0034]實施例7:
[0035]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂2.3份，膽固醇2.4份，三油酸甘油酯2.4份，葡萄糖(I) 3.2份，泊洛沙姆F-684.2份，泊洛沙姆F-12719份，硼酸鹽緩沖液ρΗ9⑴90份，L-賴氨酸2.4份，葡萄糖(II) 14份，Bicine緩沖液pH8.2 (II) 390份。制備方法基本同實施例1。
[0036]實施例8:
[0037]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂2.6份，膽固醇2.8份，三油酸甘油酯2.8份，葡萄糖(1)5份，泊洛沙姆F-686份，泊洛沙姆F-12727份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.2 (I) 110份，L-賴氨酸1.4份，葡萄糖(II)Il份，硼酸鹽緩沖液pH8.9 (II) 260份。
[0038]制備方法基本同實施例1。
[0039]實施例9:
[0040]配方中含有的各組分的重量組成比為:卵磷脂3份，膽固醇3份，三油酸甘油酯3份，葡萄糖(I) 6份，泊洛沙姆F-687份，泊洛沙姆F-12730份，硼酸鹽緩沖液ρΗ8.5 (I) 120份，L-賴氨酸3份，葡萄糖(II) 15份，硼酸鹽緩沖液pH8.8 (II) 500份。
[0041]制備方法基本同實施例1。
【權利要求】
1.一種尿酸酶多囊脂質(zhì)體，其特征在于制劑中尿酸酶含量為(0.5~1.5U/mL)，制備制劑所用的緩沖液PH為8~9，離子強度為10~IOOmM,其余各組分重量百分比為: 磷脂1-3份 膽固醇1-3份 三油酸甘油酯1-3份 葡萄糖(I)2-6份 泊洛沙姆F-683-7份 泊洛沙姆F-12715-30份 。 緩沖液(I)80-120份 L-賴氨酸1-3份 葡萄糖(II)10-15份 緩沖液(II)200-500份
2.根據(jù)權利要求1所述的尿酸酶多囊脂質(zhì)體，其特征在于制備制劑所用的緩沖液是硼酸-硼砂緩沖液、Tris緩沖液、Bicine緩沖液，離子強度為10~lOOmM，pH值范圍在8~9。
3.根據(jù)權利要求1所述的尿酸酶多囊脂質(zhì)體的制備方法，其特征在于該方法包括下列步驟:(1)初乳制備:取處方量的尿酸酶、泊洛沙姆F-127、泊洛沙姆F-68、葡萄糖(I)溶于處方量的緩沖液(I)中，稱取處方量的磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯溶于乙醚作為油相，將緩沖液⑴與油相混合，在渦旋條件下制得W/0型初乳；(2)復乳制備:取處方量的L-賴氨酸與葡萄糖(II)溶于處方量的緩沖液(II)中，將初乳快速加入到外水相中，機械分散制成W/0/W型復乳；(3)多囊脂質(zhì)體制備:將復乳于室溫下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，即得。
4.根據(jù)權利要求1所述的尿酸酶多囊脂質(zhì)，其特征在于:尿酸酶多囊脂質(zhì)體的平均粒徑約為23 μ m, Zeta電位小于-20，脂質(zhì)納米粒介導酶的微環(huán)境偏堿性，體液pH7.4時，比較于游離尿酸酶，尿酸酶多囊脂質(zhì)的催化活性增加，緩釋效果明顯，半衰期延長，免疫原性下降。
【文檔編號】A61K9/127GK104013576SQ201410271072
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月6日 優(yōu)先權日:2014年6月6日
【發(fā)明者】張景勍, 熊華蓉, 周岐新, 周云莉, 何丹, 胡雪原 申請人:重慶醫(yī)科大學