專利名稱：純化vwf以增加非-脂質(zhì)包封的病毒的去除的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
通常，本發(fā)明涉及純化VWF以增加非-脂質(zhì)包封的病毒的去除的方法。
背景技術(shù)：
Von Willebrand因子(VWF)以大小為約500至20，OOOkD的范圍的一系列多聚體在血漿中循環(huán)的糖蛋白。VWF的多聚體形式由通過二硫鍵連接在一起的250kD的多肽子單元構(gòu)成。VWF介導(dǎo)初始血小板粘附損壞的血管壁的內(nèi)皮下。只有較大的多聚體表現(xiàn)出止血活性。假設(shè)內(nèi)皮細胞分泌加大的聚合物形式的VWF，并且具有低分子量的那些形式(低分子量VWF)源自蛋白水解分裂。具有較大分子量的多聚體儲存在內(nèi)皮細胞的Weibel-Pallade 體中，并且在刺激時釋放。VffF由作為前原-VWF的內(nèi)皮細胞和巨核細胞合成，所述前原-VWF由較高程度的重復(fù)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。在信號肽分裂時，原-VWF通過其C-末端區(qū)域的二硫鍵連接而形成二聚體。 所述二聚體起到多聚化的原體的作用，其由游離末端之間的二硫鍵連接控制。裝配成多聚體后進行蛋白水解以除去前肽序列(Leyte et al.，Biochem. J. 274 (1991)，257-261)。從VWF的克隆cDNA預(yù)測的初級翻譯產(chǎn)物是2813-殘基前體多肽(前原-VWF)。前原-VWF由22個氨基酸信號肽和741個氨基酸前肽構(gòu)成，其中成熟VWF包含2050個氨基酸 (Ruggeri Ζ. A.，and Ware, J.，F(xiàn)ASEB J.，308—316 (1993))。VWF中的缺陷引起Von Willebrand病(VWD)，其特征在于或多或少顯著的出血顯型。3型VWD是最嚴重的形式，其中VWF完全缺失，并且1型VWD涉及VWF的定量損失，其顯型可以是非常溫和的。2型VWD涉及VWF的定性缺陷并且可以和3型VWD—樣嚴重。2型 VWD具有多種亞型形式，一些相關(guān)于高分子量多聚體的損失或減少。2a型Von Willebrand 綜合征(VWS-2A)的特征在于中間體和較大多聚體的損失。VWS-2B的特征在于最高分子量多聚體的損失。涉及VWF的其他疾病和病患是本領(lǐng)域已知的。來自治療蛋白溶液的非-脂質(zhì)包封的病毒的去除或失活傳統(tǒng)上通過使用物理方法處理來完成，例如高溫(例如，干燥加熱、蒸汽加熱、巴氏消毒法)、高能量射線的輻射(例如，紫外線(UV)射線或β輻射)、低ρΗ、納米過濾、或色譜法特別是親和色譜法。然而，當純化高分子量蛋白例如VWF時，這些方法通常是無效的，其不通過納米過濾器和/或在使用加熱或輻射處理時失去其效力或分子完整性。當前管理規(guī)范要求生產(chǎn)商提出減少和/或失活脂質(zhì)包封的和非_脂質(zhì)包封的病毒以用于重復(fù)藥物產(chǎn)品的問題。ICH" Guideline on Viral Safety Evaluations of Biotechnology Products" (Federal Register, 1998,63 (185) :51074_51084)提供生產(chǎn)商靈活性如何將病毒問題考慮到產(chǎn)品類型中、生產(chǎn)方法和潛在污染性病毒的風險。這些規(guī)范指出病毒污染的風險是源自細胞系的所有生物產(chǎn)品共有的特征。這種污染可具有嚴重的臨床后果，并且可源自源細胞系本身的污染(細胞底物)或源自生產(chǎn)中病毒的偶然引入。而脂質(zhì)-包封的病毒的失活可以通過溶劑/去污劑(S/D)處理方案非常有效地進行，因為它們較小尺寸和物理穩(wěn)定性，非-脂質(zhì)-包封的模型病毒(NLEV’ s)的失活或去除可能是挑戰(zhàn)性的。因此，本領(lǐng)域存在需要開發(fā)方法以在VWF純化的過程中有效地失活或去除非_脂質(zhì)包封的病毒。發(fā)明概述本發(fā)明提供純化VWF以增加非-脂質(zhì)包封的病毒的去除的有效方法。本發(fā)明提供通過下列步驟純化VWF以增加NLEV' s的去除的新型方法進行產(chǎn)物負載步驟；以及在較高pH下純化方法的洗滌步驟。本領(lǐng)域已知的從NLEV' s純化多肽的一種方法涉及使用納米過濾。使用納米過濾有效地分離蛋白和病毒中的原理利用了多肽和病毒之間的尺寸差異；有效的分離要求多肽的有效尺寸小于病毒，這允許多肽通過納米過濾器的孔，而病毒得以保留。然而，如果多肽和病毒相對于彼此具有相當?shù)某叽纾驗槎嚯暮筒《径纪ㄟ^納米過濾器的孔或都通不過， 因此分離是有問題的。本文公開的方法通過下列方式克服了該問題使用陽離子交換樹脂而不是納米過濾，并且在足夠高的PH下負載和/或洗滌樹脂以從病毒中分離多肽。不受到理論的束縛，本文公開的方法可用于從多肽溶液中改善地去除NLEV，其中多肽具有某種尺寸和/或形態(tài)。足夠大的多肽在多肽的等電點或更高點處可能具有局部帶電特性，即，多肽的區(qū)域可以保持局部正電荷或負電荷，從而允許多肽吸附至柱樹脂，而病毒則通過樹脂。盡管在該PH下進行樹脂的負載和/或洗滌，但是在多肽長度上該不均勻的電荷分布允許多肽保持附接至樹脂。本發(fā)明提供從含蛋白的溶液在去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括使溶液中的蛋白負載到陽離子交換樹脂上；以及在高于蛋白的等電點的PH下使用緩沖液洗滌樹脂， 以洗脫病毒。在一個方面中，在高于蛋白的等電點的PH下，緩沖液中的蛋白負載到樹脂上以洗脫病毒。在另一方面中，緩沖液(不是洗滌步驟中使用的緩沖液)中的蛋白負載到樹脂上，隨后在高于蛋白的等電點的PH下使用緩沖液洗滌樹脂。在一個實施方案中，提供一種從含蛋白的溶液中去除非_脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；以及使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗滌緩沖液的PH等于或小于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的pH。在一個方面中，溶液的PH比蛋白的等電點高約1個PH單位。在其他方面中，溶液的PH比蛋白的等電點高約1. 1，或約1. 2，或約1. 3，或約1. 4，或約1. 5，或約1. 6，或約1. 7， 或約1. 8，或約1. 9，或約2. 0，或約2. 1，或約2. 2，或約2. 3，或約2. 4，或約2. 5，或約2. 6，或約2. 7，或約2. 8，或約2. 9，或約3. 0，或約3. 1，或約3. 2，或約3. 3，或約3. 4，或約3. 5，或約3. 6，或約3. 7，或約3. 8，或約3. 9，或約4. 0，或約4. 1，或約4. 2，或約4. 3，或約4. 4，或約4. 5，或約4. 6，或約4. 7，或約4. 8，或約4. 9，或約5. 0,或約5. 1，或約5. 2，或約5. 3，或約 5. 4，或約5. 5，或約5. 6，或約5. 7，或約5. 8，或約5. 9，或約6. 0或更多個pH單位、或更高。 在這些實施方案中，PH大于約7。在相關(guān)的方面中，含蛋白的溶液的pH為約7.0。在其他方面中，含蛋白的溶液的PH為約7. 1，或約7. 2，或約7. 3，或約7. 4，或約7. 5，或約7. 6，或約7. 7，或約7. 8，或約7. 9，或約8. 0，或約8. 1，或約8. 2，或約8. 3，或約8. 4，或約8. 5，或約8. 6，或約8. 7，或約8. 8，或約8. 9，或約9. 0，或約9. 1，或約9. 2，或約9. 3，或約9. 4，或約9. 5，或約9. 6，或約9. 7，或約9. 8，或約9. 9，或約10. 0,或約10. 1，或約10. 2，或約10. 3， 或約10. 4，或約10. 5，或約10. 6，或約10. 7，或約10. 8，或約10. 9，或約11.0，或約11. 1，或約11. 2，或約11. 3，或約11. 4，或約11. 5，或約11. 6，或約11. 7，或約11. 8，或約11. 9，或約12. 0，或約12. 1，或約12. 2，或約12. 3，或約12. 4，或約12. 5，或約12. 6，或約12. 7，或約 12. 8，或約12. 9，或約13. 0或更高。在另一實施方案中，提供一種從含蛋白的溶液中去除非_脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；在高于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH的pH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。在一個方面中，第一洗滌緩沖液的pH比施加至陽離子交換樹脂的溶液的pH高約1個pH單位。在其他方面中，第一洗滌緩沖液的pH比蛋白的等電點高約0. 1，或約0. 2， 或約0.3，或約0.4，或約0.5，或約0.6，或約0.7，或約0.8，或約0.9，或約1. 1，或約1.2， 或約1.3，或約1.4，或約1.5，或約1.6，或約1.7，或約1.8，或約1. 9，或約2. 0，或約2. 1， 或約2. 2，或約2. 3，或約2. 4，或約2. 5，或約2. 6，或約2. 7，或約2. 8，或約2. 9，或約3. 0， 或約3. 1，或約3. 2，或約3. 3，或約3. 4，或約3. 5，或約3. 6，或約3. 7，或約3. 8，或約3. 9， 或約4. 0，或約4. 1，或約4. 2，或約4. 3，或約4. 4，或約4. 5，或約4. 6，或約4. 7，或約4. 8， 或約4. 9，或約5. 0，或約5. 1，或約5. 2，或約5. 3，或約5. 4，或約5. 5，或約5. 6，或約5. 7，或約5. 8，或約5. 9，或約6. 0，或約6. 1，或約6. 2，或約6. 3，或約6. 4，或約6. 5，或約6. 6，或約
6.7，或約6. 8.或約6. 9，或約7. 0，或約7. 1，或約7. 2，或約7. 3，或約7. 4，或約7. 5，或約
7.6，或約7. 7，或約7. 8，或約7. 9，或約8或約8. 1，或約8. 2，或約8. 3，或約8. 4，或約8. 5， 或約8. 6，或約8. 7，或約8. 8，或約8. 9，或約9，或約9. 1，或約9. 2，或約9. 3，或約9. 4，或約9. 5，或約9. 6，或約9. 7，或約9. 8，或約9. 9，或約10或更大pH單位、或更高。在這些實施方案中，第一洗滌緩沖液的PH大于約7。在其他方面中，第一洗滌緩沖液的pH為約7. 1， 或約7. 2，或約7. 3，或約7. 4，或約7. 5，或約7. 6，或約7. 7，或約7. 8，或約7. 9，或約8. 0，或約8. 1，或約8. 2，或約8. 3，或約8. 4，或約8. 5，或約8. 6，或約8. 7，或約8. 8，或約8. 9，或約9. 0，或約9. 1，或約9. 2，或約9. 3，或約9. 4，或約9. 5，或約9. 6，或約9. 7，或約9. 8，或約9. 9，或約10.0，或約10. 1，或約10. 2，或約10. 3，或約10. 4，或約10. 5，或約10. 6，或約 10. 7，或約10. 8，或約10. 9，或約11.0或更高.在實施方案中，溶液中的蛋白是分子量為至少約150千道爾頓的多肽。在各種方面中，溶液中的蛋白是下列分子量的多肽至少約175千道爾頓，或約180千道爾頓，或約 190千道爾頓，或約200千道爾頓，或約210千道爾頓，或約220千道爾頓，或約230千道爾頓，或約240千道爾頓，或約250千道爾頓，或約260千道爾頓，或約270千道爾頓，或約280 千道爾頓，或約290千道爾頓，或約300千道爾頓，或約310千道爾頓，或約320千道爾頓， 或約330千道爾頓，或約340千道爾頓，或約350千道爾頓，或約360千道爾頓，或約370千道爾頓，或約380千道爾頓，或約390千道爾頓，或約400千道爾頓，或約410千道爾頓，或約420千道爾頓，或約430千道爾頓，或約440千道爾頓，或約450千道爾頓，或約460千道爾頓，或約470千道爾頓，或約480千道爾頓，或約490千道爾頓，或約500千道爾頓或更高。如本文所述，多肽還包含多聚體結(jié)構(gòu)，在各種方面中，這種多聚體結(jié)構(gòu)的分子量為至少約500千道爾頓。在相關(guān)方面中，多聚體結(jié)構(gòu)的分子量為至少約510，或約520，或約530， 或約540，或約550，或約560，或約570，或約580，或約590，或約600，或約610，或約620， 或約630，或約640，或約650，或約660，或約670，或約680，或約690，或約700，或約710， 或約720，或約730，或約740，或約750，或約760，或約770，或約780，或約790，或約800， 或約810，或約820，或約830，或約840，或約850，或約860，或約870，或約880，或約890， 或約900，或約910，或約920，或約930，或約940，或約950，或約960，或約970，或約980， 或約990千道爾頓，或約1兆道爾頓，或約1. 1兆道爾頓，或約1. 2兆道爾頓，或約1. 3兆道爾頓，或約1. 4兆道爾頓，或約1. 5兆道爾頓，或約1. 6兆道爾頓，或約1. 7兆道爾頓，或約 1. 8兆道爾頓，或約1. 9兆道爾頓，或約2. 0兆道爾頓，或約2. 1兆道爾頓，或約2. 2兆道爾頓，或約2. 3兆道爾頓，或約2. 4兆道爾頓，或約2. 5兆道爾頓，或約2. 6兆道爾頓，或約2. 7 兆道爾頓，或約2. 8兆道爾頓，或約2. 9兆道爾頓，或約3. 0兆道爾頓，或約3. 1兆道爾頓， 或約3. 2兆道爾頓，或約3. 3兆道爾頓，或約3. 4兆道爾頓，或約3. 5兆道爾頓，或約3. 6兆道爾頓，或約3. 7兆道爾頓，或約3. 8兆道爾頓，或約3. 9兆道爾頓，或約4. 0兆道爾頓，或約4. 1兆道爾頓，或約4. 2兆道爾頓，或約4. 3兆道爾頓，或約4. 4兆道爾頓，或約4. 5兆道爾頓，或約4. 6兆道爾頓，或約4. 7兆道爾頓，或約4. 8兆道爾頓，或約4. 9兆道爾頓，或約 5.0兆道爾頓或更高。在一些實施方案中，陽離子交換樹脂具有選自羧甲基(CM)、磺基烷基(SP，SE)、硫酸酯和甲基磺酸根(S)以及任何其他帶負電荷的配體的帶負電荷基團。在進一步實施方案中，蛋白是凝血蛋白。在各種方面中，凝血蛋白選自因子 VIII，Vonffillebrand因子，F(xiàn)I (血纖蛋白原)，F(xiàn)V(促凝血球蛋白原)，F(xiàn)XI (血漿-凝血激酶前質(zhì))和FXIII (血纖蛋白穩(wěn)定因子)。在實施方案中，提供一種從含von Willebrand(VWF)的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；以及使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗滌緩沖液的PH等于或小于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的pH。在另一實施方案中，提供一種從含VWF的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法， 包括將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；在高于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH 的PH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH等于或小于所述第一洗滌緩沖液的pH。在進一步實施方案中，提供一種從含VWF的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；和在高于施加至所述陽離子交換樹脂的蛋白的等電點的PH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH等于或小于所述第一洗滌緩沖液的pH。附圖簡述

圖1示出SDS-PAGE分離、然后進行銀染色法(A)和剩余rFVIII的蛋白質(zhì)印跡法(B)分析的結(jié)果。圖2示出使用MMV和REO病毒摻加的樣品進行UNO S實驗的染色的凝膠。圖3示出使用MMV和REO病毒摻加的樣品進行UNO S實驗的染色的凝膠。圖4示出下列結(jié)果使通過方法變化形式獲得的rVWF的純化制劑在天然狀態(tài)下通過V8蛋白酶經(jīng)歷蛋白水解消化，然后通過RP-HPLC分離所得肽。圖5示出下列結(jié)果使通過方法變化形式獲得的rVWF的純化制劑在變性狀態(tài)下經(jīng)歷胰蛋白酶，然后通過RP-HPLC分離所得肽。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在非-脂質(zhì)包封的病毒的去除增加的條件下純化VWF的方法。本發(fā)明的方法適用于柱(即，色譜法)以及成批(即，沒有柱硬件)方式。本發(fā)明的方法使用在陽離子交換樹脂上純化的方法以增加非-脂質(zhì)包封的病毒的去除。使用陽離子交換色譜法純化VWF的之前方法在中性pH下進行。這些方法允許制備良好收率和純度的純化的WF，但吃驚地，所述方法沒有去除非_脂質(zhì)包封的病毒的能力。術(shù)語定義除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有和本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解相同的意思。下列參考文獻賦予熟練技術(shù)人員本發(fā)明中使用的多種術(shù)語的通常定義Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(2d ed. 1994) ；THE CAMBRIDGE DICTIONARY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY(Walker ed. ,1988) ；THE GLOSSARY OF GENETICS,5TH ED. , R. Rieger, et al. (eds.)，Springer Verlag(1991)；和Hale and Marham,THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY(1991)。本文引用的各公開文獻、專利申請、專利和其他參考文獻在和本公開一致的程度上通過引用的方式全部并入。如本申請和所附權(quán)利要求書中使用的，除非上下文明確地指示，否則此處注意單數(shù)形式〃 a，‘‘ “ an"和〃 the"包括復(fù)數(shù)形式。如本文使用的，除非明確地說明，下列術(shù)語具有歸于它們的意思。如本文使用的，術(shù)語表達(〃 express, “ ‘‘ expressing"禾口〃 expression")是指允許或引起基因或DNA序列中的信息變得明顯，例如，通過激活涉及對應(yīng)的基因或DNA序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的細胞功能來產(chǎn)生蛋白。DNA序列在細胞中或通過細胞表達以形成"表達產(chǎn)物"，例如蛋白。表達產(chǎn)物本身(例如所得蛋白)也可以稱為是"表達的"。表達產(chǎn)物可以表征為細胞內(nèi)、細胞外或分泌的。術(shù)語"細胞內(nèi)"是指在細胞內(nèi)部。術(shù)語"細胞外" 是指在細胞外部，例如，某些類型的跨膜蛋白。如果其以顯著量度在細胞外部、來自細胞上的某處或在細胞內(nèi)部，則該物質(zhì)是被細胞"分泌的"。如本文使用的，“多肽"是指這樣的聚合物，其由氨基酸殘基、結(jié)構(gòu)變體、相關(guān)天然存在的結(jié)構(gòu)變體、及其通過肽鍵連接的合成非-天然存在的類似物構(gòu)成。合成多肽可以例如使用自動的多肽合成器來制備。術(shù)語"蛋白"典型地是指較大多肽。術(shù)語"肽"典型地是指較短多肽。術(shù)語"多肽"還包括聚合物結(jié)構(gòu)。因此，“多肽"可以是單體、二聚體、 三聚體或較大多聚體結(jié)構(gòu)。這些多聚體結(jié)構(gòu)可以為至多5兆道爾頓或更高。如本文使用的，“等電點"是PH值，在該pH值下水溶液中的多肽的凈電荷為零。如本文使用的，多肽的"片段"是指比全長多肽或蛋白表達產(chǎn)物小的多肽或蛋白的任何部分。如本文使用的，“類似物”是指兩種或多種多肽中的任一種，其和整個分子或其片段具有基本上類似的結(jié)構(gòu)和相同的生物活性，但是可以具有改變的活性程度。基于涉及一個或多個氨基酸被其他氨基酸取代的一個或多個突變，類似物的它們氨基酸序列組成不同?；诒蝗〈暮桶被崛〈陌被岬奈锢?化學或官能團關(guān)系，取代可以是保守的或非保守的。如本文使用的，“變體"是指被修飾以包含通常不是分子的一部分的另外化學部分的多肽、蛋白或它們的類似物。這些部分可以調(diào)節(jié)分子的溶解度、吸收性、生物半衰期等。 或者所述部分可以降低分子的毒性并且消除或減弱分子的任何不期望的副作用等。能夠介導(dǎo)這些效果的部分公開于Remington' s Pharmaceutical Sciences (1980)。使這些部分偶聯(lián)分子的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，變體可以是具有賦予蛋白更長體內(nèi)半衰期的化學修飾的凝血因子。在各種方面中，多肽通過糖基化、聚乙二醇化和/或聚唾液酸化。重組VWF前原-VWF的多核苷酸和氨基酸序列分別闡述在SEQ ID NO 1和SEQ ID NO :2中， 并且可分別以GenBank登陸No. NM_000552和NP_000543得到。對應(yīng)于成熟VWF蛋白的氨基酸序列闡述在SEQ ID NO :3(對應(yīng)于全長前原-VWF氨基酸序列的氨基酸764-2813)。一種形式的有用rVWF具有至少體內(nèi)穩(wěn)定性的性質(zhì)，例如結(jié)合至少一種因子 VIII (FVIII)分子并且任選地具有藥理學上可接受的糖基化圖案。其特定例子包括不具有 A2 結(jié)構(gòu)域的 WF,因此耐受蛋白水解(Lankhof et al.，Thromb. Haemost. 77 :1008_1013， 1997)，并且來自Val 449至Asn 730的VWF片段包括用于膠原和肝素的糖蛋白Ib-結(jié)合結(jié)構(gòu)域和結(jié)合位點(Pietu et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 164 1339—1347，1989)。 VWF穩(wěn)定至少一種FVIII分子的能力的確定可以根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法在 VWF-缺陷哺乳動物中進行。本發(fā)明的rVWF可以通過本領(lǐng)域任何已知的方法來制備。一種具體例子公開于1986年10月23日公開的W086/06096和1990年7月23日提交的美國專利申請 No. 07/559，509，涉及制備重組VWF的方法通過引用并入本文。因此，下列方法是本領(lǐng)域已知的(i)通過基因工程化來產(chǎn)生重組DNA，例如通過RNA的反向轉(zhuǎn)錄和/或DNA的擴增； ( )通過轉(zhuǎn)染將重復(fù)DNA引入原核細胞或真核細胞，例如通過電穿孔或微注射；(iii)例如以連續(xù)或分批的方式來培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染的細胞；(iv)例如構(gòu)成地或在誘導(dǎo)時表達VWF ；以及 (ν)例如從培養(yǎng)基或通過收獲轉(zhuǎn)化的細胞來分離所述VWF，以(vi)例如通過陰離子交換色譜法或親和色譜法來獲得純化的rVWF。重組VWF可以使用本領(lǐng)域熟知的重組DNA技術(shù)在轉(zhuǎn)化的宿主細胞中制備。例如，編碼多肽的序列可以使用合適的限制性內(nèi)切酶從DNA中切除。或者，DNA分子可以使用化學合成技術(shù)來合成，例如氨基磷酸酯法。此外，可以使用這些技術(shù)的組合。本發(fā)明還提供在合適宿主中編碼本發(fā)明的多肽的載體。所述載體包含多核苷酸， 所述多核苷酸編碼操作性地連接合適的表達控制序列的多肽。在多核苷酸插入載體之前或之后，實現(xiàn)該操作性的連接的方法是熟知的。表達控制序列包括啟動子、活化劑、增強子、操作子、核糖體結(jié)合位點、起始信號、停止信號、封蓋信號、多腺苷酸化信號、和涉及轉(zhuǎn)錄或翻譯的控制的其他信號。其中具有多核苷酸的所得載體用于轉(zhuǎn)化合適的宿主。該轉(zhuǎn)化可以使用本領(lǐng)域熟知的方法來進行。多數(shù)可得和熟知的宿主細胞中的任一種可以用于實施本發(fā)明。特定宿主的選擇取決于本領(lǐng)域識別的多種因素，包括例如和選擇的表達載體的相容性、DNA分子編碼的肽的毒性、轉(zhuǎn)化率、回收肽的難易程度、表達特性、生物安全性和成本。必須在理解并非所有宿主細胞相等地有效表達特定DNA序列的條件下觸發(fā)這些因素的平衡。在這些通常規(guī)范內(nèi)，有用的微生物宿主細胞包括細菌、酵母菌和其他真菌、昆蟲、植物、培養(yǎng)基中的哺乳動物(包括人)細胞、或本領(lǐng)域已知的其他宿主。然后，將轉(zhuǎn)化的宿主培養(yǎng)和純化。宿主細胞可以在常規(guī)發(fā)酵條件下培養(yǎng)，使得期望化合物得以表達。這些發(fā)酵條件是本領(lǐng)域熟知的。最后，多肽通過本領(lǐng)域熟知的方法從培養(yǎng)物中純化。取決于用于表達本發(fā)明的化合物的宿主細胞，碳水化合物(寡糖)基團可以便捷地附接在蛋白中已知是糖基化位點的位點。通常當它們是序列Asn-X-Ser/Thr的部分時，0-連接的寡糖附接絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基，而N-連接的寡糖附接天冬酰胺 (Asn)殘基，其中X可以是除了脯氨酸的任何氨基酸。X優(yōu)選是不包括脯氨酸的19種天然存在的氨基酸中的一種。各種類型中發(fā)現(xiàn)的N-連接的和0-連接的寡糖與糖殘基的結(jié)構(gòu)是不同的。通常在兩者上發(fā)現(xiàn)的一種類型的糖是N-乙?；窠?jīng)氨糖酸(稱為唾液酸)。唾液酸通常是N-連接的和0-連接的寡糖的末端殘基，并且通過其負電荷可以賦予糖基化的化合物酸性屬性。這些位點可以引入本發(fā)明的化合物的接頭中，并且在多肽化合物(例如，在哺乳動物細胞例如CHO，BHK，COS中)的重組制備的過程中優(yōu)選被細胞糖基化。然而，這些位點可以進一步通過本領(lǐng)域已知的合成或半合成方法來糖基化。或者，化合物可以通過合成方法來制備。例如，可以使用固相合成技術(shù)。合適的技術(shù)是本領(lǐng)域熟知的，并且包括Merrifield(1973)，Chem. Polypeptides, pp.335-61 (Katsoyannis and Panayotis eds.) ；Merrifield(1963), J. Am.Chem. Soc. 85 2149 ；Davis et al. (1985), Biochem. Intl. 10 394-414 ；Stewart and Young(1969), Solid Phase Peptide Synthesis ；美國專利 No. 3，941，763 ；Finn et al. (1976)，The Proteins(3rd ed.)2 :105—253 ；禾口 Erickson et al. (1976)，The Proteins(3rd ed.)2 257-527中所述。固相合成是制備各種肽的優(yōu)選技術(shù)，因為其是制備小肽的最成本有效的方法。VffF的片段、變體和類似物制備多肽的片段、變體或類似物的方法是本領(lǐng)域熟知的。多肽片段使用但不限于酶切除(例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)來制備，還使用重組方式來產(chǎn)生具有特定氨基酸序列的多肽片段?？梢援a(chǎn)生多肽片段，包含具有特定活性的蛋白的區(qū)域，例如多聚化結(jié)構(gòu)域或本領(lǐng)域已知的任何其他可鑒別的VWF結(jié)構(gòu)域。多肽變體涵蓋包括人和非人形式的VWF(例如，鼠源VWF)。本文方法還涵蓋包含例如鼠/人融合多肽的嵌合多肽。制備多肽類類似物的方法也是熟知的。多肽的氨基酸序列類似物可以是取代的、 插入的、增加的或缺失的類似物。缺失類似物(包括多肽片段)缺乏對于官能或免疫原活性非必需的天然蛋白的一種或多種殘基。插入類似物涉及在多肽的非-末端點處增加例如氨基酸。該類似物可包括插入免疫反應(yīng)性抗原決定基或簡單地插入單一參加。增加類似物(包括多肽片段)包括在蛋白(例如融合蛋白)的兩個末端的任一個處增加一個或多個氨基酸。取代類似物典型地在蛋白的一個或多個位點處交換野生型的一個氨基酸和另一個，并且可設(shè)計以調(diào)節(jié)多肽的一種或多種性能，而不損失其他官能或性能。在一個方面中， 取代是保守取代?！氨Ｊ匕被崛〈?是指氨基酸被具有類型化學特性的側(cè)鏈的氨基酸取代。制備保守取代的類似氨基酸包括具有下列的那些酸性側(cè)鏈(谷氨酸，天冬氨酸)；堿性側(cè)鏈(精氨酸，賴氨酸，組氨酸)；極性酰胺側(cè)鏈(谷氨酸，天冬酰胺)；疏水性脂肪族側(cè)鏈 (亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，甘氨酸)；芳族側(cè)鏈(苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸)；小側(cè)鏈(甘氨酸，丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，蛋氨酸)；或脂肪族羥基側(cè)鏈(絲氨酸，蘇氨酸)。類似物可以和它們衍生的重組VWF基本上同源或基本上相同的。優(yōu)選的類似物是保留至少一些野生型多肽的生物活性(例如凝血活性)的那些。多肽變體涵蓋包括通過這樣的技術(shù)化學修飾的多肽，所述技術(shù)例如為遍在蛋白化、糖基化包括聚唾液酸化、綴合治療劑或診斷劑、標記、共價聚合物附接例如聚乙二醇化 (使用聚乙二醇衍生化)、引入不可水解的鍵、和通過通常不存在于人蛋白中的氨基酸例如鳥氨酸的化學合成來插入或取代。變體保留本發(fā)明的非修飾的分子的相同或基本上相同的結(jié)合性能。這些化學修飾可包括直接或間接(例如通過接頭)附接試劑至VWF多肽。在間接附接的情況下，涵蓋接頭可以是可水解的或不可水解的。制備聚乙二醇化多肽類似物通常包括下列步驟(a)在條件下使多肽和聚乙二醇 (例如PEG的反應(yīng)性酯或醛衍生物)反應(yīng)，從而結(jié)合構(gòu)建體多肽附接一個或多個PEG基團； 以及(b)獲得反應(yīng)產(chǎn)物。通常，醛化反應(yīng)的最優(yōu)反應(yīng)條件基于已知的參數(shù)和期望結(jié)果來確定。例如，PEG 蛋白的比越高，聚-聚乙二醇化產(chǎn)物的百分率越高。在一些實施方案中，結(jié)合構(gòu)建體在N-末端處具有單一 PEG部分。聚乙二醇(PEG)可以附接凝血因子以提供體內(nèi)更長半衰期。PEG基團可以具有任何便捷的分子量，并且可以是直鏈或支鏈的。PEG的平均分子量為約2千道爾頓(〃 kD〃 )至約100kDaJ々 5kDa至約50kDa、或約5kDa至約lOkDa。 PEG基團通過醛化或還原性烷基化經(jīng)過PEG部分上的中性或工程化反應(yīng)性基團(例如，醛、 氨基、硫醇或酯基)至凝血因子上的反應(yīng)性基團(例如，醛、氨基或酯基)而附接凝血因子， 或通過本領(lǐng)域已知的任何其他技術(shù)。制備聚唾液酸化的多肽的方法在美國專利公開20060160948，F(xiàn)emandes et Gregoriadis ；Biochim. Biophys. Acta 1341 :26_34,1997 禾口 Saenko et al., Haemophilia 12 =42-51,2006中有所描述。簡言之，將含有0. IM NaI04的多聚乙酰神經(jīng)氨糖酸溶液在室溫下在暗處攪拌以氧化CA。將激活的CA溶液針對例如0.05M磷酸鈉緩沖液(pH 7. 2)在暗處透析，并且將該溶液加入rVWF溶液，并且在室溫下在暗處在溫和振蕩的條件下孵育18h。 然后可以通過超濾/滲濾從rVWF-聚唾液酸綴合物分離游離試劑。rVWF和聚唾液酸的綴合還可以使用戊二醛作為交聯(lián)劑來完成(Migneault et al. ,Biotechniques 37:790-796， 2004)。還涵蓋的是本發(fā)明的多肽可以是和第二試劑(其是多肽)的融合蛋白。在一個實施方案中，第二試劑(其是多肽)不限于酶、生長因子、抗體、細胞因子、趨化因子、細胞-表面受體、細胞表面受體的細胞外結(jié)構(gòu)域、細胞粘附分子、或上述蛋白的片段或活性結(jié)構(gòu)域。 在相關(guān)的實施方案中，第二試劑是凝血因子，例如因子VIII、因子VII、因子IX。涵蓋的融合蛋白通過本領(lǐng)域熟知的化學或重組技術(shù)來制備。還涵蓋，前原-VWF和原-VWF多肽可以在本發(fā)明的制劑中提供治療益處。例如，美國專利No. 7，005，502描述藥物制劑，包含體外在存在血小板的條件下誘導(dǎo)凝血產(chǎn)生的實質(zhì)量的原-VWF。除了天然存在的成熟VWF的重組生物活性片段、變體或類似物，本發(fā)明涵蓋前原-VWF的重組生物活性片段、變體或類似物(闡述于SEQ ID NO 2)或原-VWF多肽的重組生物活性片段、變體或類似物(SEQ ID NO :2的氨基酸殘基23至764)在本文所述制劑中的應(yīng)用。編碼片段、變體和類似物的多核苷酸可以由熟練技術(shù)人員容易地產(chǎn)生，以編碼具有和天然存在的分子相同或類似生物活性的天然存在的分子的生物活性片段、變體或類似物。這些多核苷酸可以使用PCR技術(shù)、DNA編碼分子的消化/連接等來制備。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能夠使用本領(lǐng)域已知的任何方法(包括但不限于位點_特異性突變)在DNA鏈中產(chǎn)生單一堿基改變，以導(dǎo)致改變的密碼子和錯義突變。如本文使用的，措詞"中等嚴格雜交條件〃例如是指在42°C下在50%甲酰胺中雜交，并且在60°C下在0. Ix SSC，0. 1 % SDS中洗滌。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，基于待雜交的序列的長度和GC核苷酸堿基含量，這些條件發(fā)生改變。本領(lǐng)域中的公式標準適于確定精確的雜交條件。參見Sambrook et al.，9. 47-9. 51， Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(1989)。VffF的制備方法工業(yè)上，VWF、特別是人重組VWF(rVWF)合成并且在基因工程化的CHO細胞系中和 rFVIII—起表達。共表達的rVWF的功能是在細胞培養(yǎng)過程中穩(wěn)定rFVIII。rVWF在細胞中合成為原型，含有附接N-末端的較大原-肽。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和Golgi設(shè)備中成熟時，通過細胞蛋白酶弗林蛋白酶的作用，原-肽切除，并且分泌為相同子單元的均聚物，由表達的蛋白的二聚體構(gòu)成。VffF的純化本文提供一種從含蛋白的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；以及使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗滌緩沖液的PH等于或小于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH。在一個方面中，溶液的pH比蛋白的等電點高約1個pH單位。在其他方面中，溶液的PH比蛋白的等電點高約1. 2，或約1. 4，或約1. 6，或約1. 8，或約2. 0，或約2. 2，或約2. 4， 或約2. 6，或約2. 8，或約3. 0,或約3. 2，或約3. 4，或約3. 6，或約3. 8，或約4. 0,或約4. 2，或約4. 4，或約4. 6，或約4. 8，或約5. 0,或約5. 5，或約6. 0個pH單位或更高。在這些實施方案中，pH大于約7。在其他方面中，pH為約7. 1，或約7. 2，或約7. 3， 或約7. 4，或約7. 5，或約7. 6，或約7. 7，或約7. 8，或約7. 9，或約8. 0,或約8. 1，或約8. 2， 或約8. 3，或約8. 4，或約8. 5，或約8. 6，或約8. 7，或約8. 8，或約8. 9，或約9. 0，或約9. 1， 或約9. 2，或約9. 3，或約9. 4，或約9. 5，或約9. 6，或約9. 7，或約9. 8，或約9. 9，或約10. 0， 或約10. 1，或約10. 2，或約10. 3，或約10. 4，或約10. 5，或約10. 6，或約10. 7，或約10. 8，或約10. 9，或約11.0，或約11. 1，或約11. 2，或約11. 3，或約11. 4，或約11. 5，或約11. 6，或約11. 7，或約11. 8，或約11. 9，或約12. 0，或約12. 1，或約12. 2，或約12. 3，或約12. 4，或約12. 5，或約12. 6，或約12. 7，或約12. 8，或約12. 9，或約13. 0或更高。在另一實施方案中，提供一種從含蛋白的溶液中去除非_脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；在高于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH的pH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第二洗滌緩沖液的PH等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。在一個方面中，第一洗滌緩沖液的pH比施加至陽離子交換樹脂的溶液的PH高約1個pH單位。對于該階段，涵蓋的是，離子交換介質(zhì)是UNOsphere S (BioRad Laboratories, Inc.，Hercules, CA)，但是在實施所述方法時可以使用其他陽離子交換體系。這些陽離子交換體系是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在其他方面中，第一洗滌緩沖液的pH比蛋白的等電點高約1. 1，或約1.2，或約 1.3，或約1.4，或約1.5，或約1.6，或約1.7，或約1.8，或約1. 9，或約2. 0，或約2. 1，或約
2.2，或約2. 3，或約2. 4，或約2. 5，或約2. 6，或約2. 7，或約2. 8，或約2. 9，或約3. 0，或約
3.1，或約3. 2，或約3. 3，或約3. 4，或約3. 5，或約3. 6，或約3. 7，或約3. 8，或約3. 9，或約
4.0，或約4. 1，或約4. 2，或約4. 3，或約4. 4，或約4. 5，或約4. 6，或約4. 7，或約4. 8，或約
4.9，或約5. 0，或約5. 1，或約5. 2，或約5. 3，或約5. 4，或約5. 5，或約5. 6，或約5. 7，或約
5.8，或約5. 9，或約6. 0個pH單位或更高。在這些實施方案中，第一洗滌緩沖液的pH大于約 7。在其他方面中，第一洗滌緩沖液的pH為約7. 1，或約7. 2，或約7. 3，或約7. 4，或約7. 5， 或約7. 6，或約7. 7，或約7. 8，或約7. 9，或約8. 0，或約8. 1，或約8. 2，或約8. 3，或約8. 4，或約8. 5，或約8. 6，或約8. 7，或約8. 8，或約8. 9，或約9. 0,或約9. 1，或約9. 2，或約9. 3，或約9. 4，或約9. 5，或約9. 6，或約9. 7，或約9. 8，或約9. 9，或約10. 0，或約10. 1，或約10.2， 或約10. 3，或約10. 4，或約10. 5，或約10. 6，或約10. 7，或約10. 8，或約10. 9，或約11.0，或約11. 1，或約11. 2，或約11. 3，或約11. 4，或約11. 5，或約11. 6，或約11. 7，或約11. 8，或約11. 9，或約12. 0，或約12. 1，或約12. 2，或約12. 3，或約12. 4，或約12. 5，或約12. 6，或約 12. 7，或約12. 8，或約12. 9，或約13. 0或更高。下列實施例不旨在是限制性的，而僅僅是本發(fā)明的特定實施方案的例子。 實施例實施例1下文所述測定中使用的病毒和細胞如下RE0-3 (呼腸孤病毒科；非-包封的dsRNA病毒)，菌株Dearing (ATCC VR-824)得自 ATCC0病毒在得自ECACC(84113001)的Vero細胞上繁殖和滴定。MMV(細小病毒科；非-包封的ssDNA病毒)，原型菌株(ATCC VR-1346)，得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockville, Maryland。病毒在A9細胞(ATCC CCL-1. 4)上繁殖和滴定。PPV(細小病毒科；非-包封的 ssDNA 病毒)、菌株 Tennessee (BRFF#PP951024)得自 Biological Research Faculty & Facility, Ijamsville, Maryland。病毒在 PK-13 細胞(ATCC CRL-6489)上繁殖和滴定。 EMCV(小核糧核酸病毒科；非-包封的ssRNA) (ATCC #VR-129B)得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。病毒在 Vero 細胞(European Collection of Cell Cultures,ECACC, #84113001)上繁殖和滴定。HadV(腺病毒科；非-包封的dsDNA)，菌株Adenoid 75 (ATCC VR-5)，得自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。病毒在HeLa細胞(ATCC CCL-2)上繁殖和滴定。
涉及示例性VWF純化方法的步驟包括 細胞培養(yǎng)基上清的免疫親和色譜法i.流通餾分 陰離子交換(例如，三甲基氨基乙基陰離子交換柱) 過濾(0. 45/0. 2 μ m) 陰離子交換(例如，Mustang Q(Pall Corporation)) 病毒滅活(例如，使用溶劑/去污劑處理) 過濾(0. 8/0. 65 μ m)·陽離子交換(例如，UNO S柱) 超濾/濃縮 過濾(0. 45/0. 2 μ m) 凝膠過濾(Superose 6 預(yù)備級(GE Life Sciences))UNO S步驟的優(yōu)化.在UNO S步驟的過程中，rVWF結(jié)合強陽離子交換樹脂，同時一些雜質(zhì)穿過。在使用傳導(dǎo)性增加的緩沖液洗滌柱后，結(jié)合的rVWF在鹽步驟的條件下從柱上釋放。在初始病毒去除研究中，該步驟顯示對于模型REO病毒至少具有顯著的去除率。應(yīng)用的參數(shù)的條件和對應(yīng)的結(jié)果列于下面表1中。表 1
權(quán)利要求
1.一種從含蛋白的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；以及使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗滌緩沖液的 PH等于或小于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的pH。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中施加至所述陽離子交換樹脂的溶液比所述蛋白的等電點高至少1個PH單位。
3.一種從含蛋白的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；在高于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH的pH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH 等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述第一洗滌緩沖液的pH比施加至所述陽離子交換樹脂的蛋白的等電點高至少1個PH單位。
5.一種從含蛋白的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；和在高于施加至所述陽離子交換樹脂的蛋白的等電點的PH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH 等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。
6.權(quán)利要求5所述的方法，其中施加至所述陽離子交換樹脂的溶液比所述蛋白的等電點高至少1個PH單位。
7.權(quán)利要求5所述的方法，其中所述第一洗滌緩沖液的pH比施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH高至少1個pH單位。
8.權(quán)利要求2、4、6或7所述的方法，其中所述pH大于7.0。
9.權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述溶液中的蛋白是分子量為至少約150 千道爾頓的多肽。
10.權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述陽離子交換樹脂具有選自羧甲基 (CM)、磺基烷基(SP，SE)、纖維素的硫酸酯、肝素和甲基磺酸根(S)的帶負電荷基團。
11.權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述蛋白是凝血蛋白。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述凝血蛋白選自因子VIII和VonWillebrand因子。
13.一種從含von Willebrand(VffF)的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；以及使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗滌緩沖液的 PH等于或小于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的pH。
14.一種從含VWF的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；在高于施加至所述陽離子交換樹脂的溶液的PH的pH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH 等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。
15. 一種從含VWF的溶液中去除非-脂質(zhì)包封的病毒的方法，包括 在高于所述蛋白的等電點的PH下將所述溶液施加至陽離子交換樹脂；和在高于施加至所述陽離子交換樹脂的蛋白的等電點的PH下使用第一洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂；以及使用第二洗滌緩沖液洗滌所述陽離子交換樹脂以形成洗脫液，所述第一洗脫液的PH 等于或小于所述第一洗滌緩沖液的PH。
全文摘要
本發(fā)明提供純化Von Willebrand因子(VWF)以增加非-脂質(zhì)包封的病毒的去除的方法。
文檔編號C07K14/755GK102482341SQ201080039582
公開日2012年5月30日 申請日期2010年8月20日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月20日
發(fā)明者A·米特雷爾, C·邁爾, M·哈斯拉赫爾 申請人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特國際公司