脂質(zhì)膜包封的具有膜蛋白的粒子的制作方法
【專利說明】脂質(zhì)膜包封的具有膜蛋白的粒子
[0001] 本發(fā)明設(shè)及模型脂質(zhì)雙層和在其中支撐的膜蛋白。
[0002] 膜蛋白在每個活細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用，該由生物的編碼膜蛋白的大量基因體現(xiàn)。 20-30%的生物基因編碼膜蛋白。該些蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝例如細(xì)胞-細(xì)胞相互作用、信號轉(zhuǎn) 導(dǎo)和離子及養(yǎng)分運輸中的關(guān)鍵因素。因此，膜蛋白是約60%的全部藥物的祀。然而，膜蛋白 的機理性細(xì)節(jié)有時難W獲得，尤其是當(dāng)不可忽略膜/水界面的作用時。已經(jīng)開發(fā)了生物模 擬膜系統(tǒng)，從已經(jīng)重構(gòu)有膜蛋白的脂質(zhì)體至平面狀脂質(zhì)雙層或束縛的雙層脂質(zhì)膜。
[0003] 與生物學(xué)中的該種基本職能相反，實驗性技術(shù)仍難W接近膜蛋白。難W進行膜蛋 白的結(jié)構(gòu)及功能表征，原因在于它們的兩性特性。實驗挑戰(zhàn)在于，一旦它們從天然脂質(zhì)雙層 取出并在去垢劑的輔助下溶解，膜蛋白對變性敏感。為了模擬天然脂質(zhì)環(huán)境，將溶解的膜蛋 白再整合（重構(gòu)）在人工脂質(zhì)雙層或脂質(zhì)類似物中。
[0004] 生物膜的各種模型系統(tǒng)解決了該個問題。將溶解的膜蛋白純化并重構(gòu)；即，再整合 在模擬質(zhì)膜中其天然環(huán)境的（人工）脂質(zhì)雙層中。在經(jīng)典脂質(zhì)體系統(tǒng)中，脂質(zhì)雙層包圍一 個內(nèi)腔。因此當(dāng)需要控制內(nèi)區(qū)室的內(nèi)容物或溶質(zhì)濃度時，實驗難題出現(xiàn)。對于施加限于通 過使用離子特異性離子載體生成擴散電勢的跨膜電位而言，同樣如此。
[0005] 已經(jīng)應(yīng)用幾種在固相支持物上的重構(gòu)策略，如向雜合脂質(zhì)雙層膜插入鏈燒 硫醇和磯脂的自裝配單層、束縛的脂質(zhì)雙層膜（Knoll等人，ReviewsinMolecular Biotechnology74(2000) 137)、聚合物膜和Langmuir-Blodgett薄膜。
[0006] 為了控制固定化膜蛋白的取向，Giess炬iophys.J. 87,（2004)，3213-3220)和 Ataka等人（J.Am.Chem.Soc. 2004, 126, 16199-16206)公開了借助His標(biāo)簽和Ni-次氮基S 己酸（NTA)部分在表面上固定膜蛋白并在脂質(zhì)環(huán)境中通過原位透析進一步重構(gòu)溶解的蛋 白質(zhì)。
[0007] 公開W0 2008/118688A2披露了一種穩(wěn)定的、支撐的脂質(zhì)雙層膜，其中膜通過固定 至表面上的固醇分子穩(wěn)定化。在制造該種膜期間，第一固醇分子固定在表面上并且隨后用 膜溶液重構(gòu)膜。膜溶液可W含有膜蛋白。該些膜模型存在W下問題；分子在膜中的活動性 低和膜下缺少任何含水層，而該通常是天然膜蛋白活性和行為所必需的。
[0008] JP2011/027632A描述了具有脂質(zhì)雙分子膜的生物巧片，所述脂質(zhì)雙分子膜W基 底上親水性部分和疏水性部分的一種樣式固定到基底上。
[0009] US2008/0304068A1設(shè)及具有層狀設(shè)置的蛋白質(zhì)生物巧片，所述層狀設(shè)置包含金 屬層和任選地在有源層上的脂質(zhì)雙層膜。如W0 2008/118688A2所提到，該種設(shè)置不合適 研究膜蛋白并且在W下問題；蛋白質(zhì)的活動性低和缺少含水層。
[0010] W0 99/10522A1設(shè)及基于磯脂酷膽堿、磯脂酷絲氨酸、磯脂酷己醇胺和銷磯脂的 不同人工膜及用于分析藥物化合物結(jié)合行為的檢驗。其公開內(nèi)容缺少整合至膜中的膜蛋 白。
[0011] W0 9610178A1設(shè)及一種通過微團或小泡與膜融合將來自微團或小泡的膜蛋白插 入平面狀脂質(zhì)膜的方法，其中融合由可W與微團或小泡共價結(jié)合的膜的官能團介導(dǎo)。
[0012] US7, 939, 270設(shè)及用膜蛋白（如孔蛋白或通道蛋白）探測固體表面上的平面狀脂 質(zhì)膜，因而將該蛋白質(zhì)插入膜中，并檢測插入。US6, 440, 736提供向細(xì)胞或細(xì)胞膜人工插入 膜蛋白的又一個方法。
[0013] CA1243946A1描述一種抗原/脂質(zhì)體綴合物，其中蛋白質(zhì)抗原與脂質(zhì)體小泡的 脂質(zhì)分子共價結(jié)合。W0 01/06007A2提供一種用于研究和表征受體的微泡系統(tǒng)。脂質(zhì)體小 泡和微泡存在穩(wěn)定性比固體表面結(jié)合的膜低的問題，特別地在操作膜蛋白期間。
[0014] W0 2009/117370A1描述了膜包覆的粒子。該膜是包含膜蛋白的天然細(xì)胞膜，所述 膜蛋白至少部分地處于如細(xì)胞中存在那樣的天然取向。將膜包覆的粒子描述為適于高通量 讀出、尤其在配體結(jié)合測定中適于高通量讀出的一批次相似或幾乎相同的細(xì)胞膜顯示器。 但是使用細(xì)胞膜（在該種情況下CK)細(xì)胞的細(xì)胞膜）是耗時的，需要分離生物細(xì)胞膜，該可 能在不同目的蛋白的測定中造成對膜組分的不利影響。另外，膜無法在粒子上穩(wěn)定化，該可 能造成進一步的分析不精確。
[0015] US7, 205, 099B2設(shè)及一種在包覆到扁平固相支持物上的人工脂質(zhì)雙層中研究鐘 離子通道的方法。
[0016] W0 2002/072873A1描述了適用于表面等離子體共振光譜法的向傳感器表面上固 定蛋白質(zhì)的過程，其中將脂質(zhì)膜重構(gòu)到內(nèi)嵌預(yù)固定化膜蛋白的表面上。通過緩慢移除去垢 劑分子，將膜的脂質(zhì)分子作為去垢劑懸浮的微團沉積。W0 2010/091293A1中描述了相似的 系統(tǒng)，其中Ag粒子在膜包覆之前進一步沉積到表面上。
[0017] W0 2007/122259A1提供表面官能化的金納米粒子，同時共價連接的間隔分子本 身W立體特異性方式與蛋白質(zhì)連接，從而確保粒子結(jié)合的蛋白質(zhì)的受控取向。
[001引W0 02/056831A2、W0 01/49265A1 和出版物Mirz油ekov等人，化Uire Biotechnology200 (18) : 649-654 (2000)、B油cock等人，JBC276 (42) : 38433-38440 (2001) 和GruiKlner等人，JournalofVirolog}r76(7):3511-3521 (2002)描述了球狀或楠球狀順 磁性蛋白脂質(zhì)體，其含有純的、天然的和定向的走次跨膜區(qū)段免疫原性蛋白，如HIV表面蛋 白、CCR5或CXCR4。免疫原性蛋白借助抗體結(jié)合到順磁粒子上。
[0019] Nordlund等人，ACSNANO3(9) (2009) : 2639-2646 設(shè)及被脂質(zhì)雙層包封的多孔二 氧化娃粒。在產(chǎn)生脂質(zhì)包膜的制造期間，二氧化娃粒子用小泡處理，所述粒子與粒子接觸時 開放并在粒子上形成一個層。
[0020] 化arma等人，BioconjugateQiemistry15 (4) (2004) : 942-947 描述了在鏈霉親 和素包覆的二氧化娃微球上固定的生物素-PEG3400-細(xì)菌視紫紅質(zhì)綴合物。
[0021] aiong等人，Langmuir29(1) (201：3) : 299-307 描述 了用陽G接頭（即 畑S-PEGsooo-N服）修飾的二氧化娃微球，其中所述陽G接頭與膜錯定域膚KsA山A山A3K2-FITC 連接。
[0022] 本發(fā)明的目的是提供包含膜蛋白的改進模型脂質(zhì)膜，所述改進的模型脂質(zhì)膜允許 在膜環(huán)境內(nèi)快速而可靠地檢測所述蛋白質(zhì)的活性。
[0023] 該目的通過權(quán)利要求的主題得W實現(xiàn)。具體地，本發(fā)明提供一種納米化或微米化 粒子，所述粒子包含固定到粒子表面上的膜蛋白和一層在膜蛋白之間占據(jù)（interspaced) 并包封所述粒子的脂質(zhì)雙層，其中所述膜蛋白通過長度最多5. 5nm的接頭分子固定到粒子 表面上。本發(fā)明和其優(yōu)選實施方案在權(quán)利要求中進一步限定。應(yīng)當(dāng)指出，如相對于下文中 的優(yōu)選實施方案而言所解釋那樣，可W修改各種結(jié)構(gòu)性組分和參數(shù)，其中如本領(lǐng)域技術(shù)人 員應(yīng)當(dāng)明白，該些實施方案的每一個當(dāng)然可w與其他優(yōu)選實施方案組合。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，發(fā)現(xiàn)可W使用膜蛋白作為脂質(zhì)雙層的錯定物形成穩(wěn)定的脂質(zhì)粒子。
[002引選擇相對短（例如長度最多5. 5nm)的接頭分子（與具有12nm長度的如W0 02/056831A2中公開的抗體接頭相比短）進一步實現(xiàn)了受控環(huán)境的益處，所述益處允許在 不需要額外的脂質(zhì)分子結(jié)合基序的情況下構(gòu)建流動性和穩(wěn)定性改善的平衡型脂質(zhì)膜，該轉(zhuǎn) 而允許改善的和可重復(fù)的蛋白質(zhì)活性測量。作為又一個優(yōu)點，接頭部分不僅在長度方面受 限，它們還具有更小橫向尺度（明顯小于結(jié)合的蛋白質(zhì)），從而允許水分子進入粒子和蛋白 質(zhì)之間的空間一一W及脂質(zhì)層，該有利于具有"胞內(nèi)部分"（其可W置于粒子和脂質(zhì)層之間 的空間）的全部膜蛋白并且是離子運輸及因此評估作為膜蛋白的離子通道的活性的必需 前提。因此，離子也可W按受控方式引入粒子表面和脂質(zhì)層之間的空間。另外，有機小接頭 允許使用充分建立的蛋白質(zhì)標(biāo)簽技術(shù)，例如鏈霉親和素-標(biāo)簽或化S標(biāo)簽技術(shù)W高效地固 定膜蛋白。該類標(biāo)簽的組合可W進一步用來W限定的方式控制兩種或更多種膜蛋白的濃 度。
[0026] 此外，本發(fā)明的小接頭分子對大得多的膜蛋白的取向控制增加。根據(jù)本發(fā)明，膜蛋 白的均一結(jié)合作用和取向是可能的，該增加膜穩(wěn)定性。增加的穩(wěn)定性還允許冷凍后用水重 構(gòu)。
[0027] 可W通過接頭分子的拉伸構(gòu)型估計接頭分子的長度，所述拉伸構(gòu)型W例如接頭 分子的空間填充模型可視化（例如，如Nowak等人，J.ofSolidStateElectrochemist ry, (2011) 15:105-114 中對蛋白質(zhì)所不和在Naumann等人，Langmuir2003, 19, 5435-5443 中對脂質(zhì)所示）。優(yōu)選的長度是最多5. 25nm、最多5nm、最多4. 75nm、最多4. 5nm、最多 4. 25皿、最多4皿、最多3. 75皿、最多3. 5皿、最多3. 25皿或最多3皿。其他接頭長度包括最 多6nm、最多6. 5nm、最多7nm、最多7. 5nm或最多8nm。
[0028] 接頭分子的橫向尺度是優(yōu)選地最多3nm、優(yōu)選地最多2. 5nm、特別優(yōu)選的最多2nm、 甚至更優(yōu)選地最多1. 5nm、特別優(yōu)選最多Inm或甚至最多0. 75nm。更小的橫向尺度導(dǎo)致水 進入粒子表面和脂質(zhì)層之間的空間增加。任何的該些橫向尺度可W與上文提到的任一個長 度組合，例如具有最多5皿或最多6皿長度和最多1皿橫向尺度的接頭分子。連同垂直于 長度的橫向尺度、接頭分子占據(jù)的體積，長度限定了朝向膜蛋白的距離。橫向尺度小于所述 長度。
[0029] 優(yōu)選地，包含小的間隔物（spacer)部分的粒子允許在粒子表面和蛋白質(zhì)/脂質(zhì)層 之間容納穩(wěn)定性雙層脂質(zhì)膜所必需的含水層。優(yōu)選地，粒子在脂質(zhì)雙層包膜和粒子表面之 間包含親水性（優(yōu)選地含水的）溶劑。本發(fā)明的包封粒子可W用來在天然環(huán)境下研究膜蛋 白，其中脂質(zhì)雙層內(nèi)部的空間模擬細(xì)胞或細(xì)胞區(qū)室。對于該類研究，膜蛋白優(yōu)選地從內(nèi)向外 取向，如天然環(huán)境中那樣?？蒞通過將膜蛋白固定在一側(cè)上（例如胞質(zhì)側(cè)），一致地控制該 種取向。當(dāng)然，還可能將膜蛋白固定在蛋白質(zhì)跨膜域的另一側(cè)上，例如"內(nèi)面向外"。膜蛋白 可W固定至粒子表面特定位點，即，一個特定氨基酸區(qū)域一致地與粒子表面結(jié)合，例如標(biāo)簽 如His標(biāo)簽，所述氨基酸區(qū)域置于膜蛋白分子上的相同位點處。可用的位點修飾可W在氨 基酸殘基如化e、Tyr、T巧、Arg、His、Lys、Asp、Glu、Ser、Asn、Gin、切S、Pro、Met的N末端 或任何其他官能團上。膜蛋白固定至粒子表面可W是側(cè)面特異的，即，膜蛋白的在細(xì)胞中其 天然環(huán)境下面向特定生物學(xué)區(qū)室（例如胞質(zhì)側(cè)、邸腔、小泡內(nèi)部、胞核內(nèi)部、高爾基體腔、線 粒體內(nèi)部、葉綠體內(nèi)部等）的相同側(cè)面相對于粒子表面上的膜蛋白一致地取向（向外/向 內(nèi)）。
[0030] 本發(fā)明的粒子是納米或微米規(guī)格的，該允許通過脂質(zhì)雙層穩(wěn)定包封。在優(yōu)選的實 施方案中，粒子的尺寸在5皿至1mm、優(yōu)選30皿至900ym、或200皿至800ym、優(yōu)選800皿 至600ym、特別優(yōu)選1. 5ym至500ym、甚至更優(yōu)選10ym至200ym的范圍內(nèi)。優(yōu)選地，粒 子是納米粒子（尺寸小于lOOOnm)或微粒子（大小至少是1ym)。在納米粒子的優(yōu)選實施 方案中，尺寸是最多900皿、最多750皿、最多600皿、最多500皿最多400nm或最多300皿。 一個特別優(yōu)選的范圍是5nm至lOOnm，尤其lOnm至60nm，該導(dǎo)致與納米粒子相關(guān)的光學(xué)效 應(yīng)，如因結(jié)合配體所致的自發(fā)巧光或光譜變化。
[0031] 優(yōu)選地，所述接頭具有至少0. 5皿、優(yōu)選地至少1皿、特別優(yōu)選的至少1. 2皿、至少 1. 4nm、至少1.6nm、至少1.8nm或至少2nm的長度。較長的接頭允許膜蛋白距粒