齊墩果酸多囊脂質(zhì)體、制備方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種齊墩果酸多囊脂質(zhì)體、制備方法、及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 齊墩果酸（Oleanolic acid，簡稱0A)，又名土當(dāng)歸酸，別名慶四素，化學(xué)名為 (3 β )-3-Hy-droxyolean-12-en-28-〇ic_acid，為白色簇狀結(jié)晶性粉末，無臭、無味，不溶于 水，可溶于甲醇、乙醇、氯仿及丙酮。OA屬五環(huán)三萜類化合物，主要以游離或者皂苷形式存在 于夏枯草、連翹、油橄欖、女貞及木瓜等植物中。1908年，OA首次由FB Powers自木樨科植 物Oleaeuro-peae L的葉中分離出來，并由Ruzicka在1946年確定了其結(jié)構(gòu)。我國湖南醫(yī) 藥工業(yè)研宄所在1975年對青葉膽抗肝炎有效成分的化學(xué)和藥理研宄中，分離并鑒定了 OA 單體，此后研宄者們便對OA的藥理作用進(jìn)行了廣泛深入的研宄。OA除了具有保肝、抗炎、抗 病毒、降糖降脂、雙向免疫調(diào)節(jié)、抗高血壓的生物物活性外，還具有強(qiáng)心、抗心律失常、抑制 血小板聚集和抗過氧化等多種藥理作用，臨床上OA制劑主要用于治療急性黃疸型和慢性 中毒型肝炎，并作為抗癌輔助藥物。此外，OA還憑借其高效低毒、材料易取等特點(diǎn)成為了腫 瘤防治研宄方面的熱點(diǎn)，其抗癌作用機(jī)制幾乎貫穿了腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段。目前臨床上齊 墩果酸的相關(guān)制劑主要是齊墩果酸片，但齊墩果酸為脂溶性藥物，存在著在胃腸道溶出度 低、吸收性差、肝臟首過效應(yīng)明顯等缺點(diǎn)，使其生物利用度大大降低，因此，研宄開發(fā)齊墩果 酸的新劑型非常必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種生物利用度高的齊墩 果酸多囊脂質(zhì)體、制備方法、及其應(yīng)用。
[0004] 一種齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟：
[0005] 1)、按量稱取大豆磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯、齊墩果酸、硬脂酸溶解于有機(jī)溶劑 中，溶解形成油相；
[0006] 2)、按量取規(guī)定量的油相加入內(nèi)水相中，用乳化機(jī)剪切分散形成初乳；
[0007] 3)、按量取規(guī)定量的初乳加入到外水相中，旋渦振蕩形成復(fù)乳；
[0008] 4)、將復(fù)乳迅速轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，即得齊墩果酸多囊脂 質(zhì)體。
[0009] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，所述大豆磷脂、膽固醇、 三油酸甘油酯、齊墩果酸的質(zhì)量比為: 0.57 : 0.38 : 0.2;硬脂酸在油相中的添加濃度 為：lmg/ml〇
[0010] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，所述油相與內(nèi)水相的體 積比為1-1.5 : 1，初乳與外水相的體積比為0.3-0. 5 : 1。
[0011] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，所述內(nèi)水相按質(zhì)量百分 比計(jì)，包括：
[0012] 葡萄糖5%
[0013] 余量：水；
[0014] 所述外水相按質(zhì)量百分比計(jì)，包括：
[0015] 葡萄糖4%
[0016] 吐溫-80 2%
[0017] 聚乙烯醇3%
[0018] 余量：水。
[0019] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，所述有機(jī)溶劑為氯仿與 乙醚按體積比為1 : 1混合而成。
[0020] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，步驟2中，初乳的剪切速 度為13500rpm、剪切時(shí)間為150s。
[0021] 進(jìn)一步地，如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，步驟3中，旋渦振蕩的時(shí) 間為25s。
[0022] -種根據(jù)如上任一制備方法制備得到的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體。
[0023] 如上所述的齊墩果酸多囊脂質(zhì)體在制備治療抗癌藥物中的應(yīng)用。
[0024] 如上所述的應(yīng)用，所述藥物是用于治療肝癌的藥物。
[0025] 本發(fā)明將齊墩果酸載于多囊脂質(zhì)體的類脂層中制備齊墩果酸多囊脂質(zhì)體 (OA-MVLs)，以期提高生物利用度，達(dá)到緩慢釋放藥物，減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性的目 的。
【附圖說明】
[0026] 圖1為OA-MVLs在光學(xué)顯微鏡下形態(tài)（X 400);
[0027] 圖2為OA-MVLs的粒度分布圖；
[0028] 圖3為OA-MVLs及游離OA在釋放介質(zhì)中的累積釋放率曲線圖；
[0029] 圖4A為OA-MVLs作用于HepG2模型細(xì)胞，孵育4h后，DAPI藍(lán)色熒光標(biāo)記的細(xì)胞 核顯微鏡圖；
[0030] 圖4B為OA-MVLs作用于HepG2模型細(xì)胞，孵育4h后，DHPE綠色熒光標(biāo)記的 OA-MVLs顯微鏡圖；
[0031] 圖5為各因素交互作用對包封率和平均粒徑影響的響應(yīng)曲面和等高線圖；圖5A為 X1 (膽固醇與磷脂的質(zhì)量比）和X2 (藥脂比）對包封率的影響；圖5B為X1 (膽固醇與磷脂 的質(zhì)量比）和X3(三油酸甘油酯與磷脂的質(zhì)量比）對包封率的影響；圖5C為X2 (藥脂比） 和X3 (三油酸甘油酯與磷脂的質(zhì)量比）對包封率的影響；圖為X1 (膽固醇與磷脂的質(zhì)量 比）和X2(藥脂比）對粒徑的影響；圖5E為X2(藥脂比）和X 3(三油酸甘油酯與磷脂的質(zhì) 量比）對粒徑的影響；圖5F為X1(膽固醇與磷脂的質(zhì)量比）和X 3(三油酸甘油酯與磷脂的 質(zhì)量比）對粒徑的影響；
[0032] 圖6為不同濃度OA-MVLs作用于H印G2細(xì)胞后的細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化顯微鏡圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行 清楚、完整地描述。顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基 于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其 他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0034] 實(shí)施例1 :
[0035] -種齊墩果酸多囊脂質(zhì)體的制備方法，包括以下步驟：
[0036] 1)、按量稱取大豆磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯、齊墩果酸、硬脂酸溶解于有機(jī)溶 劑中，溶解形成油相；其中，所述大豆磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯、齊墩果酸的質(zhì)量比為： 1 : 0. 57 : 0. 38 : 0. 2;硬脂酸在油相中的添加濃度為：lmg/ml;
[0037] 2)、量取Iml的油相加入1ml內(nèi)水相中，用乳化機(jī)剪切分散形成初乳；剪切速度為 13500rpm、剪切時(shí)間為150s ;
[0038] 3)、量取0. 3ml的初乳加入到Iml外水相中，旋渦振蕩形成復(fù)乳；旋渦振蕩的時(shí)間 為 25s ;
[0039] 4)、將復(fù)乳迅速轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，即得齊墩果酸多囊脂 質(zhì)體。
[0040] 實(shí)施例2 :
[0041] 1)、按量稱取大豆磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯、齊墩果酸、硬脂酸溶解于有機(jī)溶 劑中，溶解形成油相；其中，所述大豆磷脂、膽固醇、三油酸甘油酯、齊墩果酸的質(zhì)量比為： 1 : 0. 57 : 0. 38 : 0. 2;硬脂酸在油相中的添加濃度為：lmg/ml;
[0042] 2)、量取I. 5ml的油相加入1ml內(nèi)水相中，用乳化機(jī)剪切分散形成初乳；剪切速度 為13500rpm、剪切時(shí)間為150s ;
[0043] 3)、量取0. 5ml的初乳加入到Iml外水相中，旋渦振蕩形成復(fù)乳；旋渦振蕩的時(shí)間 為 25s ;
[0044] 4)、將復(fù)乳迅速轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，即得齊墩果酸多囊脂 質(zhì)體。
[0045] 上述實(shí)施例中，所述內(nèi)水相按質(zhì)量百分比計(jì)，包括：5%葡萄糖、余量：水。所述外 水相按質(zhì)量百分比計(jì)，包括：4%葡萄糖、2%吐溫_80、3%聚乙稀醇、余量：水。所述有機(jī)溶 劑為氯仿與乙醚按體積比為1:1混合而成。
[0046] 齊墩果酸（OA)屬于五環(huán)三萜類化合物，臨床上主要用于治療急性黃疸型和慢性 中毒型肝炎。目前臨床上其相關(guān)制劑主要是齊墩果酸片，但齊墩果酸為脂溶性藥物，存在著 在胃腸道溶出度低、吸收性差、肝臟首過效應(yīng)明顯等缺點(diǎn)，使其生物利用度大大降低。因此， 本發(fā)明將齊墩果酸載于多囊脂質(zhì)體的類脂層中制備齊墩果酸多囊脂質(zhì)體（OA-MVLs)，以期 提高生物利用度，達(dá)到緩慢釋放藥物，減少給藥次數(shù)，提高患者順應(yīng)性的目的。
[0047] 下面對本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行簡述：
[0048] 1、本發(fā)明采用復(fù)乳法制備OA-MVLs，并用中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化其處方和制備工藝。
[0049] 2、考察OA-MVLs的形態(tài)、包封率、粒徑及其在pH7. 4的PBS緩沖液中的釋藥行為。
[0050] 3、采用MTT法和DAPI染色法研宄OA-MVLs對!fepG2細(xì)胞的抑制及促凋亡作用，并 采用激光共聚焦測定OA-MVLs的入胞情況，測定給藥后H印G2細(xì)胞內(nèi)外齊墩果酸濃度的變 化。
[0051] 4、選用SD大鼠為動物模型，以齊墩果酸原料藥溶液為對照，通過皮下注射給藥， 研宄OA-MVLs在大鼠體內(nèi)的緩釋效果。
[0052] 結(jié)果：
[0053] 1、本實(shí)驗(yàn)制得的OA-MVLs形態(tài)規(guī)則，粒徑符合正態(tài)分布，包封率為82. 3±0. 61 %。
[0054] 2、OA-MVLs在pH7. 4的PBS緩沖液中沒有明顯的突釋現(xiàn)象，120h累積釋藥 80. 56±1. 27%，顯示了較好的緩釋及長效作用。對OA-MVLs的釋藥曲線進(jìn)行擬合，最符合 Ritger-Peppas方程，表明OA-MVLs的釋放可能以Fick擴(kuò)散為主。
[0055] 3、OA-MVLs作用于HepG2細(xì)胞，能抑制細(xì)胞增殖，并能促使細(xì)胞凋亡；OA-MVLs入 胞后分布在細(xì)胞核及細(xì)胞膜上。隨著OA-MVLs對H印G2細(xì)胞作用時(shí)間的增加，細(xì)胞內(nèi)OA濃 度逐漸增加，細(xì)胞外濃度變化不大；隨著OA-MVLs濃度的增加，細(xì)胞內(nèi)外的OA濃度也逐漸增 加。
[0056] 4、與OA溶液劑相比，OA-MVLs的半衰期明顯延長，t1/2為（4. 38±4. 34) VS(48. 14± 27. 67)h ;AUC 顯著增加，AUC(0_t)* (500 7 · 5 I ± 1 346 · 5 5) VS (24530. 94±1293. 42) ng/mL · h ;平均滯留時(shí)間顯著延長，MRT 為（6. 30±3. 63) VS(56. 84±28. 99)h，在注射96h后仍能在血漿中檢測到藥物。
[0057] 主要實(shí)驗(yàn)試劑
[0058] 大豆磷脂（PC，上海太偉藥業(yè)有限公司）
[0059] 三油酸甘油醋（TO, Aladdin chemistry Co. Ltd)
[0060] 膽固醇（Chol，成都市科龍化工試劑廠）
[0061] 齊墩果酸