本發(fā)明涉及納米材料、生化光譜分析檢測領(lǐng)域，具體涉及一種單分散銀殼磁性微球的制備方法及其在SERS檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

表面增強(qiáng)拉曼散射(Surface Enhanced Raman Scattering，SERS)是一種指紋振動光譜，具有高選擇性、高靈敏度和快速無損檢測等優(yōu)點，已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注，并被成功的用于生化檢測，傳感器，分析化學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。SERS檢測的關(guān)鍵在于高性能的SERS基底，所有的SERS增強(qiáng)均限制在金、銀等貴材料研制的SERS基底上才能完成。目前常用的SERS基底主要分為金屬顆粒和平面金屬結(jié)構(gòu)兩大類。金屬顆粒主要的優(yōu)點是制備簡單、成本低廉、適用于探測溶液中的痕量物質(zhì)，但其缺點是膠體顆粒難以長期保存，并且很難提供足夠的增強(qiáng)效應(yīng)。而平面金屬結(jié)構(gòu)SERS基底具有較高的SERS增強(qiáng)因子，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性好，但制備需要復(fù)雜儀器、成本較高，并不利于生物修飾。

近年來，以磁性顆粒為核的功能性核-殼納米材料被廣泛用于許多領(lǐng)域，比如在污水處理中，污染物可以被磁性復(fù)合粒子快速富集并降解。已有大量研究已經(jīng)表明金或銀包覆的磁性微/納米球作為活性SERS基底可以有效的檢測溶液中的目標(biāo)物。具體的使用方法是利用金殼或銀殼的磁性微/納米球富集溶液體系中的目標(biāo)物，并且在外部磁場作用下迅速清洗、分離并直接用作SERS基底進(jìn)行檢測。然而，上述金、銀殼包裹的磁性微/納米球還有一些問題亟需解決。其中最主要的是在金/銀殼包覆過程中，由于磁性顆粒容易團(tuán)聚，難以獲得具有良好分散性和均勻包覆的核殼復(fù)合顆粒。磁性顆粒的團(tuán)聚及外殼包覆的不均勻嚴(yán)重影響了SERS檢測信號的靈敏度與重復(fù)性。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有銀殼磁性微球分散性差、結(jié)構(gòu)不均一等問題，提供一種具有單分散性、高磁響應(yīng)性、銀殼完整、結(jié)構(gòu)均一的銀殼磁性微球的制備方法，并作為SERS基底進(jìn)行溶液中目標(biāo)物的痕量檢測。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：所述銀殼磁性微球(Fe₃O₄@SiO₂@Ag)核心采用磁性強(qiáng)的400nm Fe₃O₄微球，通過SiO₂殼的包覆使磁性粒子具有良好的分散性，然后通過化學(xué)鍍及種子還原法在SiO₂殼表面包覆一層完整、均一的銀殼。

一種單分散銀殼磁性微球的制備方法及其在SERS包括以下步驟：

1)合成400nm Fe₃O₄磁性微球；

2)在步驟1)合成的400nm Fe₃O₄磁性微球表面采用改進(jìn)的Stober法包覆一層50nm的SiO₂殼，使磁性顆粒(Fe₃O₄@SiO₂)具備單分散性；

3)合成的Fe₃O₄@SiO₂微球表面采用SnCl₂進(jìn)行敏化，使SiO₂殼表面吸附大量的Sn²⁺；

4)步驟3)合成的Fe₃O₄@SiO₂微球表面用化學(xué)鍍的方法實現(xiàn)表面核心化，利用吸附在SiO₂表面的Sn²⁺作還原劑，在微球表面原位生成大量的銀種子，形成Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球；

5)步驟4)合成的Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球在高濃度的PVP保護(hù)下，通過“種子介導(dǎo)生長法”合成出單分散性的、銀殼完整、連續(xù)的Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性復(fù)合微球；

步驟(1)所述Fe₃O₄微球的制備方法如下：將0.27g六水合三氯化鐵，2g聚乙二醇6000，5.4g無水乙酸鈉，溶解于80毫升乙二醇溶液中，攪拌直至完全溶解；將上述溶液轉(zhuǎn)移到聚四氟乙烯內(nèi)膽的100mL高溫反應(yīng)釜中，密封后置于鼓風(fēng)恒溫烘箱內(nèi)，在200℃反應(yīng)12h；反應(yīng)結(jié)束后自然冷卻至室溫，用磁鐵收集黑色沉淀物，用去離子水和無水乙醇各洗3次，在真空干燥箱內(nèi)于60℃干燥6小時，得到粉末狀Fe₃O₄微球備用。

步驟(2)所述改進(jìn)的Stober法的反應(yīng)體系為200mL乙醇，10mL去粒子水，8mL濃氨水混合溶液體系，F(xiàn)e₃O₄微球質(zhì)量為20mg，正硅酸乙酯用量為200uL。

步驟(3)所述SnCl₂敏化的反應(yīng)條件如下：10mL Fe₃O₄@SiO₂微球溶液(1mg/mL)與10mL 3％SnCl₂溶液超聲反應(yīng)30分鐘，加100uL鹽酸防止SnCl₂水解。

步驟(4)所述Fe₃O₄@SiO₂微球表面核心化使用的銀氨溶液溶度為300mM，超聲反應(yīng)時間為20分鐘，所形成的Fe₃O₄@SiO2-Ag seed微球保存于乙醇溶液中。

步驟(5)所述的獲得Fe₃O₄@SiO₂@Ag微球的還原方法為種子生長法，F(xiàn)e₃O₄@SiO₂-Ag seed濃度為0.01mg/mL，還原劑為甲醛，催化劑為濃氨水，保護(hù)劑為PVP(1mg/mL)，超聲條件下快速還原出銀殼完整、連續(xù)的Ag殼。

步驟(5)所述的PVP是用來避免核-殼微球的聚集和控制銀殼的生長，改善粒子分散性。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式，優(yōu)選地，上述單分散銀殼磁珠的粒徑為560-600nm，銀殼厚度為30-50nm.

本發(fā)明還提供上述的單分散銀殼磁珠在SERS檢測中的應(yīng)用方法。

所制備的單分散Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球用作SERS基底進(jìn)行SERS檢測的方法為：將所制備的Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球加入到待測溶液(包括血清、體液、組織液等)中，震蕩孵育30分鐘后，利用外部磁鐵快速分離銀殼磁珠。然后將Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球轉(zhuǎn)移至干凈的硅片上，直接進(jìn)行SERS檢測，SERS應(yīng)用的方法如圖3所示。Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球的用量為每 組樣品中加入5微升，磁珠濃度為10mg/mL。

本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果為：

本發(fā)明合成的Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球具有分散性好、磁響應(yīng)性強(qiáng)及銀殼完整、均一等優(yōu)點。在該銀殼磁性微球組成部件中，400nm Fe₃O₄微球提供了足夠的磁性，在制備、洗滌時，可以方便的使用外加磁鐵收集，避免了使用離心、過濾等繁瑣耗時的方法。

本發(fā)明使用改進(jìn)的Stober法精確的包覆厚度為50nm的SiO₂殼，厚度適中的SiO₂殼既保證了磁性微球的分散性，又不會嚴(yán)重削弱磁性微球的磁感應(yīng)性。

本發(fā)明充分利用了SnCl₂介導(dǎo)的化學(xué)鍍的方法，使SiO₂殼敏化后吸附大量Sn²⁺，然后還原銀氨溶液形成大量Ag種子，成功實現(xiàn)了SiO₂殼的核心化。

本發(fā)明采用PVP為粒子保護(hù)劑，使用種子還原法快速獲得了銀殼完整、均一的單分散銀殼磁珠。并且，種子還原法形成的銀殼為銀種子長大形成的銀納米粒堆積而成，表面具有大量縫隙及納米級粗糙，使其具有大量的SERS熱點。

本發(fā)明制備的單分散銀殼磁性微球結(jié)構(gòu)均一，銀殼完整、表面粗糙，可作為一種高性能的SERS基底。

本發(fā)明制備的單分散銀殼磁性微球用作SERS基底時，可快速富集溶液中目標(biāo)物，磁分離后可直接用于SERS檢測。特別適合于溶液體系中痕量物質(zhì)的檢測，包括農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染物、血清及組織液等的直接檢測。在化學(xué)、生物等有害物質(zhì)的檢測上顯示出巨大的應(yīng)用潛力，尤其是配合便攜式拉曼光譜儀在現(xiàn)場快速檢測領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為制備單分散銀殼磁性微球(Fe₃O₄@SiO₂@Ag)的實驗流程圖。

圖2為單分散銀殼磁性微球制備過程中各階段產(chǎn)物的透射電子顯微鏡圖(TEM)及最終產(chǎn)物的掃描電子顯微鏡圖(SEM)。

圖3為單分散銀殼磁性微球在SERS檢測中的應(yīng)用原理圖。

圖4為單分散銀殼磁性微球在SERS應(yīng)用中檢測小分子物質(zhì)對氨基苯硫酚(PATP)檢測的SERS圖譜。

圖5單分散銀殼磁性微球在SERS應(yīng)用中檢測硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥福美雙(thiram)檢測的SERS圖譜。

圖6為單分散銀殼磁性微球應(yīng)用于正常人及肝癌患者血清檢測的SERS圖譜。

圖7為單分散銀殼磁性微球應(yīng)用于未食用及食用了轉(zhuǎn)基因大米的猴血清檢測的SERS圖譜。

具體實施方式

以下實施將結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實施例1

一種單分散銀殼磁性微球的制備：

圖1給出單分散銀殼磁性微球的制備流程示意圖。其具體的制備方法分為以下五步：第一步，采用溶劑熱合成法合成400nm Fe₃O₄微球。取2.7g六水合三氯化鐵溶解在80ml乙二醇中，磁力攪拌30分鐘。接著，5.4g醋酸鈉和2g聚乙二醇6000加入到該溶液中并攪拌直至反應(yīng)物完全溶解，然后，將混合物轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)膽的高壓釜(100ml容量)中并加熱到200℃反應(yīng)10小時。將產(chǎn)物用磁鐵收集，分別用去離子水和乙醇各洗滌3次，最后將產(chǎn)物60℃真空干燥5h，得到400nm Fe₃O₄微球備用。

第二步，合成的400nm Fe₃O₄磁性微球表面以改進(jìn)的Stober法包覆厚度為50nm的SiO₂殼，形成單分散的Fe₃O₄@SiO₂微球。改進(jìn)的Stober法的反應(yīng)體系為200mL乙醇，10mL去粒子水，8mL濃氨水混合溶液體系，F(xiàn)e₃O₄微球質(zhì)量為20mg，正硅酸乙酯用量為200uL，超聲反應(yīng)40分鐘。反應(yīng)完成后磁富集產(chǎn)物，用去離子水洗五遍。

第三步，將50nm SiO₂殼包覆修飾的400nm Fe₃O₄微球(Fe₃O₄@SiO₂)與10mL 3％SnCl₂水溶液混合超聲反應(yīng)30分鐘，溶液中含100微升鹽酸防止SnCl₂水解。SiO₂殼敏化完成后表面吸附大量Sn²⁺離子。

第四步，敏化后的Fe₃O₄@SiO₂微球用化學(xué)鍍的方法實現(xiàn)表面核心化，利用吸附在SiO₂表面的Sn²⁺作還原劑，與濃度為300mM的銀氨溶液超聲反應(yīng)20分鐘，微球表面原位生成大量的銀種子，所形成的Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球保存于乙醇溶液中。

第五步，采用種子生長法將Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球還原成具有完整銀殼的銀殼磁珠(Fe₃O₄@SiO₂@Ag)。10mg Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球投入到200mLPVP水溶液中(1mg/mL)，超聲10分鐘使PVP充分吸附于Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球表面，依次加入5毫克硝酸銀、150微升甲醛溶液及300微升濃氨水，繼續(xù)超聲5分鐘可得銀殼完整、連續(xù)的銀殼磁珠(Fe₃O₄@SiO₂@Ag)。磁富集產(chǎn)物，去離子水洗5遍除去PVP，待用。

圖2(a)、(b)、(c)、(d)分別是400nm Fe₃O₄微球、Fe₃O₄@SiO₂微球、Fe₃O₄@SiO₂-Ag seed微球及Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球的透射電子顯微鏡圖(TEM)，圖2(e)為Fe₃O₄@SiO₂@Ag磁性微球的掃描電子顯微鏡圖(SEM)，標(biāo)尺為100nm。從透射電子顯微鏡圖中可見Fe₃O₄@SiO₂@Ag呈單分散狀態(tài)，未團(tuán)聚在一起，銀殼均一、連續(xù)。從掃描電子顯微鏡圖中可以清楚的看到銀殼由許多Ag納米顆粒堆積而成，顆粒之間具有納米級的縫隙與粗糙度。

實施例2

單分散銀殼磁性微球的SERS性能表征：

選用PATP作為拉曼分子對單分散銀殼磁性微球的SERS性能進(jìn)行表征。PATP是常用的巰基拉曼標(biāo)志物，與金或銀結(jié)合時會產(chǎn)生顯著的化學(xué)增強(qiáng)拉曼特征峰。將合成的銀殼磁性微球加入1ml濃度從10^-6-10^-11的PATP溶液中混合震蕩30分鐘，磁分離后將粒子濃縮液分散到干凈的硅片上，干燥后進(jìn)行拉曼檢測。圖3為單分散銀殼磁性微球在SERS檢測中的應(yīng)用原理圖。

圖4是實施例2的實驗結(jié)果。在圖4中橫坐標(biāo)是拉曼位移。圖4中曲線從上到下分別為高濃度到低濃度的PATP吸附在Fe₃O₄@SiO₂@Ag上激發(fā)的PATP拉曼圖譜。Fe₃O₄@SiO₂@Ag檢測出PATP的拉曼信號呈濃度依耐性，且當(dāng)PATP的濃度低至10^-11M其主要拉曼峰依舊可見。這一實驗結(jié)果表明：Fe₃O₄@SiO₂@Ag具有很強(qiáng)的表面拉曼增強(qiáng)能力，是可作為一種高性能的SERS基底。

實施例3

單分散銀殼磁性微球檢測溶液中的農(nóng)藥福美雙：

將單分散銀殼磁性微球加入到不同濃度的福美雙的水溶液中，超聲孵育15分鐘，磁富集粒子后直接用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行檢測。

圖5是實施例3的實驗結(jié)果。在圖5中，曲線a、b、c、d、e、f分別代表單分散銀殼磁性微球檢測濃度為10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8及10^-9M福美雙的拉曼圖譜，其中561、928、1145及1385cm^-1峰是福美雙的主要特征峰。該實驗結(jié)果顯示，單分散銀殼磁性微球檢測福美雙的檢測限為10^-9M，具有非常有效的表面增強(qiáng)拉曼功能。

實施例4

單分散銀殼磁性微球檢測正常人血清與肝癌患者血清的區(qū)別：

癌癥患者血清中含有多種癌癥標(biāo)志物及癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物，而正常人血清中沒有這些物質(zhì)。我們將正常人血清樣品及肝癌患者血清樣品與銀殼磁性微球混合后，震蕩孵育15分鐘，使血清與銀殼磁性微球充分接觸并吸附，富集粒子后直接用便攜式拉曼光譜儀進(jìn)行檢測。

圖6是實施例4的實驗結(jié)果。從圖6中可見，利用單分散銀殼磁性微球?qū)φＨ搜迮c肝癌患者血清檢測后得到差別很大的拉曼光譜結(jié)果，肝癌患者的血清的SERS圖譜顯示其含有多種正常人血清中沒有的特殊成分。該實驗結(jié)果表明單分散銀殼磁性微球可作為高效的SERS基底用于患者血清的檢測。

實施例5

單分散銀殼磁性微球檢測正常飼養(yǎng)的猴血清與食用轉(zhuǎn)基因大米的猴血清之間區(qū)別：

轉(zhuǎn)基因食品是否對人體有害目前仍沒有定論，我們采用單分散銀殼磁性微球作為SERS基底檢測了正常飼養(yǎng)的猴血清與食用轉(zhuǎn)基因大米的猴血清，驗證食用轉(zhuǎn)基因大米的猴子血清中 是否會產(chǎn)生特殊物質(zhì)。

圖7是實施例5的實驗結(jié)果。從圖7中可見，利用單分散銀殼磁性微球?qū)φｏ曫B(yǎng)的猴血清與食用轉(zhuǎn)基因大米的猴血清檢測后得到無明顯差別拉曼光譜結(jié)果。該實驗結(jié)果表明食用轉(zhuǎn)基因大米的猴子血清中未產(chǎn)生SERS信號明顯的特殊物質(zhì)。

上述實施例只為說明本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思和特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能依此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡根據(jù)本發(fā)明精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。