專利名稱：具有核內(nèi)轉(zhuǎn)運性的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有核內(nèi)轉(zhuǎn)運性的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。更具體地說，本發(fā)明涉及可以容易地轉(zhuǎn)運到免疫細胞的核內(nèi)、特別是樹突細胞的核內(nèi)的脂質(zhì)體等的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。
背景技術(shù)：
作為將藥物特異性地運送到患部的方法，人們提出了在為脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)體中包封藥物的方法。特別是在惡性腫瘤的治療領(lǐng)域中，有很多包封抗腫瘤藥的脂質(zhì)體的有效性的報告。作為可用于基因表達的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，還有人提出了多功能信封式納米結(jié)構(gòu)體(MEND !Multifunctional envelope-type nano device ;以下，本說明書中可簡稱為 “MEND”。例如參照 Drug Delivery System, 22-2, 115-122 頁，2007 等)。已知該結(jié)構(gòu)體可作為用于將基因等選擇性地送達特定細胞內(nèi)的藥物遞送系統(tǒng)使用，例如可用于腫瘤的基因治療等。
作為使用脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于將藥物、核酸、肽、多肽、糖等目標物質(zhì)送達至靶器官或腫瘤組織等特定部位的方法，人們提出了很多將脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面用功能性分子修飾的方法。內(nèi)包抗腫瘤藥等藥物的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體到達靶細胞，則通過胞吞被攝入到細胞內(nèi)，形成包含于內(nèi)體的狀態(tài)，然后受到溶酶體的酶的水解作用等，將內(nèi)包的藥物釋放到細胞質(zhì)內(nèi)。為提高被攝入到內(nèi)體中的脂質(zhì)體的藥物釋放性，有人提出了將脂質(zhì)體的表面用肽 (GALA !Biochemistry, 26, 2964-2972頁，1987)進行修飾的脂質(zhì)體(Biochemistry, 43, 5618-5623 頁，2004)或 MEND (日本特開 2006-28030 號公報)。
作為將內(nèi)包核酸等目標物質(zhì)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)運至靶細胞的核內(nèi)的方法，例如有人提出將脂質(zhì)體的外側(cè)表面用八聚精氨酸修飾的脂質(zhì)體(國際公開W02005/32593 ； Journal of Controlled Release, 98, 317-323 頁，2004)、具有用核轉(zhuǎn)運妝修飾的脂質(zhì)膜的兩層膜脂質(zhì)體(國際公開W02006/101201)、用半乳糖或甘露糖等單糖修飾表面的脂質(zhì)體(國際公開W02007/102481)。用單糖修飾的多重脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體(T-MEND)顯示與脂質(zhì)膜和核膜的融合性，據(jù)信在體外實驗結(jié)果中可以改善基因表達效率。
另一方面，如果可以將編碼抗原性蛋白質(zhì)的核酸導入免疫細胞、特別是具有抗原呈遞作用的樹突細胞的核內(nèi)，則可以將在樹突細胞內(nèi)由核酸轉(zhuǎn)錄翻譯的蛋白質(zhì)在樹突細胞表面進行抗原呈遞，生物體可獲得對該蛋白質(zhì)的免疫。從上述觀點考慮，要求可將核酸高效率地送達樹突細胞等免疫細胞核內(nèi)的技術(shù)。
但是，使用上述MEND等脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體將核酸導入樹突細胞的核內(nèi)時，核酸導入效率與其它細胞、例如腫瘤細胞和肝實質(zhì)細胞相比并不足夠。所導入的核酸在最終在 核內(nèi)表達之前，還必須經(jīng)過攝入到細胞內(nèi)、脫離內(nèi)體、核內(nèi)轉(zhuǎn)運以及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄等各種細胞內(nèi)動態(tài)過程，但是在樹突細胞等非分裂細胞中，由兩層膜組成的核膜總是完整地存在，可以推斷該核膜妨礙脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的核內(nèi)轉(zhuǎn)運能力。因此，為了使用脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體將核酸送達至樹突細胞的核內(nèi)，如何突破上述各過程、特別是由兩層膜組成的核膜所帶來的阻擋，這成為極為重要的課題。
已知被稱為KALA肽的27個氨基酸殘基的多肽，有報道稱，可利用其本身的陽離子電荷與質(zhì)粒DNA形成復合體(Biochemistry, 36, 3008-3017頁，1997),但上述出版物并沒有該肽是否促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的啟示。
現(xiàn)有技術(shù)文獻專利文獻 專利文獻1:國際公開W02005/32593 專利文獻2 :國際公開W02006/101201 專利文獻3 :國際公開W02007/102481 專利文獻4 :日本特開2006-28030號公報非專利文獻非專利文獻1:Drug Delivery System, 22-2, 115-122 頁，2007 非專利文獻 2 =Biochemistry, 26，2964-2972 頁，1987 非專利文獻 3 =Biochemistry, 43，5618-5623 頁，2004 非專利文獻 4 :Journal of Controlled Release, 98, 317-323 頁，2004 非專利文獻 5 :Biochemistry，36，3008-3017 頁，1997。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的課題在于提供用于將核酸高效率地送達至免疫細胞、特別是具有抗原呈遞能力的樹突細胞的核內(nèi)的方法。更具體來說，本發(fā)明的課題在于提供可以將核酸高效率地送達至樹突細胞等免疫細胞的核內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。
本發(fā)明人為解決上述課題，嘗試將核酸包封于用可提高核內(nèi)轉(zhuǎn)運能力的功能性多肽八聚精氨酸多肽修飾的MEND(國際公開W02005/32593)、或用具有內(nèi)體脫離能力的功能性多肽GALA肽修飾的MEND (日本特開2006-28030號公報)，導入樹突細胞，但是幾乎未見來自該核酸的多肽表達。還嘗試將核酸包封于具有與內(nèi)體顯示融合性的脂質(zhì)膜和與核膜顯示融合性的脂質(zhì)膜的多重脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體(T-MEND)，將核酸導入樹突細胞，雖然核內(nèi)略微可見促進了來自導入核酸的多肽表達，但是，樹突細胞表面未觀察到該多肽的呈遞。
本發(fā)明人進一步深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將包封核酸的MEND等的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)膜用KALA肽修飾，則核酸導入樹突細胞等免疫細胞核內(nèi)的核酸導入效率顯著提高。本發(fā)明基于上述認識完成。
S卩，本發(fā)明提供脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于將物質(zhì)送達至細胞的核內(nèi)，脂質(zhì)膜用下述(a)和/或(b)的多肽修飾(a)由SEQID NO:1的氨基酸序列組成的多肽；(b)由在SEQID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽，該多肽具有促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性。
根據(jù)上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的優(yōu)選方案，提供上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體為脂質(zhì)體；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，細胞為免疫細胞，優(yōu)選樹突細胞；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，上述(a)和/或(b)的多肽用疏水性基團、優(yōu)選硬脂基或膽留醇基等修飾，上述疏水性基團插入到脂質(zhì)膜中；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體表面具有含連續(xù)的多個精氨酸殘基的多肽、優(yōu)選含4-20個連續(xù)的精氨酸殘基的多肽、進一步優(yōu)選僅由4-20個連續(xù)的精氨酸殘基組成的多肽、特別優(yōu)選八聚精氨酸；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體表面具有聚亞烷基二醇或者磷脂縮合而成的聚亞烷基二醇、優(yōu)選聚乙二醇(PEG);上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，陽離子性脂質(zhì)相對于構(gòu)成脂雙層的總脂質(zhì)的比例為0-40%(mol比)。
根據(jù)另一方面，本發(fā)明提供要送達的物質(zhì)包封于內(nèi)部的上述任何脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，提供上述任何的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，要送達的物質(zhì)為核酸、例如包含基因的核酸或siRNA等功能性核酸；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，要送達的物質(zhì)為DNA ； 上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，該DNA是與不含有CpG的載體DNA結(jié)合的DNA ;上述的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，該DNA不含有CpG，且該DNA是與不含有CpG的載體DNA結(jié)合的DNA ;上述的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，要送達的物質(zhì)為編碼要在免疫細胞表面、優(yōu)選樹突細胞表面呈遞的抗原多肽的核酸；上述任何的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體為多功能信封式納米結(jié)構(gòu)體 (MEND);上述任何的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體內(nèi)部包封核酸和陽離子性聚合物，優(yōu)選魚精蛋白。
本發(fā)明還提供上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于將編碼要在免疫細胞表面、優(yōu)選樹突細胞表面呈遞的抗原多肽的核酸導入該細胞的核內(nèi)；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于對上述抗原多肽的免疫療法；上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，上述抗原多肽是對癌細胞特異的表面多肽。本發(fā)明更提供含有該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體作為有效成分的藥物組合物， 優(yōu)選含有核酸作為要送達物質(zhì)的藥物組合物。
在又一方面，本發(fā)明提供在包括人在內(nèi)的哺乳類動物的生物體內(nèi)，將核酸送達至細胞的核內(nèi)、優(yōu)選免疫細胞的核內(nèi)、進一步優(yōu)選樹突細胞的核內(nèi)的方法，該方法包含將內(nèi)部包封有核酸的上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體給予該動物的步驟；在包括人在內(nèi)的哺乳類動物的生物體內(nèi)，在免疫細胞、優(yōu)選樹突細胞表面呈遞抗原多肽的方法，該方法包含將內(nèi)部包封有編碼該抗原多肽的核酸的上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體給予該動物的步驟。
本發(fā)明還提供在包括人在內(nèi)的哺乳類動物的生物體內(nèi)，在免疫細胞、優(yōu)選樹突細胞的表面呈遞抗原多肽，以獲得對該抗原多肽的免疫的方法，該方 法包含將內(nèi)部包封有編碼該抗原多肽的核酸的上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體給予該動物的步驟；以及惡性腫瘤的免疫療法， 該免疫療法是在包括人在內(nèi)的哺乳類動物的生物體內(nèi)，在免疫細胞、優(yōu)選樹突細胞表面呈遞癌細胞特異性表面多肽，以獲得對該多肽的免疫，該方法包含將內(nèi)部包封有編碼該多肽的核酸的上述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體給予該動物的步驟。
本發(fā)明進一步提供多肽，該多肽用于促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)、優(yōu)選免疫細胞的核內(nèi)、進一步優(yōu)選樹突細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運，為下述(a)和/或(b)的多肽(a)由SEQID NO:1的氨基酸序列組成的多肽；(b)由在SEQID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽。
本發(fā)明所提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可以高效率地向包括樹突細胞在內(nèi)的免疫細胞等任意細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運，可以使包封的核酸等物質(zhì)高效率釋放至核內(nèi)，表達由該核酸所編碼的多肽。使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向樹突細胞的核內(nèi)導入編碼多肽的核酸時，由該核酸轉(zhuǎn)錄翻譯的多肽在樹突細胞表面呈遞，生物體可獲得對該多肽的免疫，因此，可以對所需多肽進行有效的免疫療法。
本發(fā)明所提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體還具有以下特征其本身可對樹突細胞發(fā)揮佐劑作用，可促進各種細胞因子的生成，通過給予用本發(fā)明所提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)化的樹突細胞，不管有無佐劑，都可以顯著抑制腫瘤的惡化或增殖，通過包封抗原蛋白質(zhì)并給予，可以在體內(nèi)增強細胞毒活性。并且還具有以下特征在包封的DNA中，從載體部分除去CpG序列，進一步根據(jù)需要還從編碼要表達的蛋白質(zhì)的DNA上除去CpG序列，由此基因表達效率顯著提高。
附圖簡述

圖1是表示脂質(zhì)膜用多肽(a) (KALA)修飾的MEND的基因表達效率的圖。
圖2是表示脂質(zhì)膜用多肽(a) (KALA)修飾的4層膜的陽離子性T-MEND和陰離子性T-MEND的基因表達效率的圖。
圖3是表示使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向樹突細胞的核內(nèi)導入編碼抗原分子的基因、使表達的抗原分子在樹突細胞表面呈遞的結(jié)果的圖。
圖4是表示MEND表面修飾的KALA對于樹突細胞具有佐劑效果的圖。
圖5是表示包封蛋白質(zhì)的、KALA修飾的脂質(zhì)體的CTL活性的圖。
圖6是表示例6的作為質(zhì)粒DNA⑵構(gòu)建方法的第I步驟，構(gòu)建具有新的多克隆位點的CpGfree質(zhì)粒DNA的步驟的圖。
圖7是表示例6的作為質(zhì)粒DNA⑵構(gòu)建方法的第2步驟，向CpGfree-NEWmcs摻入螢光素酶基因的步驟的圖。
圖8是表示例6的作為質(zhì)粒DNA⑵構(gòu)建方法的第3步驟，除去剩余的一個CpG序列的步驟的圖。
圖9是表示通過導入質(zhì)粒的載體的變異來增強KALA-MEND基因表達活性的效果的圖。
圖10是表示用KALA進行表面修飾的MEND無關(guān)佐劑有無、具有高抗腫瘤活性的圖。
圖11是表示腫瘤形成后給予用KALA進行表面修飾的MEND時的抗腫瘤效果的圖。
實施發(fā)明的方案構(gòu)成本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)例如可舉出磷脂、糖脂、留醇或者飽和或不飽和的脂肪酸等。
磷脂以及磷脂衍生物例如可舉出磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、心磷脂、鞘磷脂、神經(jīng)酰胺磷酸乙醇胺、神經(jīng)酰胺磷酸甘油、神經(jīng)酰胺磷酸甘油磷酸酯、1，2- 二肉豆蘧酰-1，2-脫氧磷脂酰膽堿、縮醛膦酯、磷脂酸等，它們可以將I種或2種以上組合使用。這些磷脂中的脂肪酸殘基沒有特別限定，例如可舉出碳原子數(shù)12-20的飽和或者不飽和的脂肪酸殘基，具體來說可舉出來自月桂酸、肉豆蘧酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸等脂肪酸的?；＿€可以使用卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂等來自天然產(chǎn)物的磷脂。
糖脂例如可舉出甘油糖脂(例如磺基核糖基甘油酯、二葡基甘油二酯、二半乳糖基甘油二酯、半乳糖基甘油二酯、葡基甘油 二酯)、鞘糖脂(例如半乳糖基腦苷脂、乳糖基腦苷脂、神經(jīng)節(jié)苷脂)等。
留醇例如可舉出來自動物的留醇(膽留醇、琥珀酸膽留醇酯、羊毛留醇、二氫羊毛甾醇、鏈留醇、二氫膽留醇)、來自植物的留醇(植物留醇)(例如豆留醇、谷留醇、菜油甾醇、菜籽留醇)、來自微生物的留醇(例如酵母留醇、麥角留醇)等。
飽和或不飽和的脂肪酸例如可舉出棕櫚酸、油酸、硬脂酸、花生四烯酸、肉豆蘧酸等碳原子數(shù)12-20的飽和或不飽和的脂肪酸。
脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的形態(tài)沒有特別限定，作為分散于水類溶劑中的形態(tài)，例如可舉出單層膜脂質(zhì)體、多層脂質(zhì)體、Ο/ff型乳液、ff/0/ff型乳液、球狀膠束、繩狀膠束或不定型的層狀結(jié)構(gòu)物等。本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的優(yōu)選形態(tài)可舉出脂質(zhì)體。以下，作為本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的優(yōu)選方案，會對脂質(zhì)體進行說明，但本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體并不限于脂質(zhì)體。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體是用于將物質(zhì)送達至細胞的核內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其特征在于脂質(zhì)膜用下述(a)和/或(b)的多肽修飾(a)由SEQ ID NO:1的氨基酸序列組成的多肽；(b)由在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽，該多肽具有促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性。
SEQ ID NO:1所示的上述多肽(a)是從由30個氨基酸殘基組成的公知的多肽 (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)的C末端除去3個氨基酸，由其余27個氨基酸殘基組成的多肽(以下在本說明書中，可將該多肽稱為“KALA肽'Biochemistry, 36，3008-3017 頁，1997)。上述出版物中記載，該肽可利用自身的陽離子電荷，與質(zhì)粒DNA形成復合體，但并沒有是否促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的啟示。另外，公知的KALA肽是在被稱為GALA 肽的由30個氨基酸殘基組成的功能性多肽中(Bioor. Med. Chem. , 5，1883-1891頁， 1997)，具有多個氨基酸殘基被其它氨基酸殘基置換所得的氨基酸序列(例如多個谷氨酸殘基被賴氨酸殘基置換)。但是，GALA肽是響應pH，具有促進脂質(zhì)膜融合的功能、還具有提高脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體從內(nèi)體中脫離能力的功能的多肽，與本發(fā)明所利用的KALA肽的功能(提高脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在細胞中的核內(nèi)轉(zhuǎn)運性的功能)不同。
本發(fā)明中也可以使用多肽(b):由在SEQ ID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入所得的氨基酸序列組成的多肽(·以下稱為“變異多肽”)， 其具有促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性。促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性例如可以評價促進樹突細胞中的核內(nèi)轉(zhuǎn)運能力的活性。例如，可使用樹突細胞作為靶細胞， 在內(nèi)部保持有可在其核內(nèi)表達的狀態(tài)下的核酸、例如與在樹突細胞的核內(nèi)有效的啟動子下游連接的編碼多肽的核酸的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體中，制備將該脂質(zhì)膜用變異多肽修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體(以下稱為“修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體”)和未用變異多肽修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體(以下稱為“非修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體”)，來評價導入了修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的細胞中的標記多肽的表達量是否比導入了非修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的細胞中的多肽的表達量增加?？梢姳磉_量增加時，可以使用該變異多肽作為上述多肽(b)。也可以將上述多肽(b)的I種或2種以上與多肽(a)組合使用。
上述多肽(a)和多肽(b)可以根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的各種基因重組技術(shù)， 使用宿主細胞進行生物學制備。還可以通過有機化學方法制造上述多肽，所述有機化學方法是利用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的固相合成法等的肽合成反應進行?；蛘咭部梢允褂秒暮铣蓛x自動合成。
將上述多肽(a)和/或多肽(b)固定于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)膜上的方法沒有特別限定，例如可以用硬酯基或膽甾醇基等疏水性基團對上述多肽(a)和/或多肽(b)進行修飾，制備該疏水性基團埋于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)膜中的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，由此可容易地進行脂質(zhì)膜修飾。疏水性基團可以使用任意的疏水性化合物的殘基。使用具有脂質(zhì)多層膜的脂質(zhì)體等作為脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體時，除了用上述多肽(a)和/或多肽(b)對外側(cè)的脂質(zhì)膜進行脂質(zhì)膜修飾之外，也可以對內(nèi)側(cè)的脂質(zhì)膜進行。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可用于將物質(zhì)送達至細胞的核內(nèi)，細胞的種類沒有特別限定，根據(jù)要送達的物質(zhì)的種類或物質(zhì)送達至核內(nèi)的目的等，可以以適當?shù)募毎鳛榘袠??？勺鳛榘袠说募毎蓛?yōu)選舉出免疫細胞，免疫細胞中，可優(yōu)選使用抗原呈遞細胞。例如優(yōu)選巨噬細胞、樹突細胞、B細胞等的抗原呈遞細胞，特別優(yōu)選的是樹突細胞。
為了促進本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向核內(nèi)轉(zhuǎn)運，例如，也可以用3糖以上的寡糖化合物對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體進行表面修飾。3糖以上的寡糖化合物的種類沒有特別限定，例如可使用3個-10個左右的糖單元結(jié)合而成的寡糖化合物，優(yōu)選可使用3個-6個左右的糖單元結(jié)合而成的寡糖化合物。
更具體地，寡糖化合物例如可舉出纖維三糖(Cellotriose : β-D-卩比喃葡糖基_ (I — 4) - β -D-卩比喃匍糖基_ (I — 4) -D-匍萄糖)、馬鈴署二糖(Chacotriose α-L-吡喃鼠李糖基-(I — 2)-[a-L_吡喃鼠李糖基-(I — 4) ]-D-葡萄糖)、龍膽三糖 (Gentianose β -D-咲喃果糖基β -D-卩比喃匍糖基_(1 — 6)-a -D-卩比喃匍糖昔)、異麥芽三糖(Isomaltotriose a -D-卩比喃葡糖基-(I — 6)_a -D-卩比喃葡糖基-(I — 6)-D-葡萄糖)、異匍糖基麥芽糖(Isopanose a -D-卩比喃匍糖基_(1 — 4)-[ a -D-卩比喃匍糖基-(I — 6)]-D_葡萄糖)、麥芽三糖(Maltotriose :a-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-a-D-吡喃葡糖基- (I — 4) -D-葡萄糖)、甘露三糖(Manninotriose a -D-卩比喃半乳糖基-(I — 6)-a-D-吡喃半乳糖基-(I — 6)-D-葡萄糖)、松三糖(Melezitose : a-D-吡喃匍糖基_(I — 3)-β -D-咲喃果糖基=a -D-卩比喃匍糖昔)、潘糖(Panose a -D-卩比喃匍糖基-(I — 6)-a-D-吡喃葡糖基-(I — 4)-D-葡萄糖)、車前糖(Planteose : a-D-吡喃半乳糖基_(1 — 6)-β -D-咲喃果糖基=ct -D-卩比喃匍糖昔)、棉桿糖(Raffinose β -D-咲喃果糖基=a-D-吡喃半乳糖基-(I — 6)-α-D-吡喃葡糖苷)、茄三糖(Solatriose α-L-吡喃鼠李糖基-(I — 2)-[β- -吡喃葡糖基-(I — 3)]-D-半乳糖)、傘形糖 (Umbelliferose :β-D-呋喃果糖基=a-D-吡喃半乳糖基-(I — 2) - a -D-吡喃半乳糖苷)等3糖化合物；石蒜四糖(Lycotetraose : β-D-卩比喃葡糖基-(I — 2)_[ β-D-卩比喃木糖基_ (I — 3) ] - β -D-卩比喃匍糖基_ (I — 4) - β -D-半乳糖)、麥芽四糖(Maltotetraose a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基_ (I — 4) -D-葡萄糖)、水蘇糖(Stachyose β -D-呋喃果糖基=α -D-吡喃半乳糖基- (I — 6)-α-D-吡喃半乳糖基-(1 — 6)-a-D-卩比喃葡糖苷)等4糖化合物；麥芽五糖(Maltopentaose a -D- Btt 喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃匍糖基_(I — 4) -D-匍萄糖)、毛蕊花糖(Verbascose β -D-咲喃果糖基=a -D-卩比喃半乳糖基-(I — 6) - a -D-吡喃半乳糖基-(I — 6) - a -D-吡喃半乳糖基-(I — 6) - a -D-吡喃葡糖苷)等5糖化合物；麥芽六糖(Maltohexaose a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基- (I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4) - a -D-吡喃葡糖基-(I — 4)-D-葡萄糖)等6糖化合物，但并不限于它們。
可優(yōu)選使用葡萄糖的3聚體-6聚體的寡糖化合物，可進一步優(yōu)選使用葡萄糖的 3聚體或4聚體的寡糖化合物。更具體來說，可優(yōu)選使用異麥芽三糖、異葡糖基麥芽糖、麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽六糖等，其中進一步優(yōu)選葡萄糖為α 1-4連接的麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖或麥芽六糖。特別優(yōu)選的是麥芽三糖或麥芽四糖，最優(yōu)選的是麥芽三糖。寡糖化合物對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面修飾量沒有特別限定，例如相對于總脂質(zhì)量為 l-30mol%左右，優(yōu)選2-20mol%左右，更優(yōu)選5_10mol%左右。
用寡糖化合物對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體進行表面修飾的方法沒有特別限定，例如已知有將脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用半乳糖或甘露糖等單糖進行表面修飾的脂質(zhì)體(國際公開 W02007/102481)，因此，可采用該出版物所述的表面修飾方法。上述出版物所公開的全部內(nèi)容通過參照包含在本發(fā)明的公開中。該方法是使單糖化合物與聚亞烷基二醇化脂質(zhì)連接， 進行脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面修飾的方法，通過該方法，可以同時用聚亞烷基二醇修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面，因此優(yōu)選。
用聚亞烷基二醇等親水性聚合物修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面，由此可提高脂質(zhì)體的血液中滯留性。該方法例如記載于日本特開平1-249717號公報、日本特開平2-149521號公報、日本特開平4-346918號公報、日本特開2004-10481號公報等。親水性聚合物優(yōu)選聚亞烷基二醇。聚亞烷基二醇例如可使用聚乙二醇、聚丙二醇、聚四亞甲基二醇、聚六亞甲基二醇等。聚亞烷基二醇的分子量例如為300-10，000左右，優(yōu)選500-10，000，進一步優(yōu)選I,000-5, 000 左右。
聚亞烷基二醇對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面修飾，例如可通過使用聚亞烷基二醇修飾的脂質(zhì)作為脂質(zhì)膜構(gòu)成脂質(zhì)，構(gòu)建脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體而容易地進行。例如用聚乙二醇進行修飾時，可以使用硬脂基化聚乙二醇(例如硬脂酸PEG45(STR-PEG45)等)。其它還可以使用N-{羰基-甲氧基聚乙二醇_2000}-1，2- 二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、 n_{羰基-甲氧基聚乙二醇_5000}-1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N-{羰基-甲氧基聚乙二醇_750}_1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N_{羰基-甲氧基聚乙二醇-2000}-1，2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、N_{羰基-甲氧基聚乙二醇-5000}-1, 2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺等聚乙二醇衍生物等，但聚亞烷基二醇化脂質(zhì)并不限于這些。
例如也可以使用用聚亞烷基二醇修飾的上述多肽(a)和/或多肽(b)進行脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面修飾。例如可使用由適當?shù)牧字s合而成的聚亞烷基二醇、例如硬脂基化聚乙二醇修飾的上述多肽(a)和/或多肽(b)。例如，優(yōu)選利用使聚亞烷基二醇與N末端或C 末端的半胱氨酸(Cys)殘基縮合而成的多肽。通過該方案，可同時實現(xiàn)用聚亞烷基二醇和上述多肽(a)和/或多肽(b)進行的脂質(zhì)膜修飾。
通過使寡糖化合物與聚亞烷基二醇連接，可同時實現(xiàn)聚亞烷基二醇和寡糖化合物進行的表面修飾。不過，將脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用聚亞烷基二醇或寡糖化合物進行表面修飾的方法并不限于上述方法，例如有時也可以使用硬脂基化的聚亞烷基二醇或寡糖化合物等脂質(zhì)化的化合物作為脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的構(gòu)成脂質(zhì)，由此進行表面修飾。
在制造本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體時，用于提高血液中滯留性的脂質(zhì)衍生物例如也可利用血型糖蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、磷脂酰肌醇、神經(jīng)節(jié)苷脂GM3、葡糖醛酸衍生物、谷氨酸衍生物、聚甘油磷脂衍生物等。作為用于提高血液中滯留性的親水性聚合物，除聚亞烷基二醇之外，還可以將葡聚糖、茁霉多糖、菲可、聚乙烯醇、苯乙烯-馬來酸酐交替共聚物、二乙烯基醚-馬來酸酐交替共聚物、直鏈淀粉、支鏈淀粉、殼聚糖、甘露聚糖、環(huán)糊精、果膠、卡拉膠等用于表面修飾。
為了將脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體從內(nèi)體中高效率地脫離到細胞質(zhì)中，可以將本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)膜用GALA修飾。例如日本特開2006-28030號公報中公開了用GALA實施表面修飾的脂質(zhì)體，因此，按照上述公報所述的方法，可以容易地制造用GALA進行表面修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。通常可使用GALA的膽甾醇衍生物(Chol-GALA)作為脂質(zhì)成分，制備脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，由此可以制造用GALA進行表面修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。GALA的表面修飾量沒有特別限定，例如相對于總脂質(zhì)量為O. 01-10mol%左右，優(yōu)選O. l-4mol%左右，更優(yōu)選l_3mol% 左右。
本說明書中，“GALA”的術(shù)語除日本特開2006-28030號公報的序列表中SEQ ID NO:1所規(guī)定的肽之外，還包含由在上述肽的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失、置換和/ 或添加的氨基酸序列組成、實質(zhì)上具有與GALA同樣的性質(zhì)(例如在酸性條件下可以使脂質(zhì)膜彼此融合的性質(zhì))的修飾肽。在任何含義下均不對本說明書的“GALA”的術(shù)語進行限定解釋。關(guān)于GALA以及通過GALA進行的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面修飾的方法，日本特開2006-28030 號公報公開的全部內(nèi)容通過參照包含在本說明書的公開中。
可以用MPC聚合物修飾本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面。MPC聚合物是將2_甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰膽堿(MPC)聚合得到的MPC聚合物。該聚合物具有與生物體膜類似的分子結(jié)構(gòu)，因此與多肽或血細胞等生物體成分的相互作用極小，顯示具有優(yōu)異的生物相容性。本書明書中，“MPC聚合物”的術(shù)語中也包含MPC的均聚物、以及MPC與其它聚合成分的共聚物的任意一種。
對于MPC聚合物，可以容易地獲得市售的聚合物。例如日油株式會社以注冊商標 “LIPIDURE”提供MPC的均聚物(CAS :67881-99-6) ;MPC與甲基丙烯酸丁酯的共聚物(CAS 125275-25-4) ;MPC、甲基丙烯酸鈉、甲基丙烯酸丁酯的三元共聚物；MPC與2-羥基_3_(甲基)丙烯酰氧基丙基三甲基氯化銨的二元共聚物；磷脂聚合物(LIPIDURE-S)等，均可用于本發(fā)明。
本發(fā)明中使用的MPC聚合物的種類沒有特別限定，例如可優(yōu)選使用MPC與甲基丙烯酸丁酯等甲基丙烯酸酯的共聚物，特別是嵌段共聚物等。對于該共聚物，在日本特許第 2890316號公報中詳細記載了制造方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照該特許公報，可以容易地制造所需的共聚物。該特許公報公開的全部內(nèi)容通過參照包含在本說明書的公開中。本發(fā)明中， 優(yōu)選使用具有水溶性、且具有疏水性基團的MPC聚合物，從上述角度考慮，可優(yōu)選使用用碳原子數(shù)4-18左右的丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯制造的MPC共聚物。已知MPC與甲基丙烯酸丁酯(BMA)的共聚物例如有MPC與BMA的mol比為5:5的共聚物(PMB50)或者MPC與BMA的 mol 比為 3:7 的共聚物(PMB30)等， 例如可按照 Polymer Journal, 22，355-360 頁，1990 等中記載的方法容易地制備(例如日本特開2007-314526號公報中有具體的制造方法的說明)。本發(fā)明可特別優(yōu)選使用PMB50。MPC聚合物的聚合度或分子量沒有特別限定，例如從保持水溶性的觀點考慮，可使用平均分子量(重均分子量)為5，000-300，000左右、優(yōu)選 10，000-100，000左右的聚合物。
用MPC聚合物修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的方法沒有特別限定，例如可在脂質(zhì)體等脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的水性分散物中添加MPC聚合物，在室溫下放置數(shù)分鐘至數(shù)小時左右。MPC聚合物添加于上述水性分散物的添加量沒有特別限定，根據(jù)所要修飾的MPC聚合物的量，例如相對于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的總脂質(zhì)量，可以添加0.01-1質(zhì)量％的范圍、優(yōu)選O. 1_10質(zhì)量％、進一步優(yōu)選0.1-3質(zhì)量％左右的MPC聚合物。通過該操作，MPC聚合物被迅速地攝入到脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的脂質(zhì)成分中，可以制備表面被MPC聚合物修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。MPC聚合物的表面修飾量沒有特別限定，例如相對于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的總脂質(zhì)量在O. 1-5質(zhì)量％左右的范圍。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可以含有I種或2種以上選自留醇或甘油或者其脂肪酸酯等的膜穩(wěn)定劑，生育酚、沒食子酸丙酯、抗壞血酸棕櫚酸酯、或丁基化羥基甲苯等抗氧化劑， 荷電物質(zhì)以及膜多肽等的物質(zhì)。提供正電荷的荷電物質(zhì)例如可舉出硬脂胺、油胺等飽和或不飽和脂族胺，二油酰三甲基銨丙烷等飽和或不飽和陽離子性合成脂質(zhì)，或陽離子性聚合物等；提供負電荷的荷電物質(zhì)例如可舉出磷酸二鯨蠟基酯、半琥珀酸膽留基酯、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸等。膜多肽例如可舉出膜外在多肽或膜內(nèi)在多肽等。這些物質(zhì)的摻混量沒有特別限定，可根據(jù)目的適當選擇。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體例如可以具有溫度變化感受性功能、膜透過功能、基因表達功能和PH感受性功能等任意I種或2種以上的功能。通過適當附加這些功能，例如可使內(nèi)包包含基因的核酸等的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在血液中的滯留性提高，可使被肝臟或脾臟等網(wǎng)狀內(nèi)皮組織捕獲的捕獲率降低，同時可以在靶細胞胞吞后，使脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體高效率地由內(nèi)體脫離，轉(zhuǎn)運到核內(nèi)，在核內(nèi)實現(xiàn)高的基因表達活性。
可提供溫度變化感受性功能的溫度變化感受性脂質(zhì)衍生物例如可舉出二棕櫚酰磷脂酰膽堿等。另外，可提供PH感受性功能的pH感受性脂質(zhì)衍生物例如可舉出二油酰磷脂酰乙醇胺等。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可以用可與細胞表面的受體或抗原特異性結(jié)合的抗體等物質(zhì)進行修飾，可以改善物質(zhì)向細胞的核內(nèi)的送達效率。例如，優(yōu)選將在靶組織或器官中特異性表達的生物體成分的單克隆抗體配置于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面。該方法例如記載于 STEALTH LIPOSOME(第 233-244 頁，CRC Press, Inc.發(fā)行，Danilo Lasic 和 Frank Martin編著)等中。通過含有可與單克隆抗體或其片段(例如Fab片段、F(ab’)2片段或Fab’片段等)中的巰基反應的脂質(zhì)衍生物、例如聚(乙二醇)_α-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-ω-馬來酰亞胺、α -[N-(I, 2- 二硬脂酰-sn_甘油_3_磷?；一?氨基甲?；鵠-ω-{3-[2-(2,5-二氫-2，5-二氧代-1H-吡咯-1-基)乙烷甲酰胺]丙基}_聚(氧基-1，2-乙烷二基)等的具有馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)衍生物作為脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的構(gòu)成成分，可以使單克隆抗體與脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的膜表面結(jié)合。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面可被含有連續(xù)多個精氨酸殘基的多肽(以下稱為 “聚精氨酸”)修飾。作為聚精氨酸，優(yōu)選使用含有4-20個連續(xù)的精氨酸殘基的多肽，進一步優(yōu)選僅由4-20個連續(xù)的精氨酸殘基組成的多肽，特別優(yōu)選八聚精氨酸等。將脂質(zhì)體等的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體表面用八聚精氨酸等聚精氨酸修飾，由此可以使包封入脂質(zhì)體內(nèi)的目標物質(zhì)的細胞內(nèi)送達效率提高(Journal of Controlled Release, 98, 317-323頁，2004;國際公開W02005/32593)。聚精氨酸對脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體表面的修飾可按照上述出版物所記載的方法、 例如通過使用脂質(zhì)修飾的聚精氨酸、例如硬脂基化八聚精氨酸等作為脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的構(gòu)成脂質(zhì)，容易地進行。通過參照，上述出版物的公開以及該出版物中所引用的全部的文獻公開均包含在本說明書的公開中。
并且，本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的表面可被INF7修飾。INF7是將來自流感HA多肽(HA2)的肽(1-23)進行變異得到的富含谷氨酸的肽，有報道稱，通過與脂質(zhì)體混合存在， 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)崩解，內(nèi)包的物質(zhì)容易釋放出來(Biochemistry, 46，13490-13504頁，2007)， 還有人提出了將INF7與聚乙二醇四丙烯酸酯(PEG-TA)連接的送達系統(tǒng)(The Journal of Gene Medicine, 10, 1134-1149頁，2008)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參照這些出版物，在本發(fā)明中容易地使用INF7。本說明書中，“INF7”的術(shù)語除了由Biochemistry, 46，13490-13504 頁，2007的表I所述序列規(guī)定的肽之外，還包含由在上述肽的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失、置換和/或添加的氨基酸序列組成、實質(zhì)上具有與INF7同樣性質(zhì)的修飾肽。本說明書中的“INF7”的術(shù)語在任何含義下均不進行限定解釋。通過參照，上述出版物的公開以及該出版物中所引用的全部文獻的公開均包含在本說明書的公開中。
INF7修飾脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的方法沒有特別限定，通常是使用脂質(zhì)化合物與INF7共價連接的脂質(zhì)修飾的INF7作為脂質(zhì)膜構(gòu)成脂質(zhì)，構(gòu)建脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，由此可容易地制造用 INF7進行表面修飾的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體。脂質(zhì)修飾的INF例如可利用硬脂基化INF7等，該化合物可按照 Futaki, S.等，Biocongug. Chem. , 12(6)，1005-1011 頁，2001 記載的方法容易地制造。INF7的表面修飾量沒有特別限定，通常相對于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的總脂質(zhì)量為 l-5mol%的范圍,優(yōu)選相對于總脂質(zhì)量為3-5mol%左右。
已知添加了多功能性的信封式納米結(jié)構(gòu)體(MEND)，可優(yōu)選作為本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體使用。MEND例如具有以下結(jié)構(gòu)將質(zhì)粒DNA等核酸與魚精蛋白等陽離子性聚合物的復合體作為芯，該芯包封于脂質(zhì)體形態(tài)的脂質(zhì)包被膜的內(nèi)部。MEND的脂質(zhì)包被膜可根據(jù)需要配置用于調(diào)節(jié)PH響應性或膜透過性的肽，脂質(zhì)包被膜的外側(cè)表面可用聚乙二醇等亞烷基二醇修飾。MEND的脂質(zhì)包被內(nèi)部設(shè)計成包封有凝縮的DNA和陽離子性聚合物，可實現(xiàn)高效率的基因表達。本發(fā)明中可優(yōu)選使用的MEND優(yōu)選下述MEND :摻入了所需基因的質(zhì)粒DNA與魚精蛋白的復合體被包封于內(nèi)部，脂質(zhì)包被的外側(cè)表面用連接了寡糖的PEG修飾。對于連接了寡糖的PEG進行的修飾，優(yōu)選使用上述多肽(a)和/或多肽(b)所連接的硬脂基化聚乙二醇作為構(gòu)成脂質(zhì)成分。關(guān)于MEND,例如可參照Drug Delivery System, 22-2, 115-122 頁，2007等的綜述。通過參照，上述出版物的公開以及該綜述中所引用的全部文獻的公開均包含在本說明書的公開中。
脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的形態(tài)沒有特別限定，例如可舉出分散于水類溶劑(例如水、生理鹽水、磷酸緩沖生理鹽水等)的形態(tài)或?qū)⒃撍苑稚⑽锢鋬龈稍锏男螒B(tài)等。
脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的制造方法也沒有特別限定，可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用的任意的方法。舉一個例子，可如下制造將所有的脂質(zhì)成分溶解于氯仿等有機溶劑中，通過蒸發(fā)器減壓蒸發(fā)或通過噴霧干燥機噴霧干燥，由此形成脂質(zhì)膜，然后在干燥后的上述混合物中添加水類溶劑，進一步通過勻漿機等乳化機、超聲波乳化機或高壓噴射乳化機等乳化。還可以根據(jù)公知的制造脂質(zhì)體的方法、例如反相蒸發(fā)法等制造。需要控制脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的大小時，可使用孔徑統(tǒng)一的膜濾器等，在高壓下進行擠出(擠出過濾)。分散狀態(tài)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的大小沒有特別限定，例如為脂質(zhì)體時，粒徑為50nm-5 μ m左右，優(yōu)選50nm-400nm左右，還優(yōu)選50nm-300nm左右，更優(yōu)選150nm-250nm左右。粒徑例如可通過DLS (動態(tài)光散射)法測定。
水類溶劑(分散介質(zhì))的組成沒有特別限定，例如可舉出磷酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷酸緩沖生理鹽液等緩沖液，生理鹽水、細胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基等。這些水類溶劑(分散介質(zhì))可以將脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體穩(wěn)定分散，還可進一步加入葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等單糖類，乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等二糖類，棉籽糖、松三糖等三糖類，環(huán)糊精等多糖類，赤蘚醇、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇、麥芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)，或甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二甘醇單烷基醚、1，3-丁二醇等多元醇(水溶液)等。分散于該水類溶劑中的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體長期穩(wěn)定保存時，從抑制凝集等物理穩(wěn)定性方面考慮，優(yōu)選盡量排除水類溶劑中的電解質(zhì)。另外，從脂質(zhì)的化學穩(wěn)定性方面考慮，優(yōu)選將水類溶劑的PH設(shè)定為弱酸性至中性附近(PH3. 0-8. O左右)，和/或通過氮鼓泡等除去溶解氧。
將所得脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的水性分散物進行冷凍干燥或噴霧干燥時，例如使用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、果糖、肌醇、核糖、木糖等單糖類，乳糖、蔗糖、纖維二糖、海藻糖、麥芽糖等二糖類，棉籽糖、松三糖等三糖類，環(huán)糊精等多糖類，赤蘚醇、木糖醇、山梨醇、甘露糖醇、 麥芽糖醇等糖醇等糖(水溶液)，則可以改善穩(wěn)定性。另外，將上述水性分散物冷凍時，例如使用上述糖類或甘油、二甘油、聚甘油、丙二醇、聚丙二醇、乙二醇、二甘醇、三甘醇、聚乙二醇、乙二醇單烷基醚、二甘醇單烷基醚、1，3- 丁二醇等多元醇(水溶液)，則可以改善穩(wěn)定性。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體、例如脂質(zhì)體的內(nèi)部可以包封要送達至靶組織或器官的細胞的核內(nèi)的物質(zhì)?？砂獾奈镔|(zhì)的種類沒有特別限定，除抗腫瘤藥、抗炎癥藥、抗菌藥、抗病毒藥等任意的藥物的有效成分之外，還可以包封糖類、肽類、核酸類、低分子化合物、金屬化合物等任意的物質(zhì)。核酸例如可舉出包含基因的核酸，更具體地說，例如可舉出摻入質(zhì)粒中的基因等，但并不限于該特定方案。當然基因可以使用任意的基因。作為本發(fā)明的一個例子，以下對包封核酸的情形進行具體說明，但本發(fā)明的范圍并不限定為該特定方案。
本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體優(yōu)選可包封核酸。核酸除DNA或RNA之外，也包括它們的類似物或衍生物(例如肽核酸(PNA)或硫代磷酸酯DNA等)。核酸可以是單鏈或雙鏈，也可以是線狀或環(huán)狀。核酸可以包含基因?；蚩梢允枪押塑账?、DNA或RNA的任意一種，可特別舉出轉(zhuǎn)化等的體外導入用基因、或通過在體內(nèi)表達而發(fā)揮作用的基因，例如同源重組用的正常基因等基因治療用基因等。治療用的核酸除編碼反義寡核苷酸、反義DNA、反義RNA、 酶、細胞因子等生理活性物質(zhì)的基因之外，還可以使用具有調(diào)節(jié)基因表達的功能的核酸，例如siRNA等的包含RNA等的功能性核酸，這些也包含在本說明書的核酸術(shù)語中。本說明書中“核酸”的術(shù)語必須是最廣義的解釋，在任何含義中都不進行限定解釋。例如使用DNA作為核酸時，例如可以將要表達的基因DNA與載體DNA連接，包封在脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體中，但是，為了實現(xiàn)更高的基因表達效率，優(yōu)選該載體DNA不含有CpG序列，除此之外，有時進一步優(yōu)選要表達的基因DNA不含有CpG序列。優(yōu)選該載體連接有增強子和/或啟動子。
另外在本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體中包封核酸時，可以加入具有核酸導入功能的化合物。上述化合物例如可舉出0，0’-N-雙十二烷酰-Ν-(α-三甲基銨基乙酰)_ 二乙醇胺氯化物、O, O’ -N-雙十四烷酰-Ν_( α -三甲基銨基乙酰)-二乙醇胺氯化物、O, O’ -N-雙十六烷酰-Ν-( α -三甲基銨基乙酰)-二乙醇胺氯化物、0，O’ -N-雙十八烷酰-Ν-( α -三甲基銨基乙酰)-二乙醇胺氯化物、0，O’，O’ ’ -十三烷酰-Ν_(ω-三甲基銨基癸酰)氨基甲烷溴化物和Ν_[ α -三甲基銨基乙酰]-雙十二烷基 -D-谷氨酸鹽、二甲基雙十八烷基溴化銨、 2，3- 二油基氧基-N-[2-(精胺甲酰胺)乙基)-N，N- 二甲基-1-丙烷三氟乙酸銨、1，2- 二肉 蘧基氧基丙基-3-二甲基-輕基乙基溴化銨、3_β _[N_(N’，N’ _ 二甲基氨基乙燒)氨基甲酰基]膽留醇等。這些具有核酸導入功能的化合物可以配置在脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的膜的任意位置，和/或填充于脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體的內(nèi)部。
例如包封核酸的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可作為用于將該核酸送達至靶組織或器官的細胞的核內(nèi)的載體使用。以基因表達為目的時，核酸是使用包含所需基因的核酸，特別優(yōu)選使用上述MEND。例如，通過將包封了包含基因的核酸的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體、優(yōu)選MEND給予包括人在內(nèi)的哺乳類動物，可以將所需基因送達至靶組織或器官的細胞的核內(nèi)，高效率表達。給予方法沒有特別限定，優(yōu)選非口服給予，進一步優(yōu)選靜脈內(nèi)給予。使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體作為藥物時，例如可以與適當?shù)闹苿┯锰砑游镆黄?，制備藥物組合物形態(tài)的藥物進行給予。
使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體將核酸轉(zhuǎn)運至免疫細胞、優(yōu)選樹突細胞的核內(nèi)，則在核內(nèi)，包封的核酸等物質(zhì)高效率釋放，可以表達由該核酸編碼的多肽。使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，將編碼多肽的核酸導入樹突細胞的核內(nèi)時，由該核酸轉(zhuǎn)錄翻譯的多肽在樹突細胞的表面呈遞，生物體可獲得對該多肽的免疫，因此，可進行對所需多肽有效的免疫療法。該方案在本發(fā)明中是特別優(yōu)選的方案。
由本發(fā)明提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體其本身可對樹突細胞發(fā)揮佐劑作用，可促進各種細胞因子的生成。因此，通過使用本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，可以極高效地進行免疫療法。另外， 將由本發(fā)明所提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體轉(zhuǎn)化的樹突細胞給予包括人在內(nèi)的哺乳類動物，不 管有無佐劑，均可顯著抑制惡性腫瘤的惡化或增殖，通過包封抗原蛋白并給予，可以增強體內(nèi)的細胞毒活性，因此，可以作為具有高有效性的惡性腫瘤的預防疫苗或惡性腫瘤的治療藥物的有效成分利用。實施例
以下通過實施例進一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明的范圍并不限定為下述實施例。
例I(a)包封的核酸的制備(魚精蛋白凝縮物)將編碼螢光素酶的質(zhì)粒(pDNA, BD Biosciences Clontech制造)溶解于IOmM HEPES 緩沖液中，濃度為O. lmg/mL。一邊攪拌一邊向150yL O. lmg/mL(10mM HEPES緩沖液) 的魚精蛋白溶液中少量多次滴加共IOOyL pDNA溶液，制備魚精蛋白與pDNA的凝縮物 (compaction body) (N/P 比為 2. 2)。
(b)包封魚精蛋白芯的脂質(zhì)體的制作將 112.5yL ImM DOPE 和 25 μ L ImM CHEMS 加入到玻璃試管中，使 DOPE: CHEMS=9: 2。 進一步加入按照Biochemistry, 43，5618-5628頁，2004中記載的方法合成的Img/ mL Chol-GALA和按照日本特開2003-343857號公報記載的方法合成的lmg/mL硬脂基化KALA(STR-KALA)，達到總脂質(zhì)濃度的1_8%分量的修飾量，進一步加入氯仿，使總量為 200 μ L，用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中添加上述(a)的凝縮物， 使總脂質(zhì)濃度為0. 55mM,在室溫下靜置10分鐘，使其水合，然后用超聲波破碎儀進行I分鐘超聲波處理。添加總脂質(zhì)的5mol%分量的、按照日本特開2003-343857號公報的方法合成的硬脂基化八聚精氨酸(STR-R8)的2mg/mL水溶液，在室溫下靜置10分鐘。
(c)包封的核酸的制備(聚輪烷凝縮物)將編碼螢光素酶的質(zhì)粒(pDNA, BD Biosciences Clontech制造)溶解于IOmM HEPES緩沖液中，濃度為 0.1mg/mL。將按照 J. Control. Release, 131，137-144 頁，2008 記載的方法合成的聚輪烷(平均聚乙二醇鏈長4，000，環(huán)糊精貫通數(shù)29，I條鏈內(nèi)的平均陽離子數(shù)46)用IOmM HEPES緩沖液溶解(換算為ImM胺濃度)，一邊攪拌一邊在150 μ L所得溶液中少量多次滴加共100 μ L pDNA溶液，制備聚輪烷與pDNA的凝縮物(N/P比為5. O)。(d)包封聚輪烷芯的脂質(zhì)體的制作
將107yL ImM DOPE和30. 5 μ L ImM磷脂酸加入到玻璃試管中，使D0PE:PA=7: 2。加入按照日本特開2003-343857號公報記載的方法合成的lmg/mL STR-KALA,達到總脂質(zhì)濃度的1. 5-5%分量的修飾量(8. 25 μ L-27. 5 μ L),進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中添加上述(c)的凝縮物，使總脂質(zhì)濃度為O. 55mM,在室溫下靜置10分鐘，使其水合，然后用超聲波破碎儀進行I分鐘超聲波處理。添加總脂質(zhì)的10mol%的、按照日本特開2003-343857號公報的方法合成的硬脂基化八聚精氨酸(STR-R8)的2mg/mL水溶液，在室溫下靜置10分鐘，進行水合。(e)轉(zhuǎn)化細胞的制備
將JAWS II細胞接種于24孔板上，形成8 X IO4個細胞/孔，用a MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時。將培養(yǎng)后的細胞用500 μ L PBS洗滌，然后將上述(b)和(d)中制備的脂質(zhì)體和對照脂質(zhì)體(未修飾硬脂基化KALA和Chol-GALA)添加到a MEM中，使pDNA的量為O. 4 μ g/孔，然后加入到各孔中，在37°C下、在5%C02下溫育3小時。溫育后將細胞用500 μ L PBS洗滌，然后將11111^|^1添加到各孔中，在371、5%0)2的條件下進一步溫育21小時，制作轉(zhuǎn)化細胞。(f)表達量的測定
將上述(e)的轉(zhuǎn)化細胞用500yL PBS洗漆，將該PBS回收在1. 5mL樣品管中，離心(4°C, 2，OOOrpm, 2分鐘)，除去上清。在各孔中添加75 μ L Reporter Lysis Buffer (報道基因裂解緩沖液)(Promega制造)，轉(zhuǎn)移至_80°C的冷凍室冷凍。將冷凍的樣品解凍，然后用細胞刮棒將細胞剝離，回收在1. 5mL樣品管中。將回收的細胞溶解液離心(4°C，15，OOOrpm,5分鐘)進行離心分離，回收45 μ L上清。使用所得上清測定螢光素酶活性測定(RLU/mL)。進一步進行BCA法的蛋白質(zhì)定量(mg/mL)，計算每單位多肽量的螢光素酶活性(RLU/mg蛋白)，比較螢光素酶表達量。結(jié)果如圖1所示。如圖1所示，對于用魚精蛋白形成芯、用D0PE/CHEMS包封的脂質(zhì)體，在用Chol-GALA修飾時，2%修飾時基因表達為最大，該基因表達為3倍左右。而修飾STR-KALA時表明，基因表達水平升高至10倍以上，特別是5%修飾時可促進100倍以上的表達。另外，對于用聚輪烷形成芯、用D0PE/PA的脂質(zhì)包封時，在最佳值的1. 5%修飾時，與只有RB的修飾比較，也可得到10倍以上基因表達的表達升高。例2
(a)正電荷芯T-MEND的制備
將84 μ L 3. 3mM心磷脂(CL)和27. 5 μ L IOmM DOPE加入到玻璃試管中，使CL:D0PE=1:1ο分別加入lmg/mL的STR-KALA，使修飾量為總脂質(zhì)濃度的0. 5%、1%、2%和5%，進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中加入ImL IOmM HEPES溶液，使總脂質(zhì)濃度為0. 55mM，將水合的脂質(zhì)膜用浴槽式超聲波破碎儀從玻璃試管中剝離，然后使用探針式超聲波破碎儀進行10分鐘超聲波處理。超聲波處理后進行離心分離(15，000 rpm, 20°C，5分鐘)，回收上清，將上述操作進行3次，回收STR-KALA濃度不同的4種脂質(zhì)體(SUV1-1-5)。將12.2yL IOmM PA 和 42. 8 μ L IOmM DOPE 加入到玻璃試管中，使 PA:D0PE=7 :2。加入lmg/mL的STR-KALA，使修飾量為總脂質(zhì)濃度的1. 5%，進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中加入ImL IOmMHEPES溶液，使總脂質(zhì)濃度為O. 55mM，將水合的脂質(zhì)膜用浴槽式超聲波破碎儀從玻璃試管中剝離，然后使用探針式超聲波破碎儀進行10分鐘超聲波處理。超聲波處理后進行離心分離(15，000 rpm, 20。。，5分鐘)，回收上清，將上述操作進行3次，回收脂質(zhì)體(SUV-2)。將100 μ L例I (C)中得到的凝縮物和200 μ L SUV1+5的各溶液在1. 5mL樣品管內(nèi)混合，形成5種2層膜的脂質(zhì)體(D-MEND)。形成D-MEND后，為了附加正電荷，相對于SUVl總脂質(zhì)量添加相當于20mol%的2mg/mL STR-R8，在室溫下溫育30分鐘左右，進行R8修飾。進一步對上述200 μ L溫育后的各溶液加入400 μ L的SUV2，在1. 5mL樣品管內(nèi)混合，形成4層膜MEND (T-MEND)，相對于SUV2總脂質(zhì)量，進一步添加相當于10mol%的2mg/mLSTR-R8，在室溫下溫育30分鐘左右，由此制備在內(nèi)膜和外膜均具有KALA和R8的陽離子性T-MEND。(b)負電荷芯T-MEND的制備
將編碼螢光素酶的質(zhì)粒(pDNA，BD Biosciences Clontech制造)溶解于IOmM HEPES緩沖液中，濃度為O. lmg/mLo 一邊攪拌一邊在60 μ L O. lmg/mL pDNA中少量多次滴加共90 μ L換算為胺濃度為ImM的聚輪烷溶液(平均聚乙二醇鏈長4，000，環(huán)糊精貫通數(shù)29，I條鏈內(nèi)的平均陽離子數(shù)46)，制備聚輪烷與pDNA的凝縮物(N/P比為O. 5)。將84 μ L 3. 3mM心磷脂(CL)和27. 5μ L 10 mM DOPE加入到玻璃試管中，使CL:D0PE=1:1ο加入相當于總脂質(zhì)量20mol%的2mg/mL的STR-R8，以及加入lmg/mL的STR-KALA溶液使其濃度為總脂質(zhì)濃度的O或5mol%，進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中加入ImL IOmM HEPES溶液，使總脂質(zhì)濃度為O. 55mM，將水合的脂質(zhì)膜用浴槽式超聲波破碎儀從玻璃試管中剝離，然后使用探針式超聲波破碎儀進行10分鐘超聲波處理。超聲波處理后進行離心分離(15，000rpm, 20°C，5分鐘)，回收上清，將上述操作進行3次，回收脂質(zhì)體(SUV1-0、1-5)。將12.2yL IOmM PA 和 42. 8 μ L IOmM DOPE 加入到玻璃試管中，使 PA:D0PE=7 :2，加入lmg/mL的STR-KALA，使修飾量為總脂質(zhì)濃度的O或1. 5%分量(O或8. 3 μ L)，進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得2種脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中加入ImL IOmM HEPES溶液，使總脂質(zhì)濃度為O. 55mM，將水合的脂質(zhì)膜用浴槽式超聲波破碎儀從玻璃試管中剝離，然后使用探針式超聲波破碎儀進行10分鐘超聲波處理。超聲波處理后進行離心分離(15，000 rpm, 20°C, 5分鐘)，回收上清,將上述操作進行3次，回收脂質(zhì)體(SUV2-0、2-l. 5)。將100 μ L上述Ν/Ρ=0. 5、由pDNA和聚輪烷得到的凝縮物和200 μ L SUV1-0、1-5溶液在1. 5mL樣品管內(nèi)混合，形成2層膜脂質(zhì)體(D-MEND-0、-5)。形成D-MEND后，相對于SUVl總脂質(zhì)量，添加相當于5mol%的2mg/mL STR-R8，在室溫下溫育30分鐘左右。進一步對上述200 μ L 溫育后的溶液(D-MEND-0、-5)，將 400 μ L SUV2-0 或 2-1. 5在1. 5mL樣品管內(nèi)混合，形成4層膜MEND (T-MEND)，然后，相對于SUV2總脂質(zhì)量，添加相當于10mol%的2mg/mL STR-R8，在室溫下溫育30分鐘左右，制備在內(nèi)膜和外膜均具有KALA和R8的陰離子性T-MEND。(c)轉(zhuǎn)化細胞的制作以及表達量的測定
按照例1(e)的方法，使用按照上述(a)和(b)分別制備的2種T-MEND制作轉(zhuǎn)化細胞，進一步按照例1(f)的方法測定各細胞中螢光素酶的表達量。結(jié)果，對于陽離子性T-MEND，可見所包封的基因表達依賴于KALA的修飾密度地升高(圖2)。而對于陰離子性T-MEND，通過將內(nèi)膜和外膜用KALA修飾，基因表達升高至10倍以上。特別是陰離子性T-MEND比市售的基因?qū)朐噭㎜ipofectamine PLUS顯示高的基因表達。例3
(a)抗原呈遞量的評價
使用各種載體，將編碼作為抗原的卵白抗原(卵清蛋白)的質(zhì)粒DNA導入樹突細胞，轉(zhuǎn)染24小時后回收樹突細胞，用培養(yǎng)基洗滌，然后在96孔板上接種I X IO4個細胞/100 μ L的樹突細胞和2X IO5個細胞/IOOyL的Β3Ζ(MHC-1)細胞，共培養(yǎng)16小時。之后用PBS洗滌細胞，添加IOOyL CPRG緩沖液(溶解于再蒸餾水中，形成5mM CPRG(Roche Diagnotics)、O. 125%NP-40(Igepal CA-630，SIGMA)、9mM MgCl2，分注成 lmL，在-20 °C下遮光保存)，在 37°C下溫育4小時。然后使用Benchmark Plus微量培養(yǎng)板分光光度計(Bio-Rad)測定595nm的吸光度。將只有未處理的樹突細胞的吸光度標準化為I。結(jié)果如圖3所示。評價導入卵清蛋白基因后對抗原的呈遞,結(jié)果,市售的lipofectamine PLUS或以往類型的T-MEND與對照(未導入基因的樹突細胞)進行比較，明顯觀察到優(yōu)異的抗原呈遞(虛線)。而在圖2中，在具有最高的基因表達的KALA修飾的T-MEND中觀察到抗原呈遞。由該結(jié)果顯示，本發(fā)明的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可以將基因極高效率地導入樹突細胞核內(nèi)，由所導入的基因表達的抗原蛋白可在樹突細胞表面進行抗原呈遞。例4 :使用微陣列分析進行的免疫相關(guān)基因簇的基因表達分析(a) R8-MEND 和 R8/KALA-MEND 的制備
作為載體的芯，將PDNA溶液、魚精蛋白溶液分別用IOmM HEPES緩沖液稀釋為O.1mg/mL。邊攪拌邊相對于150 μ L O. lmg/mL魚精蛋白少量多次滴加共100 μ L O. lmg/mL pDNA，制備魚精蛋白與pDNA的凝縮物(N/P比=2. 2)。脂質(zhì)膜是將112. 5μ L ImM D0PE、25y L ImMCHEMS加入到玻璃試管中，使DOPE:CHEMS=9: 2，加入CHCl3,使總量為200 μ L，然后用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，獲得脂質(zhì)膜。在脂質(zhì)膜中添加凝縮物溶液，使總脂質(zhì)濃度為O. 55mM,然后在R8-MEND中添加總脂質(zhì)量的5mol%的單獨的STR-R8 ;在R8/KALA-MEND中添加為總脂質(zhì)的5mol%的STR-KALA、STR-R8，在室溫下靜置10分鐘，水合，然后用超聲波破碎儀進行I分鐘超聲波處理。(2) RNA 制備
在轉(zhuǎn)染2天前，將JAWS-1I細胞接種于6孔板上，濃度為4X IO5個細胞/孔。將細胞用500 μ L PBS (-)洗滌，然后將用αΜΕΜ(不含血清，不含抗生素)稀釋為2μ8/ιΛ(相當于質(zhì)粒DNA的濃度)的MEND溶液加入到ImL細胞中，在37 1下、在5% CO2中溫育箱內(nèi)靜置。轉(zhuǎn)染后經(jīng)過1、3和6小時后，將細胞用500 μ L PBS (-)洗滌，加入TRIzol試劑(invitrogen制造)，使每個樣品合計為lmL。用細胞刮棒將細胞剝離，回收到Eppendorf管中。渦旋混合I分鐘，在_80°C下保存。在mRNA純化時，將各樣品在室溫下解凍，然后加入200 μ L氯仿，渦旋混合15秒。在室溫下溫育3分鐘，然后在4°C的環(huán)境下以12，OOOrpm離心15分鐘。將上清轉(zhuǎn)移至另一 Eppendorf管中，加入500 μ L異丙醇,然后在室溫下溫育10分鐘。在4°C的環(huán)境下以12，OOOrpm離心10分鐘，然后除去上清，在沉淀中加入lmL75%乙醇，渦旋混合，離心(4。〇，12，000印111，4分鐘)。除去上清，加入25 μ L焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水，溫育10分鐘,使用Nano Drop (Thermo Scientific制造),由260nm下的吸光度來對RNA量進行定量。(3) RNA 的標記
使用Quick Amp標記試劑盒、單色(Agilent制造)，按照所附方案制備DNA微陣列試驗用的標記RNA。通過反轉(zhuǎn)錄反應，由500ng總RNA合成cDNA。接著,通過體外轉(zhuǎn)錄反應，由cDNA制備用花菁3化73)-0^標記的^ 應。為了除去未反應的Cy3，使用RNeasy Mini試劑盒純化標記cRNA。對所得Cy3標記的cRNA溶液，使用Nano Drop計算濃度和Cy3攝入量,確認品質(zhì)。純化的標記cRNA探針對Cy3的攝入效率(pmol/ μ g)是由cRNA濃度(ng/ μ L)和Cy3的攝入量(pmol/μ L)計算。計算方法如下所示。(I)按下式計算cRNA濃度(ng/μ L)。cRNA 濃度(ng/ μ L) =OD260 XlOisX 40 (μ g/mL)
※ Nano Drop的光路長為Imm
(2)按下式計算Cy3的攝入量(pmol/μL)。Cy3 的攝入量(pmol/μ L) = (OD550X 10* X 1000) / (150mM_1cm_1)
※ Nano Drop的光路長為Imm
(3)按下式計算Cy3的攝入效率(pmol/μ g)。Cy3 的攝入效率(pmol/μ g) =Cy3 的攝入量(pmol/μ L) /cRNA 濃度(ng/ μ L)
關(guān)于全部Cy3標記的cRNA樣品，確認cRNA的收量為1. 65 μ g以上，且Cy3的攝入效率
為9 pmol / μ g以上。(4) DNA 微陣列
標記cRNA與小鼠寡聚DNA微陣列(4X44K)的雜交是使用Gene ExpressionHybridization Kit (基因表達雜交試劑盒)，按照所附方案進行試驗。將標記cRNA隨機切斷，制成片段，使用1.65μ8 RNA制備雜交溶液。在微陣列芯片上施加樣品，在65°C下進行17小時雜交,然后用含有10% Triton X-102的Expression Wash Buffer (表達洗漆緩沖液)洗滌芯片。使用Agilent DNA微陣列掃描儀(Agilent Technologies制造)對微陣列芯片進行掃描。Cy3的測定是使用532nm的激光。將制作的TIFF圖像用Feature ExtractionSoftware (特征提取軟件)讀入，將各點的信息(基因概況)以文本文件形式保存。將所取得的表達概況輸入GeneSpringGXll,進行分析。在以點的形式檢出的41220個基因中進行可靠性低的基因的除去(質(zhì)量控制(Quality Control)),進行分析對象21995個基因(合格基因(Qualified genes))的提取。(I)對照點的除去
將數(shù)據(jù)讀入分析軟件GeneSpringGXll，則可檢出包括使能夠識別陣列的四個角的點等在內(nèi)的對照點，因此除去這些點。(2) Flag 的除去
在點檢測時，要根據(jù)形狀散亂、熒光飽和等信號的狀況進行存在(Present(P))、邊界(Marginal (M))、不存在(Absent (A))三個等級的Flag評價。(按照P、M、A的順序可靠性降低)。在全部樣品中，在至少一個樣品中提取給予存在的評價的基因。(3)低表達基因的除去
表達水平低的基因在同一樣品之間的表達水平也有差異，因此除去。在全部樣品中的至少一個樣品中提取信號強度的絕對值Raw值為100以上的基因。進行以上的質(zhì)量控制，然后以21995個基因為對象進行分析。提取免疫相關(guān)基因簇，在R8-MEND和R8/KALA-M`END之間進行基因表達比較。本結(jié)果中示出將未處理的細胞中各基因的表達標準化為I時的值。結(jié)果，與RB-MEND比較，在R8/KALA-MEND中，可見免疫相關(guān)基因的表達升高倍率高，很多基因依賴于時間地升高。由此表明，在MEND表面修飾的KALA對于樹突細胞顯示佐劑效果(圖4)。例5 包封蛋白質(zhì)的KALA修飾的脂質(zhì)體的CTL活性
(I)包封抗原的R8修飾的脂質(zhì)體、KALA修飾的脂質(zhì)體的制備
在玻璃試管中制備由EPC/Chol/CHEMS(摩爾比70:20:10)組成的脂質(zhì)薄膜，添加OVA (5mg/mL, IOmM HB)，使脂質(zhì)濃度為10mM，然后在室溫下水合15分鐘。水合后渦旋混合，轉(zhuǎn)移至15mL錐形管中，進行5次冷凍融解。用400nm的膜濾器擠出，超離心(43，OOOrpm,40C，30分鐘)，除去上清，然后將沉淀用200 μ L HBG溫和洗滌，再次懸浮于適量的HBG中。按照下述順序?qū)VA濃度和脂質(zhì)濃度進行定量。在用于試驗之前添加脂質(zhì)摩爾濃度的7. 5%的STR-R8 (10mg/mL)或STR-KALA (10mg/mL)，在室溫下溫育30分鐘以上，由此制備R8_Lip和 KALA-Lip。R8-Lip 的粒徑為 189. 5nm, PDI 為 O. 095，ζ 電位為 47. 8mV ;R8_Lip 的粒徑為 188. 4nm, PDI 為 O. 317，ζ 電位為 33. 7mV。將25 μ L脂質(zhì)體溶液和校正曲線用的OVA用無菌水稀釋，制成lmL，在其中添加100 μ L O. 15%脫氧膽酸鈉,然后在室溫下溫育10分鐘。添加100 μ L 72%三氯乙酸,離心(3，500rpm, 4°C，20-30 分鐘)，除去上清。將所得沉淀溶解于 50 μ L O. 5% SDS-0.1N NaOH,添加ImL BCA測定試劑，按照方案進行定量。脂質(zhì)濃度是通過磷脂C-Test Wako (和光純藥工業(yè)制造)進行定量。(2)體內(nèi)CTL (細胞毒性T淋巴細胞)活性
對C57BL/6小鼠(雌性，7-9周齡)皮下給予包封有50 μ g OVA的R8_Lip或KALA-Lip(26G針)。免疫I周后給予按照以下方法制備的靶細胞。由頸椎脫臼的首次用于實驗的小鼠中摘除脾臟，在加入了 3-5mL RPMI1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中將細胞攪散，用2. 5mL注射器回收，然后過尼龍網(wǎng)布(nylon mesh)轉(zhuǎn)移至50mL錐形管中。離心(1600_1700rpm,4°C，5分鐘)后除去上清，在ImL ACK裂解緩沖液(Lonza, ffalkersville, MD)中懸浮，在室溫下溫育5分鐘，溶血。添加9mL RPMI1640培養(yǎng)基，然后離心，進一步用IOmL培養(yǎng)基洗滌，懸浮于20mL，過尼龍網(wǎng)布轉(zhuǎn)移至2支50mL錐形管中。計數(shù)細胞后離心，再次懸浮于培養(yǎng)基中(IO7個細胞/mL)。2支中的I支中添加0VA257_264肽(lmM，終濃度5 μ M)，將該細胞懸浮液在37 °C、5%C02的條件下溫育60分鐘。用IOmL培養(yǎng)基和IOmL PBS洗滌，然后將受OVA257^264肽脈沖的細胞組懸浮于5 μ M CFSE (分子探針)(CFES*)的PBS中，將未受脈沖的細胞組懸浮于含有O. 5μ M CFSE (CFESffi)的PBS中，濃度為3 X IO7個細胞/mL，在37°C下溫育10分鐘。用IOmL RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，用IOmL PBS洗滌2次后，最終懸浮于PBS (5 X IO7個細胞/mL)。在臨給予之前將以不同濃度染色的兩種細胞等量混合，由尾靜脈給予免疫的小鼠(I X IO7個細胞/200 μ L/小鼠，26G針)。給予靶細胞后20小時后摘除脾臟，將脾臟用上述方法溶血，然后用IOmLRPMI1640培養(yǎng)基和IOmL PBS洗滌，懸浮于5mL FACS緩沖液。將制備的細胞懸浮液過尼龍網(wǎng)布，轉(zhuǎn)移至FACS管中，通過流式細胞儀測定CFSE陽性細胞數(shù)。對于低濃度染色的細胞(CFSEffi)，分析7500個細胞。CTL活性是對CFSE胃和CFSEffi的細胞數(shù)進行比較來計算。試驗間的誤差通過首次接受實驗的小鼠中CFSE胃和CFSEffi之比來校正。結(jié)果如圖5所示。縱軸表示CTL活性，表示作為CTL的靶標的細胞(用0VA257_264肽脈沖的細胞組)中有多少％的細胞被殺死。靶細胞(CFSEs)對MHC I類呈遞OVA肽，因此，本評價中細胞殺傷效果是由于OVA特異性的CTL帶來的。RS-Lip顯示是可誘導特異性的MHC I類呈遞和體內(nèi)的抗腫瘤活性的載體(Nakamura, T.等 Mol. Ther. , 16，1507-1514 頁，2008)。如上述結(jié)果所示，在脂質(zhì)體表面通過代替R8來修飾KALA，CTL活性可見飛躍性提高。R8_Lip、KALA-Lip均未使用佐劑，但KALA-Lip的CTL活性與R8_Lip負載作為佐劑已知的含有CpG序列的寡核苷酸時的CTL活性相匹敵。該結(jié)果從功能面上支持了例4的結(jié)果，S卩，KALA具有高的佐劑功能。例6 :導入質(zhì)粒通過載體變異來增強KALA-MEND基因表達活性(a)各種質(zhì)粒DNA的制備 制作以下4種質(zhì)粒DNA (I)在質(zhì)粒DNA的王鏈上含有CpG序列、且在作為標記基因的螢光素酶序列的起始密碼子至終止密碼子之間也具有CpG序列的質(zhì)粒DNA(pcDNA3.1-Luc (+)，CpG序列合計425個)；(2)質(zhì)粒DNA的主鏈以及螢光素酶序列的起始密碼子至終止密碼子之間均不含有CpG序列的質(zhì)粒DNA (pCpGfree-Luc (O), CpG序列合計O個)；(3)質(zhì)粒DNA的主鏈上含有CpG序列、螢光素酶序列的起始密碼子至終止密碼子之間不含有CpG序列的質(zhì)粒DNA (pcDNA3.1-Luc (O)，CpG序列合計332個)；以及(4)質(zhì)粒DNA的主鏈不含有CpG序列、螢光素酶序列的起始密碼子至終止密碼子之間含有CpG序列的質(zhì)粒 DNA (pCpGfree-Luc (+)，CpG 序列合計 98 個)。在主鏈上含有CpG序列的表達質(zhì)粒DNA(上述⑴和(3))的構(gòu)建是使用購自Invitrongen公司的表達載體pcDNA3.1。由不含CpG序列的主鏈組成的表達質(zhì)粒DNA(上述(2)和(4))的構(gòu)建是使用購自Invivogen公司的表達載體pCpGfree-mcs。關(guān)于質(zhì)粒DNA(I)，含有含CpG序列的螢光素酶的DNA片段是通過Promega公司的PGL3-基礎(chǔ)載體的限制酶Hind ΙΙΙ/Xba I切斷獲得。將該片段導入到pcDNA3.1載體的Hind III / Xba I 位點上(pcDNA3.1-Luc (+))。關(guān)于質(zhì)粒DNA(2),是將pCpGfree-mcs的多克隆位點(BglI1-Kpn1-Eco01091-Nco1-NheI)用Bglll/Nhel處理，在該限制酶切位點插入具有互補的末端的雙鏈DNA片段，由此制作新的多克隆位點(BglIl-Pvul1-Nco1-Xba1-NheI)(pCpGfree-NEffmcs)(圖 6)。將用 pORF-Luc: : Sh- Δ CpG (invivogen 制造)的 Ncol/Nhel處理得到的不具有CpG序列的螢光素酶編碼基因?qū)氲絧CpGfree-NEWmcs的Ncol/Nhel位點(pCpGfree-Luc (+1))。由螢光素酶基因的密碼子起計數(shù)，本方法中制作的質(zhì)粒DNA在第12號后只具有I個CpG序列(圖7)。殘留CpG序列的除去是通過Dralll/Nhel處理，由pCpGfree-Luc (+1)切除含有終止密碼子以及CpG序列的序列部分，在該限制酶切位點插入具有互補的末端、且對CpG序列部分施加了變異的寡核苷酸，由此除去。此時，在緊隨終止密碼子之后存在的EcoRI位點置換為EcoRV位點(pCpGfree-Luc (O))(圖8)。關(guān)于質(zhì)粒DNA (3)，是在pcDNA3.1的BamHI/RV位點上插入由在質(zhì)粒DNA (2)的構(gòu)建中制作的pCpGfree-Luc (O)進行Bglll/EcoRV切割得到的不含CpG的螢光素酶基因來制作(pcDNA3.1-Luc(O))。關(guān)于質(zhì)粒DNA(4),是在pCpGfree-NEWmcs的PvuII/Xbal切斷位點上插入由在質(zhì)粒DNA⑴的構(gòu)建中制作的pcDNA3.1-Luc (+)通過Pmel/Xbal處理得到的螢光素酶編碼基因來制作(pCpGfree-Luc (+))。 (b)來自小鼠骨髓的樹突細胞(BMDC)的分離、誘導
由頸椎脫白的C57BL/6小鼠￠-8周齡)摘除股骨和頸骨，用70%乙醇輕度消毒，然后浸泡于PBS。將骨的兩端切斷，用裝有培養(yǎng)基的ImL注射器(26G針)將骨髓細胞擠出到RPMI1640培養(yǎng)基中。將細胞懸浮液過40 μ m的細胞濾器(FALCON)，轉(zhuǎn)移至50mL的錐形管中。離心(450g，4°C，5分鐘)后除去上清，輕叩使細胞分散，然后添加ImL ACK裂解緩沖液，混合，在室溫下靜置3-5分鐘。添加IOmL培養(yǎng)基，然后離心除去上清，進一步用IOmL培養(yǎng)基洗滌2次。接著，將細胞懸浮于IOmL培養(yǎng)基，添加到IOcm細胞培養(yǎng)皿(FALCON)中，在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)4小時以上。輕輕移液，只將懸浮細胞回收在50mL錐形管中，離心，除去上清，然后懸浮于IOmL培養(yǎng)基中計數(shù)。懸浮于培養(yǎng)基中，使其濃度為IXlO6個細胞/mL,添加GM-CSF (終濃度10ng/mL),然后在24孔板(Corning, NY)中每孔接種ImL,在37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)2天。2天后和4天后保留細胞的聚簇，除去懸浮細胞，然后添加ImL新的含GM-CSF的RPMI1640培養(yǎng)基。在GM-CSF存在下開始培養(yǎng)，將第6_8天的懸浮或弱貼壁細胞作為未成熟樹突細胞用于試驗。使用CDllc抗體(PE抗小鼠CDllc，克隆N418，BioLegend制造)評價，純度為85-90%。(c)KALA-MEND 的制備
將上述(a)所得的各種質(zhì)粒DNA溶解于IOmM HEPES緩沖液中，濃度為0. lmg/mL。邊攪拌邊在150 μ L 0. lmg/mL(10mM HEPES緩沖液)的魚精蛋白溶液中少量多次滴加共100 μ LpDNA溶液，制備魚精蛋白與pDNA的凝縮物(N/P比為2. 2)。將112. 5 μ L ImM DOPE 和 25 μ L ImM CHEMS 加入到玻璃試管中，使 DOPE CHEMS=9: 2。加入lmg/mL硬脂基化KALA (STR-KALA)，使其修飾量為總脂質(zhì)濃度的5%分量，進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，得到脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中添加凝縮物，使總脂質(zhì)濃度為0. 55mM，在室溫下靜置10分鐘，水合，然后用超聲波破碎儀進行I分鐘超聲波處理。進一步添加硬脂基化KALA (STR-KALA) (lmg/mL水溶液)，使其為總脂質(zhì)的5摩爾％，在室溫下靜置10分鐘。在R8-MEND 的制備中，將 112. 5μ L ImM DOPE 和 25 μ L ImM CHEMS 加入到玻璃試管中，使DOPE :CHEMS=9:2，然后進一步加入氯仿，使總量為200 μ L，用干燥器減壓干燥，餾去溶劑，得到脂質(zhì)膜。在該脂質(zhì)膜中添加凝縮物，使總脂質(zhì)濃度為0. 55mM，在室溫下靜置10分鐘，水合，然后用超聲波破碎儀進行I分鐘超聲波處理。進一步添加硬脂基化R8 (STR-R8)(2mg/mL水溶液)，使其為總脂質(zhì)的5摩爾％,在室溫下靜置10分鐘。
(d) BMDC中的基因表達活性的評價
將按照上述(b)所示的方法誘導的BMDC接種于24孔板，濃度為4X IO5個細胞/孔。將制備的MEND用RPMI 1640 (不含血清、不含抗生素)稀釋，使pDNA量為O. 4 μ g/孔，制備成500 μ L。在各孔中施加MEND溶液，在37°C、5%C02的環(huán)境下溫育。3小時后向各孔中添加500 μ L RPMI 1640(具有血清、抗生素)，再在21小時后測定螢光素酶活性。關(guān)于螢光素酶活性的測定，將懸浮的細胞群各回收到培養(yǎng)基中，離心(41，50(^，5分鐘)，除去上清，由此來收集。在殘留于各孔中的細胞、以及之前回收的懸浮細胞群中添加報道基因裂解緩沖液(IX)，將兩者混合，制成合計75yL，然后進行移液，在-80°C下冷凍。將-80°C下冷凍的樣品解凍后，使用細胞刮棒剝離細胞，回收到Eppendorf管中。將回收的細胞溶解液以15，OOOrpm,4°C,2分鐘離心分離，回收50 μ L上清。使用所得上清測定螢光素酶活性測定(RLU/mL)。進一步進行BCA法蛋白質(zhì)定量(mg/mL)，計算每單位蛋白質(zhì)量的螢光素酶活性(RLU/mg 蛋白)。結(jié)果如圖9所示。左圖表示使用在(a)中制作的(l)pcDNA3.1-Luc (+)和
(4)pCpGfree-Luc (O)時，R8-MEND、KALA-MEND 在 BMDC 中的基因表達活性。使用pCpGfree-Luc (O)時，R8-MEND、KALA-MEND均可見高的基因表達活性促進效果。特別是在KALA-MEND中包封(2)pCpGfree-Luc (O)時，表明能夠達到根據(jù)使用JAWS II的例2和3的結(jié)果認為的可抗原呈遞的基因表達水平(107RUL/mg蛋白左右)。只從插入片段((3); pcDNA3.1-Luc(O))中除去CpG序列時，未見基因表達的升高。而從主鏈一側(cè)((4) ; pCpGfree-Luc (+))除去CpG序列時，可見基因表達活性的促進。由此顯示，作為啟動子的選擇，小鼠CMV增強子與人延伸因子Ia核心啟動子的組合對于基因?qū)霕渫患毎行?。另外，完全除去?CpG序列的(2) pCpGfree-Luc (O)與(3)pCpGfree-Luc (+)比較，基因表達高，因此顯示，具有小鼠CMV增強子和人延伸因子I α核心啟動子、且完全除去了 CpG序列的質(zhì)粒DNA最適合于樹突細胞。例7 :癌癥預防疫苗效果
(a)不含CpG的OVA表達質(zhì)粒DNA的制備
設(shè)計全部除去了 CpG序列的抗原(OVA)基因序列(序列表的SEQ ID NO. 2所示的1161bp的DNA序列)，進行定制合成(TAKARA)。在pCpGfree-NEWmcs的多克隆位點中，將該序列亞克隆于 Ncol/Nhel 位點(pCpGfree-OVA (O))。(b)抗原(OVA)表達質(zhì)粒DNA的基因向BMDC的導入以及佐劑的刺激
將按照例6(b)所述方法分離、分化的樹突細胞接種于24孔板，濃度為4X IO5個細胞/孔。按照例6 (c)的方法制備使用不含CpG的OVA表達質(zhì)粒DNA (pCpGfree-OVA (O))制備的KALA-MEND。將MEND用RPMI 1640 (不含血清、不含抗生素)稀釋，使pDNA量為O. 4 μ g/孔，制備成500yL。在各孔中施加MEND溶液，在37 °C、5%C02的環(huán)境下溫育。3小時后向各孔中添加500 μ L RPMI 1640 (具有血清、抗生素)，再在21小時后回收細胞。將懸浮的細胞以及由于在PBS中移液而剝離的貼壁細胞集中，通過離心(4°C，500g，5分鐘)回收。以CpG寡核苷酸作為佐劑使BMDC活化時，在KALA-MEND的轉(zhuǎn)染之前，在RPMI1640(不含血清、不含抗生素)中，以I μ g/mL的濃度與BMDC溫育I小時。(C)抗腫瘤效果的評價
在移植表達抗原(OVA)的腫瘤細胞(E.G7-0VA細胞)的14天前、7天前，制備(I)僅使DC的佐劑CpG作用的BMDC，(2)使用KALA-MEND使非抗原蛋白螢光素酶表達的BMDC，(3)使用KALA-MEND使抗原蛋白(OVA)表達的BMDC，(4)使用KALA-MEND使抗原蛋白(OVA)表達、且通過CpG佐劑活化的BMDC，使其濃度為4 X IO5個細胞/40 μ L PBS，將其總量給予C57BL/6小鼠(雌性，8周齡)的足底。自第2次免疫I周后，將8Χ105個E.G7-0VA細胞移植至左側(cè)腹，隨時間測定腫瘤體積。腫瘤體積(mm3)通過長徑X短徑X短徑X0. 52的公式計算。結(jié)果示于圖10。與給予PBS的對照組比較，通過CpG序列施加佐劑刺激，可見腫瘤增殖減少，不過顯然的是，該效果在KALA-MEND (非抗原蛋白，表達螢光素酶)中較高，這支持了例4和5的KALA-MEND自身具有高的佐劑效果這樣的結(jié)果。不管有無佐劑CpG，通過使用KALA-MEND導入OVA表達質(zhì)粒DNA，可見幾乎同等的極高的腫瘤預防效果。由此表明，KALA-MEND可以使BMDC具有足夠顯示細胞毒活性的抗原表達水平，同時也具有佐劑效果。例8 :腫瘤增殖抑制效果
(a)抗原(OVA)表達質(zhì)粒DNA的基因向BMDC的導入
按照例6(b)所述方法將分離、分化的樹突細胞接種于24孔板，濃度為4X IO5個細胞/孔。按照例6 (c)的方法制備使用不含CpG的OVA表達質(zhì)粒DNA (pCpGfree-OVA (O))制備的KALA-MEND。將MEND用RPMI 1640 (不含血清，不含抗生素)稀釋，使pDNA量為O. 8 μ g/孔，制備成500yL。在各孔中施加MEND溶液，在37 °C、5%C02的環(huán)境下溫育。3小時后向各孔中添加500 μ L RPMI 1640 (具有血清、抗生素)，再在21小時后回收細胞。將懸浮的細胞以及由于在PBS中移液而剝離的貼壁細胞集中，通過離心(4°C，500g，5分鐘)回收。(b)抗腫瘤效果的評價
將8X IO5個表達抗原(OVA)的腫瘤細胞(E. G7-0VA細胞)移植于C57BL/6小鼠(雌性，8周齡)的左側(cè)腹，在第15天和第22天，將(I)未處理的BMDC，⑵使用KALA-MEND使非抗原蛋白螢光素酶表達的BMDC，(3)使用KALA-MEND使抗原蛋白(OVA)表達的BMDC懸浮于40yL PBS中，內(nèi)含4 X IO5個BMDC，給予足底。在不同時間下測定腫瘤體積，腫瘤體積(mm3)通過長徑X短徑X短徑X0. 52的公式計算。未處理的DC和表達非抗原蛋白的BMDC中未見抗腫瘤效果,但對于表達OVA的KALA-MEND,與未處理小鼠比較，可見優(yōu)異的抗腫瘤增殖效果。因此表明，KALA-MEND即使在產(chǎn)生腫瘤后給予也可獲得抗腫瘤效果。產(chǎn)業(yè)實用性
本發(fā)明所提供的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體具有以下特征可以高效率地轉(zhuǎn)運至包括樹突細胞在內(nèi)的免疫細胞等任意細胞的核內(nèi)，可將包封的核酸等物質(zhì)高效率釋放至核內(nèi)，以表達由該核酸編碼的多肽，并且也可以發(fā)揮高效率的佐劑效果，因此可以進行對所需多肽有效的免疫療法。
權(quán)利要求
1.脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于將物質(zhì)送達至細胞的核內(nèi)，脂質(zhì)膜用下述(a)和/或(b)的多肽修飾 (a)由SEQID NO:1的氨基酸序列組成的多肽； (b)由在SEQID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽，該多肽具有促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性。
2.權(quán)利要求1的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體為脂質(zhì)體。
3.權(quán)利要求1或2的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，細胞為免疫細胞。
4.權(quán)利要求1-3中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，上述(a)和/或(b)的多肽被疏水性基團修飾，所述疏水性基團插入到脂質(zhì)膜中。
5.權(quán)利要求1-4中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在表面具有含連續(xù)的多個精氨酸殘基的多肽。
6.權(quán)利要求1-5中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在表面具有聚亞燒基~■醇。
7.權(quán)利要求1-6中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于將編碼要在免疫細胞表面呈遞的抗原多肽的核酸導入所述細胞的核內(nèi)。
8.權(quán)利要求1-7中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在內(nèi)部包封有要送達的物質(zhì)。
9.權(quán)利要求8的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體在內(nèi)部包封了核酸和陽離子性聚合物。
10.權(quán)利要求8或9的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，要送達的物質(zhì)是編碼要在免疫細胞表面呈遞的抗原多肽的核酸。
11.權(quán)利要求10的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體用于對所述抗原多肽的免疫療法。
12.權(quán)利要求10或11的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，其中，所述核酸為DNA，所述DNA為不含有CpG的 DNA。
13.藥物組合物，所述藥物組合物含有權(quán)利要求8-12中任一項的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體作為有效成分。
14.權(quán)利要求13的藥物組合物，其中，所述藥物組合物用于惡性腫瘤的預防和/或治療。
15.多肽，所述多肽用于促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)的轉(zhuǎn)運，是下述(a)和/或(b)的多肽 (a)由SEQID NO:1的氨基酸序列組成的多肽； (b)由在SEQID NO:1的氨基酸序列中有I個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于將物質(zhì)送達至細胞核內(nèi)的脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體，該脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體可以將核酸高效率地送達至樹突細胞等免疫細胞的核內(nèi)，脂質(zhì)膜用多肽修飾，該多肽為(a)由SEQIDNO:1的氨基酸序列組成的多肽；和/或(b)由在SEQIDNO:1的氨基酸序列中有1個或數(shù)個氨基酸缺失和/或置換和/或插入的氨基酸序列組成的多肽，其具有促進脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)體向細胞的核內(nèi)轉(zhuǎn)運的活性。
文檔編號A61K31/711GK103037840SQ20118001991
公開日2013年4月10日 申請日期2011年4月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者原島秀吉, 秋田英萬, M.S.沙里夫, 中村孝司, 石井聰一郎, 二木史朗 申請人:國立大學法人北海道大學