用于消耗靶膜蛋白的組合物的制作方法
【專利摘要】一種消耗靶膜蛋白的組合物，其包含結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的第一結(jié)合域和結(jié)合靶膜蛋白的第二結(jié)合域，其中所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白與靶膜蛋白所在的細(xì)胞膜部位結(jié)合，且當(dāng)該二元結(jié)合分子的第一結(jié)合域結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白時(shí)內(nèi)在化到細(xì)胞中并降解；以及相關(guān)的方法和用途。
【專利說明】用于消耗靶膜蛋白的組合物
[0001] 發(fā)明背景
[0002] 1.發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明提供了一種用于消耗靶膜蛋白的組合物以及相關(guān)方法和用途，所述組合物 包含與驅(qū)動(dòng)物膜蛋白結(jié)合的第一結(jié)合域和與靶膜蛋白結(jié)合的第二結(jié)合域，其中當(dāng)二元結(jié)合 分子的第一結(jié)合域結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白時(shí)，所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白與靶膜蛋白所在的 細(xì)胞膜結(jié)合，內(nèi)化到細(xì)胞中并降解。
[0004] 2.相關(guān)技術(shù)的描述
[0005] 膜蛋白與細(xì)胞或細(xì)胞器的膜結(jié)合或與其關(guān)聯(lián)，并根據(jù)其定位展現(xiàn)它們自身的特征 性功能。對(duì)膜蛋白功能的研究主要依賴于用SiRNA去干擾感興趣蛋白的表達(dá)。然而,通過 用SiRNA干擾蛋白表達(dá)來研究膜蛋白的功能是有局限的。
[0006] -種鑒別膜蛋白功能的更有利途徑是蛋白在膜中正常表達(dá)和定位后將其除去。例 如，作為癌細(xì)胞相關(guān)膜蛋白已知的58種不同的受體酪氨酸激酶（RTKs)共享一種非常常見 的結(jié)構(gòu)。這些RTK蛋白根據(jù)其與配體的結(jié)合而形成同二聚體或異二聚體，并通過與各種膜 蛋白或細(xì)胞內(nèi)蛋白的相互作用參與信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而導(dǎo)致包括細(xì)胞增殖、分化、遷移、存 活、附著和代謝在內(nèi)的各種作用。也就是說，膜蛋白展現(xiàn)其自身的功能，例如，僅僅當(dāng)其在膜 中正常表達(dá)和定位后才從細(xì)胞外基質(zhì)向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。
[0007] 如上所述，膜蛋白的功能主要通過使用SiRNA來進(jìn)行研究，但其具有加諸其上的 限制，且由于膜蛋白的特征性功能大大受制于其在細(xì)胞中的定位，優(yōu)選并需要膜蛋白在膜 中正常表達(dá)和定位后將其消耗掉。具體地，消耗靶膜蛋白的方法如果能消耗質(zhì)膜上的靶特 異性蛋白，就可以象siRNA技術(shù)一樣被普遍采用。
[0008] 因此，需要用于消耗正常表達(dá)和定位的膜蛋白包括RTK的技術(shù)，其將用于膜蛋白 精確功能的分析和膜蛋白的有效調(diào)節(jié)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N消耗靶膜蛋白的組合物，所述組合物包含二元結(jié)合分子，所述 二元結(jié)合分子包含與驅(qū)動(dòng)物膜蛋白結(jié)合的第一結(jié)合域和與靶膜蛋白結(jié)合的第二結(jié)合域，其 中當(dāng)二元結(jié)合分子的第一結(jié)合域結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白時(shí)，所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白與細(xì) 胞膜上靶膜蛋白所在的部位結(jié)合，內(nèi)化到細(xì)胞中并降解。
[0010] 本申請(qǐng)還提供了用于治療或預(yù)防癌癥的包含二元結(jié)合分子的組合物。在相關(guān)的方 面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝硕Y(jié)合分子以及包含所述二元結(jié)合分子的藥物組合物。
[0011] 附圖簡(jiǎn)述
[0012] 圖1是說明靶膜蛋白消耗機(jī)制的示意圖。
[0013] 圖2是說明質(zhì)膜中靶膜蛋白消耗的示意圖。
[0014] 圖3是說明膜蛋白消耗系統(tǒng)中用到的組分（雙特異性抗體：BsAb)的示意圖。
[0015] 圖4是說明抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體對(duì)MKN45胃癌細(xì)胞中降解的c-Met 的活性的曲線圖（Y-軸：c-Met相對(duì)于對(duì)照（培養(yǎng)基）的相對(duì)水平；X-軸：L3-1Y IgG2: 抗-c-Met 抗體，ME-Ol 和 ME-03:抗-c-Met/ 抗-EGFR 雙特異性抗體，MH2-01:抗-c-Met/ 抗-HER2雙特異性抗體）.
[0016] 圖5是顯示抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體誘導(dǎo)的MKN45胃癌細(xì)胞中EGFR降 解的熒光圖像（黃色：抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體；紅色：抗-c-Met抗體；綠色： 抗-EGFR抗體）。
[0017] 圖6是比較用抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體處理的MKN45胃癌細(xì)胞和用 抗-EGFR抗體單獨(dú)或與抗-c-Met抗體組合處理的細(xì)胞之間的EGFR的細(xì)胞內(nèi)化或降解的熒 光圖像（黃色：抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體；紅色：抗-c-Met抗體；綠色：抗-EGFR 抗體）。
[0018] 圖7是比較用抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體處理的MKN45胃癌細(xì)胞和用 抗-c-Met抗體單獨(dú)或與抗-EGFR抗體（抗EGFR ab或Erbitux (愛必妥））組合處理的細(xì) 胞之間的EGFR的細(xì)胞內(nèi)化或降解的熒光圖像（黃色：抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體； 紅色：抗-c-Met抗體；綠色：抗-EGFR抗體）。
[0019] 圖8是比較用抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體處理的MKN45胃癌細(xì)胞和用 抗-c-Met抗體或抗-EGFR抗體（抗EGFR ab)單獨(dú)或其組合處理的細(xì)胞之間的EGFR的細(xì) 胞內(nèi)化或降解的熒光圖像（黃色：抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體；紅色：抗-c-Met抗 體；綠色：抗-EGFR抗體）。
[0020] 圖9顯示用抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體處理后經(jīng)Western印跡測(cè)量的MKN45 胃癌細(xì)胞（上圖）和EBC-I肺癌細(xì)胞（下圖）中EGFR的總水平和EGFR活性。
[0021] 圖10顯示用抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體處理后經(jīng)Western印跡測(cè)量的具 有低表達(dá)水平c-Met的A431癌細(xì)胞中EGFR的總水平和EGFR活性。
[0022] 圖11顯示經(jīng)Western印跡測(cè)量的野生型HCC827肺癌細(xì)胞和HCC827耐厄洛替尼 細(xì)胞（HCC827ER)中c-Met對(duì)EGFR降解的影響。
[0023] 圖12顯示經(jīng)Western印跡測(cè)量的MKN45胃癌細(xì)胞中抗-c-Met/抗-Her2雙特異 性抗體所致的HER2-特異性降解。
[0024] 圖13的熒光圖像顯示，在低水平表達(dá)c-Met的A549癌細(xì)胞中，當(dāng)過表達(dá)c-Met后， c-Met對(duì)于抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體誘導(dǎo)的EGFR降解的影響。
[0025] 圖14的熒光圖像顯示，在低水平表達(dá)c-Met的HeLa細(xì)胞中，當(dāng)過表達(dá)c-Met后， c-Met對(duì)于抗-c-Met/抗-EGFR雙特異性抗體誘導(dǎo)的EGFR降解的影響。
[0026] 圖15包括多個(gè)顯示huAbF46抗體表位作圖的ELISA結(jié)果的曲線圖。
[0027] 圖16是huAbF46抗體的示意圖，顯示了該抗體SEMA域上的表位位置。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 本申請(qǐng)的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于靶特異性細(xì)胞膜蛋白消耗的組合物，其包含與 驅(qū)動(dòng)物膜蛋白結(jié)合的第一結(jié)合域和與靶膜蛋白結(jié)合的第二結(jié)合域。
[0029] 二元結(jié)合分子通過其第一和第二結(jié)合域同時(shí)結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白。一旦 與二元結(jié)合分子結(jié)合，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白被觸發(fā)而發(fā)生胞吞，隨后結(jié)合的靶膜蛋白向細(xì)胞內(nèi)遷 移，這些蛋白最終在細(xì)胞內(nèi)部被降解（參見圖1和2)。
[0030] 圖1的示意圖舉例說明了根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案的膜蛋白消耗技術(shù)。在圖1中，當(dāng) 將能夠識(shí)別靶膜蛋白并同時(shí)結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的二元結(jié)合分子應(yīng)用到在其膜中含有靶物 (target)和驅(qū)動(dòng)物（driver)的那些細(xì)胞時(shí)，二元結(jié)合分子的結(jié)合作為觸發(fā)因素而啟動(dòng)胞 吞和降解。
[0031] 圖2的示意圖舉例說明根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案以靶特異性方式消耗靶膜蛋白的機(jī)制。 雖然質(zhì)膜中存在各種蛋白，但二元結(jié)合分子對(duì)靶是特異性的而無需與其它膜蛋白相互作 用，由此觸發(fā)僅是靶蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白的內(nèi)化和降解。
[0032] 本申請(qǐng)中所用的術(shù)語"驅(qū)動(dòng)物膜蛋白"是指用于通過與二元結(jié)合分子的相互作用 將靶膜蛋白運(yùn)輸至細(xì)胞內(nèi)的蛋白。
[0033] 驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是通過與配體、抗體或其它蛋白或肽的相互作用（例如，結(jié)合） 而經(jīng)受內(nèi)化的任何蛋白。類似地，靶膜蛋白可以是位于細(xì)胞膜上的、當(dāng)通過二元結(jié)合分子 與驅(qū)動(dòng)物蛋白連接時(shí)可被內(nèi)化的任何蛋白。驅(qū)動(dòng)蛋白和靶蛋白可獨(dú)立地選自受體、通道蛋 白、膜酶、脂蛋白、整聯(lián)蛋白（integrins)、細(xì)胞表面上的各種標(biāo)志物等。例如，驅(qū)動(dòng)物膜蛋 白和靶膜蛋白可獨(dú)立地選自受體酪氨酸激酶（例如，c-Met蛋白、c-Met蛋白突變體、EGFR、 HER2、HER3、VEGFR、PDGFR、IGFlR、印hrin受體、FGFR等）、整聯(lián)蛋白、NMDA受體、G-蛋白偶 聯(lián)受體（GPCR)、運(yùn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白（LDL)受體、分化抗原簇或指定簇（clusters of designation) (CDs)(例如，CDlla、CD20、CD3、CD33、CD44、CD59、CD73、CD152(CTLA4) 等）、NTRK2(神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶）、外周膜蛋白、四穿膜區(qū)蛋白（tetraspanins)(例 如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、 Tspan3、TM4B等）和可通過抗體結(jié)合而被內(nèi)化的用于抗體藥物偶聯(lián)物（ADC)的膜靶標(biāo)（參 考文獻(xiàn)：2013Nature Reviews Drug Discoveryl2:330,將其引入本申請(qǐng)作為參考）（例如， CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、葉酸受體 1、 CD37、粘蛋白 16、ETB、STEAPl、CD70、SLC44A4、柄蛋白（Nectin) 4、AGS-16、鳥苷酰環(huán)化酶 C、 粘蛋白l、EGFRvIII、間皮素等）。
[0034] 在一個(gè)實(shí)施方案中，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是當(dāng)其細(xì)胞外域與配體或抗體結(jié)合時(shí)可被 內(nèi)化至細(xì)胞中的任何蛋白?？商鎿Q地，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是經(jīng)過改造而能在與配體或抗體 相互作用后被胞吞而野生型則不能的突變體。
[0035] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是位于或被引入細(xì)胞膜上靶膜蛋白所處 部位的蛋白。驅(qū)動(dòng)物膜蛋白因二元結(jié)合分子的第一結(jié)合域與其結(jié)合而被觸動(dòng)，從而被內(nèi)化 至細(xì)胞中并被降解。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是選自以下的至少一種：
[0036] 1)通過與配體、抗體、非抗體蛋白相互作用能被誘導(dǎo)經(jīng)受內(nèi)化的受體酪氨酸激酶 (RTKs)(例如，c-Met蛋白、c-Met蛋白突變體、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR ;ErbBl)、HER2(人 類表皮生長(zhǎng)因子受體2蛋白；ErbB2)、HER3(人類表皮生長(zhǎng)因子受體3蛋白；ErbB3)、血 小板源性生長(zhǎng)因子受體（PDGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFR)、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體 (IGFlR)、ephrin受體、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR));
[0037] 2)通過與配體、抗體、非抗體蛋白相互作用被誘導(dǎo)經(jīng)受內(nèi)化的受體（例如，運(yùn)鐵 蛋白受體、低密度脂蛋白（LDL)受體、分化抗原簇或指定簇（CD)(例如，CDlla、CD20、CD3、 CD33、CD44、CD59、CD73、CD152 (CTLA4))、NTRK2 (神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激酶））；
[0038] 3)四穿膜區(qū)蛋白（例如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、 NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B);和
[0039] 4)可通過抗體結(jié)合而被內(nèi)化的用于抗體藥物偶聯(lián)物（ADC)的膜靶標(biāo)（參考文 獻(xiàn)：2013Nature Reviews Drug Discoveryl2:330)(例如，CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、 CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、葉酸受體 1、CD37、粘蛋白 16、ETB、STEAP1、 CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鳥苷酰環(huán)化酶C、粘蛋白I、EGFRvIII、間皮素等）。
[0040] 不考慮類型、性質(zhì)和功能，靶膜蛋白可以是任何型式的膜蛋白。此外，不能自身觸 發(fā)而被內(nèi)化至細(xì)胞中的膜蛋白可在靶標(biāo)的范圍之內(nèi)。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，驅(qū)動(dòng)物膜蛋白可以是c-Met蛋白，而與驅(qū)動(dòng)物膜蛋白結(jié)合的 二元結(jié)合分子第一結(jié)合域可與c-Met蛋白SEMA域（SEQ ID NO:79)中從第143位至第147 位的氨基酸序列SEQ ID NO: 73 (EEPSQ)結(jié)合。
[0042] 例如，靶膜蛋白可以是受體介導(dǎo)的與異常細(xì)胞（例如在腫瘤發(fā)生中）有關(guān)的細(xì)胞 信號(hào)，或是通道蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，靶膜蛋白可以是異常細(xì)胞相關(guān)性疾病如癌癥的治 療靶標(biāo)。
[0043] 如上所述，革巴膜蛋白可以是任何膜蛋白，其包括整合蛋白（integral protein)如 G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs)、受體酪氨酸激酶等，以及外周膜蛋白。具體地，其可以選自微絲 結(jié)合蛋白（microfilament-associated proteins)、細(xì)胞粘附分子、膜酶、膜受體、載體蛋 白、通道蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、指向細(xì)胞外的脂質(zhì)錨定蛋白及其組合。任何整合蛋白如果通過如 上所述與配體或抗體的相互作用而被內(nèi)化，均可用作靶膜蛋白而與驅(qū)動(dòng)物膜蛋白偶聯(lián)。在 一個(gè)實(shí)施方案中，整合蛋白可選自受體酪氨酸激酶（RTKs)、G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)和各種 受體（運(yùn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白（LDL)受體、分化抗原簇（指定簇；CD))以及它們的組 合。靶膜蛋白可以是在細(xì)胞功能中發(fā)揮重要作用的蛋白中的一種，并且尤其選自表皮生長(zhǎng) 因子受體（EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR)、HER2蛋白（人類表皮生長(zhǎng)因子受體2蛋 白）、HER3蛋白（人類表皮生長(zhǎng)因子受體32蛋白）和血小板源性生長(zhǎng)因子受體（PDGFR)。
[0044] 如本申請(qǐng)中所用，術(shù)語"c-Met蛋白"表示與肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子配體結(jié)合的受體酪 氨酸激酶。所述c-Met蛋白可來源于任何物種，例如，靈長(zhǎng)類物種，如人類c-Met (例如， NP_000236)和恒河猴 c-Met (例如，Macaca mulatta, NP_001162100)，或者嚙齒類物種，如 鼠c-Met (例如，NP_032617. 2)和大鼠c-Met (例如，NP_113705. 1)。所述蛋白可包括例如 由GenBank登錄號(hào)NM_000245的核苷酸序列編碼的多肽，或者由GenBank登錄號(hào)NP_000236 的氨基酸序列編碼的蛋白，或者所述多肽或蛋白加上它們的細(xì)胞外域。所述c-Met蛋白已 知是一種受體酪氨酸激酶，其涉及包括腫瘤發(fā)生、癌癥轉(zhuǎn)移、癌細(xì)胞的遷移和浸潤(rùn)、及血管 發(fā)生在內(nèi)的多種活動(dòng)。
[0045] 表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)、HER2 (人類表皮生長(zhǎng)因子受體2蛋白）和HER3 (人類 表皮生長(zhǎng)因子受體3蛋白）是HER家族的成員，該家族包括四種質(zhì)膜結(jié)合型受體酪氨酸激 酶（RTKs)，EGFR(HERl)、HER2、HER3 和 HER4。
[0046] 當(dāng)它們的細(xì)胞外域與配體結(jié)合時(shí)，EGFR、HER2和HER3被四種ErbB受體中的任一種 誘導(dǎo)成同二聚體或異二聚體，從而導(dǎo)致受體胞質(zhì)域內(nèi)酪氨酸殘基的自磷酸化作用。EGFR自 磷酸化作用導(dǎo)致包括MAPK和PI3K/Akt的下游信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)活化，其依次誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、血 管發(fā)生和轉(zhuǎn)移。EGFR、HER2和/或HER3的過表達(dá)或基因擴(kuò)增、突變或重排往往在多種不同 的人類惡性腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，且與癌癥治療的預(yù)后不佳和臨床結(jié)果有關(guān)。由于該原因，EGFR、 HER2和/或HER3是用于抗癌療法的重要靶標(biāo)。
[0047] EGFR、HER2或HER3可來源于哺乳動(dòng)物如靈長(zhǎng)類（例如，人類、猴）和嚙齒類（例如， 小鼠和大鼠）。例如，EGFR是包括由如下GenBank登錄號(hào)的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基 酸序列的多肽 JQ739160、JQ739161、JQ739162、JQ739163、JQ739164、JQ739165、JQ739166、 JQ739167、NM_005228. 3、NM_201284. 1、NM_201282. 1 或 ΝΜ_201283· 1。在一個(gè)實(shí)施方案中， HER2可以是由GenBank登錄號(hào)Χ03363. 1的核苷酸序列（mRNA)編碼的多肽，而HER3則可以 是由GenBank登錄號(hào)NM_001982的核苷酸序列（mRNA)編碼的多肽。
[0048] 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFRs)存在于癌細(xì)胞以及正常細(xì)胞的質(zhì)膜中并介導(dǎo) VEGF誘導(dǎo)的血管發(fā)生的信號(hào)傳導(dǎo)，其對(duì)于癌細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)是必要的。VEGFR的過表達(dá)是 多種疾病的病因尤其是腫瘤生成的原因，并涉及不佳的治療預(yù)后，如侵入、轉(zhuǎn)移等。相應(yīng)地， VEGFR是用于抗癌療法的一種重要靶標(biāo)。VEGFR可來源于哺乳動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如人類和 猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，VEGFR可以是包括由GenBank登錄號(hào)AF063657. 2的 核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0049] 血小板源性生長(zhǎng)因子受體（PDGFRs)是細(xì)胞表面酪氨酸激酶受體并涉及細(xì)胞增 殖、分化和生長(zhǎng)及包括癌癥在內(nèi)的多種疾病發(fā)作的調(diào)節(jié)機(jī)制。I 3DGFR可來源于哺乳動(dòng)物，其 包括靈長(zhǎng)類如人類和猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，PDGFR可以是包括由GenBank登 錄號(hào) NM_006206. 4 (PDGFR-A)、NM_002609. 3 (PDGFR-B)或 ΝΜ_016205. 2 (PDGFR-C)的核苷酸 序列（mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0050] 胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體（IGFlR)，屬于一大類酪氨酸激酶受體，其為由胰島素樣 生長(zhǎng)因子I(IGF-I)活化的跨膜受體。IGFlR可來源于哺乳動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如人類和猴， 以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，IGFlR可以是包括由GenBank登錄號(hào)NM_000875. 3的核 苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0051] Ephrin受體是細(xì)胞表面受體酪氨酸激酶并介導(dǎo)涉及胚胎發(fā)育過程調(diào)節(jié)的 ephrin信號(hào)傳導(dǎo)，所述胚胎發(fā)育過程包括軸突指導(dǎo)（axon guidance)、組織邊界的形成、 細(xì)胞遷移、和分節(jié)（segmentation)。Ephrin受體可來源于哺乳動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如 人類和猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，ephrin受體可以是包括由GenBank登錄號(hào) NM_004440. 3、NM_004438. 3、NM_004431. 3、NM_004442. 6、NM_017449. 3、NM_004093. 3、 NM_004441. 4、NM_182472. 2、NM_005232. 4、NM_005233. 5、NM_173641. 2、NM_001099439. 1、 NM_001080448.2、NM_001080448. 2、NM_004443.3、NM_182689. 1、NM_004428.2、 NM_004439. 5、NM_001962. 2、NM_004429. 4、NM_182644. 2、NM_004952. 4、NM_173655. 2、 NM_182690. 2、NM_020526. 3、NM_001406. 3、NM_005227. 2 和 NM_182685. I 的核苷酸序列 (mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0052] 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體（FGFR)是與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的成員結(jié)合的受 體。這些受體中的一些涉及病理情況（pathological condition)。例如，F(xiàn)GFR3中的點(diǎn)突 變可導(dǎo)致軟骨發(fā)育不全。已經(jīng)在脊椎動(dòng)物中鑒定出五種不同的FGFR并且它們都屬于酪氨 酸激酶超家族（FGFR1至FGFR4和FGFR6)。FGFRl可包括由GenBank登錄號(hào)NM_001174063 或NM_001079908的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，F(xiàn)GFR2可包括由GenBank登錄號(hào) NM_000141或NM_010207的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，F(xiàn)GFR3可包括由GenBank 登錄號(hào)NM_000142或NM_001163215的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，且FGFR4可 包括由GenBank登錄號(hào)NM_002011或NM_008011的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列。
[0053] 運(yùn)鐵蛋白受體是運(yùn)鐵蛋白的載體蛋白。它通過經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞（內(nèi)化）將運(yùn) 鐵蛋白-鐵絡(luò)合物內(nèi)化而將鐵輸入到細(xì)胞中，它隨細(xì)胞內(nèi)鐵濃度而被調(diào)節(jié)。運(yùn)鐵蛋白受 體可來源于哺乳動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如人類和猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，運(yùn)鐵蛋 白受體可以是包括由 GenBank 登錄號(hào) NM_001128148. 1、NM_003234. 2、NM_001206855. 1、 NM_003227. 3、BC001188. 1或M11507. 1的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0054] 低密度脂蛋白（LDL)受體是識(shí)別埋入LDL顆粒的磷脂外層中的載脂蛋白BlOO 的細(xì)胞表面受體。它介導(dǎo)富含膽固醇的LDL的胞吞。LDL受體可來源于哺乳動(dòng)物和嚙 齒類。例如，LDL受體可以是包括由GenBank登錄號(hào)NM_000527. 4、NM_001195802. 1、 ΝΜ_001195799· 1、ΝΜ_001195803· 1、ΝΜ_001195800· 1 或 ΝΜ_001195798· 1 的核苷酸序列 (mRNA)編碼的氨基酸序列的多肽。
[0055] 分化抗原簇（指定簇；CD)分子可作為涉及包括細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞粘附的多種 細(xì)胞過程的受體或配體起作用，且對(duì)于人類其最近總計(jì)高達(dá)350種。CD分子可來源于哺乳 動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如人類和猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，CD分子可來自任何來源， 具體地可以是⑶44、⑶47或它們的突變體。在實(shí)施方案中，⑶分子可以是由包括由GenBank 登錄號(hào)（NM_000610. 3、NM_001728. 3、X55150. 1)的核苷酸序列（mRNA)分別編碼的氨基酸序 列的多肽。
[0056] G-蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs)是活化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和細(xì)胞應(yīng)答的跨膜受體并涉及多 種疾病?；谛蛄型葱院托蛄邢嗨菩?，GPCR可分為6類：A類或1類（視紫紅質(zhì)樣受體）； B類或2類（胰泌素受體家族）；C類或3類（代謝型谷氨酸/信息素）；D類或4類（真菌 交配信息素受體）；E類或5類（環(huán)AMP受體）；以及F類或6類（卷曲的/平滑的）。GPCR 可來源于哺乳動(dòng)物，其包括靈長(zhǎng)類如人類和猴，以及嚙齒類如小鼠和大鼠。例如，GPCR可以 是癌癥轉(zhuǎn)移相關(guān)的趨化因子受體（視紫紅質(zhì)樣受體亞家族），例如，CXC趨化因子受體、CC 趨化因子受體、CX3C趨化因子受體等。在一個(gè)實(shí)施方案中，GPCR可以是包括由GenBank登 錄號(hào) NM_001123041. 2、NM_005508. 4、NM_005201. 3 和 NM_016602. 2 的核苷酸序列（mRNA)分 別編碼的氨基酸序列的多肽。
[0057] 四穿膜區(qū)蛋白（例如，CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NETl、NET2、NET4、NET5、 NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B等）是一個(gè)具有33個(gè)哺乳動(dòng)物成員的跨膜蛋白的家 族，其在幾乎所有細(xì)胞和組織類型中的質(zhì)膜上以及多種細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和顆粒中不定期被發(fā) 現(xiàn)。與許多其他細(xì)胞表面蛋白相比，四穿膜區(qū)蛋白不具有明顯的受體功能。四穿膜區(qū)蛋白 在內(nèi)體系統(tǒng)和溶酶體相關(guān)細(xì)胞器中被發(fā)現(xiàn)。這些包括血小板中的致密顆粒和α顆粒、黑 色素細(xì)胞中的黑色素體、T細(xì)胞中的細(xì)胞毒性顆粒、內(nèi)皮細(xì)胞中的Weibel-Palade體和樹 突細(xì)胞中的主要組織相容性復(fù)合物II(MHCII)隔室。此外，在許多細(xì)胞類型中，晚期內(nèi)體/ MVB (多泡體）可被觸發(fā)從而與細(xì)胞表面融合并釋放功能上與癌癥進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)的外體。 這些暗示著四穿膜區(qū)蛋白可被用作膜消耗的驅(qū)動(dòng)物或靶物。CD9可包括由GenBank登錄號(hào) ΝΜ_001769或ΝΜ_007657的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，CD81可包括由GenBank 登錄號(hào)NM_004356或NM_133655的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，CD151可包括 由GenBank登錄號(hào)NM_001039490或NM_001111049的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序 列，CD63可包括由GenBank登錄號(hào)NM_001040034或NM_001042580的核苷酸序列（mRNA) 編碼的氨基酸序列，⑶37可包括由GenBank登錄號(hào)NM_001040031或NM_007645的核苷酸 序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，CD53可包括由GenBank登錄號(hào)NM_000560或NM_007651 的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，NETl可包括由GenBank登錄號(hào)NM_001047160或 NM_001047159的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，NET2可包括由GenBank登錄號(hào) NM_012338或NM_173007的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，NET6可包括由GenBank 登錄號(hào)ΝΜ_014399或NM_025359的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，TM4SF6可包括 由 GenBank 登錄號(hào) NM_001278743、NM_001278742、NM_001278741、NM_001278740、NM_003270 或NM_019656的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，Tspan2可包括由GenBank登錄號(hào) NM_005725、NM_001243132或NM_027533的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列，Tspan3 可包括由 GenBank 登錄號(hào) NM_001168412、NM_198902、NM_005724 或 NM_019793 的核苷酸序 列（mRNA)編碼的氨基酸序列，且TM4B(TSPAN16)可包括由GenBank登錄號(hào)NM_001282510、 NM_001282509或NM_012466的核苷酸序列（mRNA)編碼的氨基酸序列。
[0058] 消耗靶膜蛋白的組合物不是簡(jiǎn)單地通過結(jié)合來抑制一些靶膜蛋白的活性，所述靶 膜蛋白介導(dǎo)與異常細(xì)胞狀態(tài)有關(guān)的細(xì)胞信號(hào)或參與包括癌癥在內(nèi)的疾病的病因?qū)W，而是通 過觸發(fā)胞吞（內(nèi)化）和降解起作用從而消耗靶膜蛋白。
[0059] 為了消耗靶膜蛋白的組合物能有效工作，驅(qū)動(dòng)膜蛋白驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白都 必須存在于相同的細(xì)胞（例如，相同的細(xì)胞膜）上?？紤]到質(zhì)膜的柔性和流動(dòng)性以及質(zhì)膜 中靶膜蛋白的水平（例如，在異常細(xì)胞中的表達(dá)水平），對(duì)相同細(xì)胞膜上驅(qū)動(dòng)膜蛋白驅(qū)動(dòng)物 膜蛋白和靶膜蛋白之間的距離沒有具體的限定。
[0060] 消耗靶膜蛋白的組合物中所含的雙重結(jié)合分子中的第一結(jié)合域和第二結(jié)合域可 各自獨(dú)立地選自針對(duì)驅(qū)動(dòng)膜蛋白驅(qū)動(dòng)物膜蛋白或靶膜蛋白的抗體、它們的抗體片段（例 如，抗原結(jié)合片段），以及抗體模擬物（mimics)(也稱作抗體模仿物（mimetics))。第一和 第二結(jié)合域的具體實(shí)例包括，例如抗體（例如，完整免疫球蛋白形式）、scFv抗體、噬菌體抗 體、域抗體、DARPin(設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白（Designed Ankyrin Repeat Proteins))、纖連 蛋白域、kringle域、納體（nanobodies)、肽體（peptibodies)、肽或aptides或它們的組合。
[0061] 例如，第一結(jié)合域可源自對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段，而第二結(jié) 合域可源自對(duì)抗靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段。因此，二元結(jié)合分子可以是驅(qū)動(dòng)物膜 蛋白和靶膜蛋白的雙特異性（二元結(jié)合）抗體，其包括各自與驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白的 結(jié)合域。
[0062] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體可包括：
[0063] 對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段；和
[0064] 對(duì)抗靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段，
[0065] 其中對(duì)抗靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段與對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗 原結(jié)合片段的C末端或N末端連接。
[0066] 在這方面，雙特異性抗體可具有垂直不對(duì)稱性，其中雙特異性抗體的N末端部分 (例如，來自Fc區(qū)域的N末端部分）和C末端部分（例如，來自Fc區(qū)域的C末端部分）在 結(jié)構(gòu)上不同（例如，它們彼此不同并獨(dú)立地選自scFv片段、（scFv)2、Fab片段、Fab'片段、 F (ab'）2片段和抗體模擬物如DARPin，以及，和/或在功能上彼此不同（例如，N末端和C末 端特異性識(shí)別不同的蛋白和/或與不同的蛋白結(jié)合））?？商鎿Q地，具有垂直不對(duì)稱性的雙 特異性抗體可包含完整形式的抗體（例如，IgG形式）和與抗體的C末端或N末端連接的 抗體片段（例如，scFv片段、（scFv)2、Fab片段、Fab'片段、F(ab'）2片段或抗體模擬物如 DARPin)，其中所述抗體和抗體片段可識(shí)別彼此相同或不同的抗原。
[0067] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體可包括：
[0068] 針對(duì)驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的單鏈抗體（scFvFc)或其抗原結(jié)合片段（scFv);和
[0069] 針對(duì)祀膜蛋白的單鏈抗體（scFvFc)或其抗原結(jié)合片段（scFv),
[0070] 其中對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的單鏈抗體或其抗原結(jié)合片段與對(duì)抗靶膜蛋白的單鏈抗 體或其抗原結(jié)合片段接合，從而形成雙側(cè)不對(duì)稱。
[0071] 因此，雙特異性抗體可以是雙側(cè)不對(duì)稱的，其中兩個(gè)單鏈抗體與彼此不同的蛋白 特異性地結(jié)合。
[0072] 在消耗靶膜蛋白的組合物或在雙特異性抗體中，對(duì)于抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體而言 重要的是，起到介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)化和降解兩方面的作用。為了展現(xiàn)其功能，對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的 抗體可具有完整抗體形式（例如，全免疫球蛋白形式）。另一方面，因?yàn)閷?duì)于抗靶膜蛋白的 抗體而言重要的是，特異性識(shí)別靶膜蛋白并與其結(jié)合，故這種抗體可以是抗原結(jié)合片段或 完整抗體的形式。在一個(gè)實(shí)施方案中，因此，雙特異性抗體可包括對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的完整 抗體和對(duì)抗靶膜蛋白的抗體的抗原結(jié)合片段，其中所述抗原結(jié)合片段與對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白 的完整抗體的C末端連接。
[0073] 為了說明驅(qū)動(dòng)物膜蛋白和靶膜蛋白之間的距離，二元結(jié)合分子中驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的 第一結(jié)合域可與靶膜蛋白的第二結(jié)合域分開足夠的距離，從而促進(jìn)靶膜蛋白和驅(qū)動(dòng)物膜蛋 白結(jié)合。因此，二元結(jié)合分子可具有一種結(jié)構(gòu)，其中第一結(jié)合域可通過柔性連接體與第二結(jié) 合域連接。
[0074] 在雙特異性抗體中，對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段可與對(duì)抗靶膜蛋 白的抗體或其抗原結(jié)合片段直接連接或通過肽連接體連接。肽連接體可由1至100個(gè)氨基 酸、2至50個(gè)氨基酸或5至20個(gè)氨基酸組成。對(duì)于肽連接體中所使用的氨基酸種類沒有設(shè) 置限定。例如，肽連接體可包括至少一個(gè)選自Gly、Asn和Ser的殘基，或者可包括中性氨基 酸如Thr和/或Ala。適合用于肽連接體的氨基酸可以是本領(lǐng)域已知的。肽連接體還可以 是任何長(zhǎng)度，條件是其不使雙特異性抗體的功能無效。
[0075] 在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)抗靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段可選自抗-EGFR抗 體、抗-HER2抗體、抗-HER3抗體、抗-VEGFR抗體、抗-PDGFR抗體、抗-IGF-IR抗體和它們 的抗原結(jié)合片段?？?EGFR抗體可選自西妥昔單抗（cetuximab)(愛必妥（Erbitux))、帕 尼單抗（panitumumab)、馬妥珠單抗（matuzumab)、奈昔木單抗（necitumumab)、尼妥珠單 抗（nimotuzumab)、扎魯木單抗（zalutumumab)、MM_151 ( -種寡克隆治療物，其由設(shè)計(jì)為與 EGFR的非重疊表位結(jié)合的三種全長(zhǎng)人單克隆抗體的混合物組成）、包括含有SEQ ID NO: 109 或113所示氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有SEQ ID NO: 110或114所示氨基酸序列的輕鏈 可變區(qū)的抗體?？?HER2抗體可選自曲妥珠單抗（trastuzumab，赫塞?。℉erceptin))或帕 妥珠單抗（pertuzumab)?？?HER3抗體可以是RG-7597 (人源化IgGl單克隆抗體）。例如， 抗-VEGFR2(KDR)抗體和抗-PDGFR抗體可以分別是雷莫蘆單抗（ramucirumab)和奧拉圖單 抗（olaratumab, IMC-3G3)。西旭木單抗（Cixutumumab，IMC_A12)可適合用作抗-IGF-1R抗 體。
[0076] 如上所述，對(duì)抗靶膜蛋白的抗體可以以雙特異性抗體的完整形式或抗原結(jié)合片段 形式存在。
[0077] 對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段可以是抗-c-Met抗體或能夠有效地 將對(duì)抗靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段內(nèi)化的抗體。對(duì)抗驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體可為完整 抗體或抗原結(jié)合片段的形式。
[0078] 如本申請(qǐng)所用，術(shù)語"抗原結(jié)合片段"是指完整免疫球蛋白上與抗原結(jié)合的片段。 例如，抗原結(jié)合片段可以是scFv片段、（scFv) 2、Fab片段、Fab'片段或F(ab'）2片段，但不 限于這些。
[0079] Fab片段包含來自輕鏈的一個(gè)可變域和一個(gè)恒定域及來自重鏈的一個(gè)可變域和一 個(gè)恒定域（C hi)，其保留一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)。
[0080] Fab'片段與Fab的不同之處在于：Fab'還包括鉸鏈區(qū)，包括位于重鏈Chi域C末端 的至少一個(gè)半胱氨酸殘基。當(dāng)兩個(gè)Fab'片段通過鉸鏈區(qū)的半胱氨酸殘基之間的二硫鍵連 接時(shí)，形成F(ab'） 2片段。
[0081] Fv片段是僅含重鏈和輕鏈的可變域的最小抗體片段。生產(chǎn)Fv的重組技術(shù)是本領(lǐng) 域已知的。在雙鏈Fv片段中，重鏈可變區(qū)通過非共價(jià)鍵與輕鏈可變區(qū)相連。單鏈Fv具有 如下結(jié)構(gòu)，其中重鏈可變域和輕鏈可變域直接在C末端彼此共價(jià)連接，且兩個(gè)單鏈Fv片段 可像在雙鏈Fv片段中那樣形成二聚體。肽連接體可包括1至100個(gè)氨基酸殘基、2至50個(gè) 氨基酸殘基或5至20個(gè)氨基酸殘基，對(duì)于氨基酸殘基的種類沒有設(shè)置限定。例如，肽連接 體可包括至少一個(gè)選自Gly、Asn和Ser的殘基，且還可包括中性氨基酸如Thr和/或Ala。 適合用于肽連接體的氨基酸可以是本領(lǐng)域公知的那些。只要其對(duì)抗原結(jié)合片段的功能沒有 負(fù)面影響，肽連接體的長(zhǎng)度可被適當(dāng)調(diào)整。
[0082] 抗原結(jié)合片段可以用蛋白酶來制備（例如，完整抗體用木瓜蛋白酶消化將裂解成 兩個(gè)Fab片段，而用胃蛋白酶將產(chǎn)生F(ab'）2片段）?？商鎿Q地，基因重組技術(shù)可用于生產(chǎn) 抗原結(jié)合片段。
[0083] 在一個(gè)實(shí)施方案中，雙特異性抗體可包括抗-C-Met抗體和對(duì)抗靶膜蛋白的抗體 (例如，抗-EGFR抗體、抗-HER2抗體、抗-HER3抗體、抗-VEGFR抗體或抗-PDGFR抗體）的 scFv、（scFv) 2、Fab、Fab'或F(ab'）2片段，其中所述片段與抗-c-Met抗體的C末端連接，優(yōu) 選scFv。例如，抗-EGFR抗體的scFv、（scFv) 2、Fab、Fab'或F(ab'）2片段包括包含如SEQ ID N0:109或113所規(guī)定的氨基酸序列的重鏈可變域和包含如SEQ ID N0:110或114所規(guī)定的 氨基酸序列的輕鏈可變域。在一個(gè)實(shí)施方案中，因此雙特異性抗體包括抗-c-Met抗體、還 包括抗-EGFR抗體的scFv、（scFv) 2、Fab、Fab'或F(ab'）2片段，其中所述片段與抗-c-Met 抗體的C末端連接，且包括包含如SEQ ID NO: 109或113所規(guī)定的氨基酸序列的輕鏈可變 域和包含如SEQ ID NO: 110或114所規(guī)定的氨基酸序列的重鏈可變域。
[0084] 抗c-Met抗體可以是對(duì)c-Met起作用從而誘導(dǎo)c-Met向細(xì)胞內(nèi)內(nèi)化并被降解的任 何抗體或抗原結(jié)合片段。抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段可識(shí)別c-Met的特異性區(qū)域，例 如，SEMA域中的特異性區(qū)域，如表位。
[0085] c-Met是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)的受體，可分為三個(gè)部分：細(xì)胞外、跨膜和細(xì)胞內(nèi) 部分。細(xì)胞外部分由通過二硫鍵彼此連接的α亞基和β亞基組成，并含有負(fù)責(zé)結(jié)合HGF 的SEMA域、PSI域（叢狀蛋白-導(dǎo)向蛋白（semaphorins)-整聯(lián)蛋白同一'丨生/同源性域）和 IPT域（由叢狀蛋白和轉(zhuǎn)錄因子域共享的免疫球蛋白樣折疊）。c-Met蛋白的SEMA域可包 括SEQ ID NO: 79的氨基酸序列，且是起與HGF結(jié)合的作用的細(xì)胞外域。SEMA域的特異性區(qū) 域，即包括SEQ ID NO:71的氨基酸序列的區(qū)域，其對(duì)應(yīng)于SEMA域（SEQ ID NO:79)的氨基 酸序列的第106至124位氨基酸殘基，是SEMA域的表位中第二和第三螺旋之間的環(huán)區(qū)。該 區(qū)域可作為抗c-Met抗體的表位起作用。
[0086] 如本申請(qǐng)所用，術(shù)語"表位"是指抗原決定簇，是抗體所識(shí)別的抗原的一部分。在 一個(gè)實(shí)施方案中，表位可以是包括c-Met蛋白的SEM域（SEQ ID N0:79)中5個(gè)或更多相 連的（連續(xù)的或非連續(xù)的）氨基酸殘基的區(qū)域，例如，SEQ ID NO: 71的5至19個(gè)連續(xù)的氨 基酸殘基。例如，表位可以是包括選自SEQ ID NO:71的氨基酸序列的部分組合的5至19 個(gè)相連氨基酸的多肽，其中所述多肽包括SEQ ID NO: 73 (EEPSQ)的氨基酸序列作為表位的 必要要素。SEQ ID N0:73的氨基酸序列從c-Met蛋白的SEMA域（SEQ ID N0:79)的第143 位至147位。例如，表位可以是包括SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:73的氨基 酸序列，或基本上由所述序列組成，或者只是由所述序列組成的多肽。
[0087] 包括SEQ ID NO: 72的氨基酸序列的表位對(duì)應(yīng)于c-Met蛋白的SEMA域中第二和第 三螺旋之間的環(huán)的最外面部分。包括SEQ ID N0:73的氨基酸序列的表位是根據(jù)一個(gè)實(shí)施 方案的抗體或抗原結(jié)合片段最特異性結(jié)合的位點(diǎn)。
[0088] 因此，抗c-Met抗體可特異性結(jié)合具有選自SEQ ID NO: 71的氨基酸序列的部分組 合的5至19個(gè)連續(xù)的或非連續(xù)的氨基酸的表位，其包括SEQ ID NO:73作為必要要素。例 如，抗c-Met抗體可特異性結(jié)合包括SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 72或SEQ ID NO: 73的氨基 酸序列的表位。
[0089] 在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段可包括：
[0090] 至少一種重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)，選自（a)⑶R-Hl，其包含SEQ ID NO:4氨基酸序 列；（b)CDR-H2,其包含SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:2的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:2的8-19個(gè)連續(xù)氨基酸（包括SEQ ID NO:2的第3至第10位）的氨基酸序列；和（c) CDR-H3,其包含SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO:85的 6-13個(gè)連續(xù)氨基酸（包括SEQ ID NO: 85的第1至第6位），或者包含包括所述至少一個(gè)重 鏈互補(bǔ)決定區(qū)的重鏈可變區(qū)；
[0091] 至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)，選自（a)⑶R-Ll，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸 序列；（b)CDR-L2,其包含SEQ ID N0:8的氨基酸序列；和（c)CDR-L3,其包含SEQ ID N0:9、 SEQ ID NO :86的氨基酸序列，或者包含含有SEQ ID NO :89的9-17個(gè)連續(xù)氨基酸（包括SEQ ID N0:89的第1至第9位）的氨基酸序列，或者包含包括所述至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的 輕鏈可變區(qū)；
[0092] 所述至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)和所述至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的組合；或
[0093] 所述重鏈可變區(qū)和所述輕鏈可變區(qū)的組合。
[0094] 本文中，SEQ ID N0S:4 - 9的氨基酸序列分別由下式I-VI表示：
[0095] 式 I
[0096] Xaa1-Xaa2-Tyr-Tyr-Met-Ser(SEQ ID NO:4),
[0097] 其中Xaa1不存在或?yàn)镻ro或Ser，且Xaa2為Glu或Asp ;
[0098] 式 II
[0099] Arg-Asn-Xaa3-Xaa4-Asn-Gly-Xaa 5-Thr(SEQ ID NO:5),
[0100] 其中 Xaa3 為 Asn 或 Lys，Xaa4 為 Ala 或 Val，且 Xaa5 為 Asn 或 Thr，
[0101] 式 III
[0102] Asp-Asn-Trp-Leu-Xaa6-Tyr(SEQ ID N0:6),
[0103] 其中 Xaa6 為 Ser 或 Thr，
[0104] 式 IV
[0105] Lys-Ser-Ser-Xaa7-Ser-Leu-Leu-Ala-Xaa 8-Gly-Asn-Xaa9-Xaa10-Asn-Tyr-Leu-Al a(SEQ ID NO:7)
[0106] 其中 Xaa7 為 His、Arg、Gln 或 Lys，Xaa8 為 Ser 或 Trp，Xaa9 為 His 或 Gln，且 Xaa10 為 Lys 或 Asn,
[0107] 式 V
[0108] Trp-Xaa11-Ser-Xaa12-Arg-Val-Xaa 13(SEQ ID NO:8)
[0109] 其中 Xaa11 為 Ala 或 Gly，Xaa12 為 Thr 或 Lys，且 Xaa13 為 Ser 或 Pro,和
[0110] 式 VI
[0111] Xaa14-Gln-Ser-Tyr-Ser-Xaa15-Pro-Xaa 16-Thr(SEQ ID NO:9)
[0112] 其中 Xaa14 為 Gly、Ala 或 Gln，Xaa15 為 Arg、His、Ser、Ala、Gly 或 Lys，且 Xaa16 為 Leu、Tyr、Phe 或 Met。
[0113] 在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述⑶R-Hl可包括選自SEQ ID NOS: 1、22、23和24的氨基酸 序列。所述⑶R-H2可包括選自SEQ ID NOS: 2、25和26的氨基酸序列。所述⑶R-H3可包 括選自SEQ ID NOS: 3、27、28和85的氨基酸序列。
[0114] 所述CDR-L1可包括選自SEQIDN0S:10、29、30、31、32、33和106的氨基酸序列。 所述CDR-L2可包括選自SEQ ID N0S: 11、34、35和36的氨基酸序列。所述CDR-L3可包括 選自 SEQ ID N0S:12、13、14、15、16、37、86 和 89 的氨基酸序列。
[0115] 在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗體或抗原結(jié)合片段可包括重鏈可變區(qū)，其包括包含 選自SEQIDN0S :1、22、23和24的氨基酸序列的多肽（CDR-H1)、包含選自SEQIDN0S:2、 25和26的氨基酸序列的多肽（CDR-H2)，和包含選自SEQ ID NOS: 3、27、28和85的氨基酸 序列的多肽（CDR-H3);和輕鏈可變區(qū)，其包括包含選自SEQ ID勵(lì)5:10、29、30、31、32、33和 106的氨基酸序列的多肽（CDR-Ll)、包含選自SEQ ID N0S: 11、34、35和36的氨基酸序列的 多肽（CDR-L2)，和包含選自SEQ ID勵(lì)512、13、14、15、16、37、86和89的氨基酸序列的多肽 (CDR-L3)。
[0116] 當(dāng)注射于人用于醫(yī)學(xué)治療目的時(shí)，通過使用所需的抗原免疫無免疫性的動(dòng)物產(chǎn)生 的動(dòng)物來源的抗體通常會(huì)引起免疫原性，因此已研發(fā)嵌合抗體以抑制此類免疫原性。通過 基因工程使用人抗體的恒定區(qū)替換引起抗同工型應(yīng)答的動(dòng)物來源的抗體的恒定區(qū)來制備 嵌合抗體。與動(dòng)物來源的抗體相比，嵌合抗體極大地改善了抗同工型應(yīng)答，但是動(dòng)物來源的 氨基酸仍具有可變區(qū)，以至于嵌合抗體對(duì)潛在的抗個(gè)體基因型應(yīng)答有副作用。已研發(fā)人源 化抗體以減少此類副作用。人源化抗體通過將在嵌合抗體的可變區(qū)的抗原結(jié)合中起重要作 用的互補(bǔ)決定區(qū)（CDR)移植至人抗體框架中而產(chǎn)生。
[0117] 在CDR移植產(chǎn)生人源化抗體中最重要的事情是為接受動(dòng)物來源的抗體的CDR選擇 優(yōu)化的人抗體。使用了抗體數(shù)據(jù)庫(kù)、晶體結(jié)構(gòu)分析和分子模型技術(shù)。然而，即使當(dāng)所述動(dòng)物 來源的抗體的CDR被移植至最優(yōu)化的人抗體框架時(shí)，位于動(dòng)物來源的CDR的框架中的氨基 酸對(duì)抗原結(jié)合影響仍然存在。因此，在很多情況中，抗原結(jié)合親和力不能被維持，因而需要 恢復(fù)所述抗原親和力的其它抗體工程技術(shù)的應(yīng)用。
[0118] 所述抗c-Met抗體可以是小鼠來源的抗體、小鼠-人嵌合抗體、人源化抗體或人抗 體。所述抗體或其抗原結(jié)合片段可以自活體分離。
[0119] 完整的抗體包括兩個(gè)全長(zhǎng)輕鏈和兩個(gè)全長(zhǎng)重鏈，其中每個(gè)輕鏈通過二硫鍵連接至 重鏈。所述抗體具有重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)。所述重鏈恒定區(qū)為gamma(Y)、mu(y)、 alpha (a)、delta (δ)或 epsilon (ε)型，其可進(jìn)一步分為 gammal ( Y I)、gamma2 ( Y 2)、 gamma3 ( Y 3)、gamma4 ( Y 4)、alphal ( α 1)或 alpha2 ( α 2)。所述輕鏈恒定區(qū)為 kappa ( κ ) 或 lambda( λ )型。
[0120] 如本文所用，術(shù)語"重鏈"指的是全長(zhǎng)重鏈和其片段，其包括包含足以提供對(duì)抗原 特異性的氨基酸序列的可變區(qū)V h，和三個(gè)恒定區(qū)，CH1、Ch2和Ch3，以及鉸鏈。術(shù)語"輕鏈"指 的是全長(zhǎng)輕鏈和其片段，其包括包含足以提供對(duì)抗原特異性的氨基酸序列的可變區(qū)'，和 恒定區(qū)Q。
[0121] 術(shù)語"互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)"指的是存在于免疫球蛋白的重鏈或輕鏈的高變區(qū)中的氨 基酸序列。所述重鏈和輕鏈可分別包含三個(gè)⑶R(⑶RH1、⑶RH2和⑶RH3 ;和⑶RL1、⑶RL2 和CDRL3)。所述CDR可提供在抗體與抗原或表位的結(jié)合中起重要作用的接觸殘基。術(shù)語 "特異性結(jié)合"和"特異性識(shí)別"是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所公知的，且表示抗體和抗原彼此特 異性接觸以產(chǎn)生免疫活性。
[0122] 在一項(xiàng)抗c-Met抗體或抗原結(jié)合片段的實(shí)施方案中，所述重鏈的可變域包括SEQ ID N0:17、74、87、90、91、92、93或94的氨基酸序列且所述輕鏈的可變域包括SEQ ID N0:18、 19、20、21、75、88、95、96、97、98、99 或 107 的氨基酸序列。
[0123] 在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗c-Met抗體可以是單克隆抗體。所述單克隆抗體可由 保藏號(hào)為KCLRF-BP-00220的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生，其特異性地結(jié)合c-Met蛋白的胞外區(qū)（參 考韓國(guó)專利公開2011-0047698,其公開內(nèi)容在此全部引入作為參考）。所述抗c-Met抗體 可包括韓國(guó)專利公開2011-0047698中所定義的所有抗體。
[0124] 在所述抗c-Met抗體中，所述輕鏈和所述重鏈除如上所定義的CDR、輕鏈可變區(qū)和 重鏈可變區(qū)外的其余部分為輕鏈恒定區(qū)和重鏈恒定區(qū)，可以是免疫球蛋白的任一亞型（例 如 IgA、IgD、IgE、IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、等）的那些。
[0125] 作為進(jìn)一步實(shí)例，所述抗c-Met抗體或所述抗體片段可包括：
[0126] 包含選自以下的氨基酸序列的重鏈：SEQ ID N0:62的氨基酸序列（其中所述氨基 酸序列從第1至第17位的氨基酸殘基為信號(hào)肽），或SEQ ID NO: 62從第18至第462位的 氨基酸序列、SEQ ID N0:64的氨基酸序列（其中從第1至第17位的氨基酸序列為信號(hào)肽）、 SEQ ID N0:64從第18至第461位的氨基酸序列、SEQ ID NO:的氨基酸序列（其中從第1 至第17位的氨基酸序列為信號(hào)肽）和SEQ ID NO:66從第18至第460位的氨基酸序列；和
[0127] 包含選自以下的氨基酸序列的輕鏈：SEQ ID N0:68的氨基酸序列（其中從第1至 第20位的氨基酸序列為信號(hào)肽）、SEQ ID N0:68從第21至第240位的氨基酸序列、SEQ ID NO:70的氨基酸序列（其中從第1至第20位的氨基酸序列為信號(hào)肽）、SEQ ID NO:70從第 21至第240位的氨基酸序列和SEQ ID NO: 108的氨基酸序列。
[0128] 例如，所述抗c-Met抗體可選自：
[0129] 包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62從第18至第462位氨基酸 序列的重鏈和含SEQ ID N0:68的氨基酸序列或SEQ ID N0:68從第21至第240位的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0130] 包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64從第18至第461位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID N0:68的氨基酸序列或SEQ ID N0:68從第21至第240的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0131] 包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66從第18至第460位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID N0:68的氨基酸序列或SEQ ID N0:68從第21至第240的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0132] 包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62從第18至第462位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70從第21至第240的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0133] 包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64從第18至第461位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70從第21至第240的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0134] 包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66從第18至第460位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70從第21至第240的氨基 酸序列的輕鏈的抗體；
[0135] 包含含SEQ ID NO:62的氨基酸序列或SEQ ID NO:62從第18至第462位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的輕鏈的抗體；
[0136] 包含含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64從第18至第461位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的輕鏈的抗體；和
[0137] 包含含SEQ ID NO:66的氨基酸序列或SEQ ID NO:66從第18至第460位的氨基 酸序列的重鏈和含SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的輕鏈的抗體。
[0138] 根據(jù)一項(xiàng)實(shí)施方案，所述抗c-Met抗體可包含含SEQ ID NO:66從第18至第460 位的氨基酸序列的重鏈和含SEQ ID N0:68從第21至第240位的氨基酸序列的輕鏈，或含 SEQ ID N0:62的氨基酸序列或SEQ ID N0:66從第18至第460位的氨基酸序列的重鏈和含 SEQ ID NO: 108的氨基酸序列的輕鏈。
[0139] SEQ ID NO: 70的多肽為含人kappa (〇恒定區(qū)的輕鏈，而具有SEQ ID NO: 68氨基 酸序列的多肽是通過使用酪氨酸替換具有SEQ ID NO: 70氨基酸序列的多肽的62位的組氨 酸（根據(jù)kabat編號(hào)法對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:68的36位）而獲得的多肽。可通過替換增加所 述抗體的產(chǎn)率。具有SEQ ID NO: 108氨基酸序列的多肽是通過色氨酸替換32位的絲氨酸 (根據(jù)kabat編號(hào)法在SEQ ID NO:68的氨基酸殘基21-240的27e位，位于CDR-Ll內(nèi)）而 獲得的多肽。通過此類替換，包括這些序列的抗體和抗體片段展現(xiàn)出增加的活性，如c-Met 結(jié)合親和力、c-Met降解活性和Akt磷酸化抑制。
[0140] 在另一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述抗c-Met抗體可包括含SEQ ID NO: 106的氨基酸序列 的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)、含SEQ ID NO: 107的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)或含SEQ ID NO: 108的 氨基酸序列的輕鏈。
[0141] 另一項(xiàng)實(shí)施方案提供消耗靶膜蛋白的方法，其包括使用消耗靶膜蛋白的組合物或 使用包含于該組合物中的二元結(jié)合分子（或雙特異性抗體）處理細(xì)胞，或者向需要消耗靶 膜蛋白的患者給予消耗靶膜蛋白的組合物或包含于該組合物中的二元結(jié)合分子（或雙特 異性抗體）。所述消耗靶膜蛋白的方法可進(jìn)一步包括在給予步驟前鑒別需要消耗靶膜蛋白 的患者的步驟。
[0142] 根據(jù)另一方面，提供了所述組合物或所述二元結(jié)合分子（或特異性抗體）在靶膜 蛋白消耗中的用途。
[0143] 所述細(xì)胞可以是任何源自哺乳動(dòng)物包括靈長(zhǎng)類如人和猴、或嚙齒類如小鼠和大鼠 的任何有活力的細(xì)胞。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以是癌細(xì)胞并表達(dá)驅(qū)動(dòng)物膜蛋白，例 如質(zhì)膜中的c-Met蛋白。所述細(xì)胞可存在于機(jī)體中或可以是自機(jī)體分離的細(xì)胞。所述患者 可以是哺乳動(dòng)物，包括靈長(zhǎng)類如人和猴，或嚙齒類如小鼠和大鼠，且可以是患有與靶膜蛋白 相關(guān)的疾病例如癌癥的個(gè)體。
[0144] 已知c-Met與RTK包括EGFR在癌細(xì)胞中共表達(dá)，并且由于所述癌細(xì)胞對(duì)抗癌劑的 耐受性，在c-Met和其它RTK之間存在串?dāng)_。因此，抑制c-Met和RTK如EGFR或HER2兩者 為研發(fā)克服對(duì)常規(guī)抗癌劑的耐受性和常規(guī)抗癌劑所具有的問題的新抗癌劑提供了設(shè)想。
[0145] 另一項(xiàng)實(shí)施方案提供了預(yù)防和/或治療癌癥的藥物組合物，其包括消耗靶膜蛋白 的組合物或二元結(jié)合分子（或特異性抗體）作為活性成分、并包括載體、稀釋劑或賦形劑。
[0146] 另一項(xiàng)實(shí)施方案提供了預(yù)防和/或治療癌癥的方法，所述方法包括向需要預(yù)防和 /或治療癌癥的患者給予藥學(xué)有效量的消耗靶膜蛋白的組合物或該組合物中所用的二元結(jié) 合分子（例如雙特異性抗體）。所述預(yù)防和/或治療癌癥的方法包括在給予步驟前鑒別需 要預(yù)防和/或治療癌癥的患者的步驟。
[0147] 另一項(xiàng)實(shí)施方案提供了消耗靶膜蛋白的組合物或二元結(jié)合分子（或雙特異性抗 體）在預(yù)防和/或治療癌癥中的用途。
[0148] 所述方法可用于治療或預(yù)防任何類型的癌癥?？苫诖委煹陌┌Y類型選擇靶膜 蛋白。癌癥的實(shí)例包括但不限于鱗狀細(xì)胞癌、小細(xì)胞肺癌、費(fèi)小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀細(xì) 胞癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚或眼內(nèi)黑色素瘤、直腸癌、肛周癌、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌腺癌、 甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、慢性或急性白血病、淋巴細(xì)胞性白血病、肝癌、 胃腸癌、胃癌、胰腺癌、惡性膠質(zhì)瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細(xì)胞腺癌、乳腺癌、結(jié) 腸癌、大腸癌、子宮內(nèi)膜癌或子宮癌、唾液腺腫瘤、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌或頭部 或頸部癌。所述癌癥可以是原發(fā)癌或轉(zhuǎn)移癌。具體地，所屬癌癥可以是對(duì)常規(guī)抗癌劑耐藥 的癌癥，例如對(duì)所述靶膜蛋白的拮抗劑耐藥的癌癥。
[0149] 除消耗靶膜蛋白的組合物或該組合物中所用的二元結(jié)合分子（或雙特異性抗體） 夕卜，所述藥物組合物可包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑。
[0150] 只要通?？捎糜诳贵w的藥物制劑，任何藥學(xué)上可接受的載體可包含于該藥物組合 物中。所述可用于該藥物組合物的藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例可包括乳糖、右旋糖、蔗糖、 山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷 酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、甲基羥基苯甲酸酯、丙基羥基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸鎂、 礦物油或其任意組合，但不限于此。除這些組分外，所述藥物組合物可進(jìn)一步包含選自以下 的典型的添加劑：稀釋劑、賦形劑、潤(rùn)滑劑、潤(rùn)濕劑、甜味劑、香味增強(qiáng)劑、乳化劑、混懸劑、防 腐劑和其組合。
[0151] 所述藥物組合物可經(jīng)口服或胃腸外給予。對(duì)于胃腸外給予，該給予可經(jīng)由靜脈內(nèi)、 皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、局部、鼻內(nèi)、肺內(nèi)和直腸內(nèi)途徑進(jìn)行，但不限于此。然而，對(duì)于口 服給予，所述藥物組合物可被包被或調(diào)配以保護(hù)活性成分在胃中免遭降解，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)和 肽可被胃蛋白酶分解。此外，該給予可在適于將所述藥物組合物遞送至靶細(xì)胞的儀器的輔 助下進(jìn)行。
[0152] 取決于多種因素，包括制劑的類型、患者的年齡、體重和性別、所治療病癥的嚴(yán)重 程度、飲食、給藥時(shí)間、給藥途徑、排泄速率和敏感度，有效量是可變的。例如，對(duì)于成人，所 述組合物可以單劑0. OOlmg至100mg/kg給予。如本文所用，術(shù)語"藥學(xué)有效量"指的是有 效預(yù)防或治療癌癥所使用的量。
[0153] 根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知的方法，所述藥物組合物可與藥學(xué)上可接受的載體 和/或賦形劑一起被調(diào)配成單位劑型，或者包含于多劑量包裝中。在本文中，所述藥物組合 物可被調(diào)配成油或水性介質(zhì)中的溶液、混懸劑、糖漿劑、乳劑、酏劑、散劑、顆粒劑、片劑或膠 囊劑，且可進(jìn)一步包含崩解劑或穩(wěn)定劑。
[0154] 所述藥物組合物可被單獨(dú)給予或與其它治療劑組合給予。在此情況中，它們被與 常規(guī)治療劑序貫給予或同時(shí)給予。
[0155] 包含二元結(jié)合分子（例如雙特異性抗體）的藥物組合物可被調(diào)配成免疫脂質(zhì)體。 包含抗體的脂質(zhì)體可可使用本領(lǐng)域公知的方法制備。所述免疫脂質(zhì)體可通過反相蒸發(fā)從包 含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG化的磷脂酰乙醇胺的脂質(zhì)組合物產(chǎn)生。例如，F(xiàn)ab'可通過二 硫化物再形成而偶聯(lián)至脂質(zhì)體。所述脂質(zhì)體可進(jìn)一步含有抗癌劑如多柔比星。
[0156] 被給予該藥物組合物或者需要預(yù)防和/或治療癌癥的患者可包括哺乳動(dòng)物，其包 括靈長(zhǎng)類如人或猴，和嚙齒類如大鼠和小鼠，或衍生（分離）自上述動(dòng)物的細(xì)胞或組織，但 不僅限于此，并且可以是，例如，對(duì)所述靶膜蛋白的拮抗劑有抗性的癌癥患者。
[0157] 如上文所解釋，靶膜蛋白和驅(qū)動(dòng)蛋白（其負(fù)責(zé)使相同質(zhì)膜中的靶膜蛋白內(nèi)化至細(xì) 胞中和降解）的共存是靶膜蛋白消耗的先決條件。在此條件下，所述二元結(jié)合分子（觸發(fā) 物）與所述靶蛋白的驅(qū)動(dòng)物偶聯(lián)，從而觸發(fā)所述驅(qū)動(dòng)子和所述靶內(nèi)化至細(xì)胞中并降解。所 述驅(qū)動(dòng)子和靶蛋白必須在相同的質(zhì)膜中共存，并且可內(nèi)化至細(xì)胞中并在細(xì)胞內(nèi)降解。所述 二元結(jié)合分子（觸發(fā)物）是一種能夠高親和力地結(jié)合靶膜蛋白和驅(qū)動(dòng)物的分子，并且觸發(fā) 所述驅(qū)動(dòng)子內(nèi)化至細(xì)胞中并降解，從而將所述靶拉進(jìn)細(xì)胞質(zhì)并導(dǎo)致所述靶的降解。
[0158] 圖3的示意圖解釋了一項(xiàng)實(shí)施方案的驅(qū)動(dòng)物蛋白和觸發(fā)物（二元結(jié)合抗體）。 EGFR，一種已知的作為抗癌靶點(diǎn)的膜蛋白，當(dāng)經(jīng)其相應(yīng)的抗體處理時(shí)，其被抑制，但是卻未 被從有活力細(xì)胞的質(zhì)膜中耗盡。在一項(xiàng)實(shí)施方案中，所述驅(qū)動(dòng)物為含表位的c-Met蛋白，且 所述二元結(jié)合抗體為對(duì)該表位和該驅(qū)動(dòng)物均展現(xiàn)出高親和力的雙特異性抗體，允許c-Met 有效地內(nèi)化至細(xì)胞中并降解而不引起副作用（激動(dòng)作用）。
[0159] 事實(shí)上在應(yīng)用至臨床樣品后，預(yù)期靶膜蛋白消耗技術(shù)會(huì)引起以下作用：
[0160] 1.為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域提供一種研究膜蛋白功能的新時(shí)代的工具和方法，其可象 siRNA技術(shù)一樣被商業(yè)化。
[0161] 2.擴(kuò)展雙特異性抗體的產(chǎn)品線：生產(chǎn)抗c-Met和第二靶點(diǎn)的雙特異性抗體（其中 當(dāng)所述第二靶點(diǎn)與c-Met被共抑制時(shí)，預(yù)期所述第二靶點(diǎn)有協(xié)同效果），并且由于其消耗所 述抗癌靶點(diǎn)的能力其可用作抗癌劑，從而擴(kuò)展了抗癌劑的產(chǎn)品線。
[0162] 3.增加對(duì)抗癌療法相關(guān)的主要靶點(diǎn)如EGFR、HER2等的功效：該技術(shù)允許這些靶點(diǎn) 的所有同二聚體和異二聚體的降解，從而抑制這些靶點(diǎn)的原癌基因的功能。
[0163] 4.克服c-Met相關(guān)的耐藥性并生產(chǎn)具有增強(qiáng)的c-Met抗癌活性的抗體試劑。
[0164] 通過以下實(shí)施例可獲得對(duì)本發(fā)明更好的理解，這些實(shí)施例意在解釋說明本發(fā)明， 而不應(yīng)理解為限制本發(fā)明。
[0165] 實(shí)施例
[0166] 參考例1:抗c-Met抗體的構(gòu)建
[0167] I. L生產(chǎn)"AbF46"，一種針對(duì)c-Met的小鼠抗體
[0168] 1.1.1.小鼠的免疫
[0169] 為獲得生成雜交瘤細(xì)胞系所需的免疫小鼠，5只4-6周齡的BALB/c小鼠（Japan SLC, Inc.)各自經(jīng)腹膜內(nèi)注射100 μ g人c-Met/Fc融合蛋白（R&D Systems)和1倍體積的 完全弗氏佐劑的混合物。注射的兩周后，對(duì)相同小鼠第二次腹膜內(nèi)注射50μ g人c-Met/Fc 蛋白和1倍體積不完全弗氏佐劑的混合物。在第二次免疫的一周后，免疫應(yīng)答被末次加強(qiáng)。 三天后，從小鼠尾部取血并將血清以1/1000稀釋于PBS中并用于通過ELISA檢查抗體對(duì) c-Met的效價(jià)。選擇有足夠抗體效價(jià)的小鼠用于細(xì)胞融合過程。
[0170] I. 1. 2.細(xì)胞融合和雜交瘤的生成
[0171] 在細(xì)胞融合的三天前，BALB/c小鼠（Japan SLC，Inc.)經(jīng)腹膜內(nèi)注射50yg人 c-Met/Fc融合蛋白和1倍體積PBS的混合物而免疫。將免疫小鼠麻醉，然后將脾臟從左側(cè)身 體切除。將脾臟過篩以分離脾細(xì)胞，然后將脾細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基（DMEM，GIBC0, Invitrogen) 中。離心該細(xì)胞懸浮液以回收細(xì)胞層。將所獲得的脾細(xì)胞（IxlO8細(xì)胞）與骨髓瘤細(xì)胞 (Sp2/0) (IxlO8細(xì)胞）混合，然后自旋以得到細(xì)胞沉淀（pellet)。將該細(xì)胞沉淀緩慢地懸 浮，用含45%聚乙二醇（PEG) (ImL)的DMEM在37°C處理1分鐘，補(bǔ)加ImL DMEM。在10分鐘 內(nèi)向這些細(xì)胞中添加IOmL DMEM，然后在37°C水浴中溫育5分鐘。將細(xì)胞體積調(diào)整至50mL， 然后離心。將所形成的細(xì)胞沉淀以密度為1?2X IO5細(xì)胞/mL再懸浮于選擇培養(yǎng)基（HAT 培養(yǎng)基）中，給96孔板的每個(gè)孔分配0. ImL細(xì)胞懸浮液，隨后在37°C在CO2培養(yǎng)箱中溫育， 以建立雜交瘤細(xì)胞群。
[0172] I. 1. 3.選擇產(chǎn)生針對(duì)c-Met蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
[0173] 用人c-Met/Fc融合蛋白和人Fc蛋白作為抗原，通過ELISA，從參考例I. 1. 2所建 立的雜交瘤細(xì)胞群中篩選對(duì)c-Met顯示特異性應(yīng)答的雜交瘤細(xì)胞。
[0174] 將人c-Met/Fc融合蛋白以50 μ L (2 μ g/mL)/孔的量接種于微量滴定板，使其附著 于每個(gè)孔的表面。通過洗滌除去仍未結(jié)合的抗體。為了用于選擇不結(jié)合c-Met但識(shí)別Fc 的抗體，以相同的方式將人Fc蛋白附著于微滴板表面。
[0175] 將參考例I. 1. 2所獲得的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)物以50 μ L的量添加至所述板的各孔中 并培養(yǎng)1小時(shí)。使用足量的Tris緩沖鹽水和吐溫20(TBST)洗出仍未反應(yīng)的細(xì)胞。將山羊 抗小鼠IgG-辣根過氧化物酶（HRP)添加至所述板并在室溫培養(yǎng)1小時(shí)。使用足量的TBST 洗滌所述板，隨后將過氧化物酶與底物（OPD)反應(yīng)。在ELISA讀數(shù)器上測(cè)量450nm處的吸 光度。
[0176] 重復(fù)地選擇出分泌特異性地并強(qiáng)烈地結(jié)合人c-Met但不結(jié)合人Fc的抗體的雜 交瘤細(xì)胞系。在經(jīng)重復(fù)選擇獲得的雜交瘤細(xì)胞系中，通過有限稀釋最終分離出產(chǎn)生單克 隆抗體的單個(gè)克隆。根據(jù)布達(dá)佩斯條約，所述產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系的單個(gè) 克隆于2009年10月9日保藏于韓國(guó)細(xì)胞系研究基金會(huì)（Korean Cell Line Research Foundation)，一家位于 Yungun-Dong, Jongno-Gu, Seoul, Korea 的國(guó)際保藏單位，保藏號(hào)為 KCLRF-BP-00220(參考韓國(guó)專利公開（Laid-Open Publication) 2011-0047698)。
[0177] I. I. 4.單克隆抗體的產(chǎn)生和純化
[0178] 將參考例I. 1. 3中獲得的雜交瘤細(xì)胞系培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基中，并從該細(xì)胞培養(yǎng) 物中產(chǎn)生和純化單克隆抗體（AbF46)。
[0179] 首先，將于補(bǔ)充有10% (v/v)FBS的50ml培養(yǎng)基（DMEM)中培養(yǎng)的雜交瘤細(xì)胞離 心，細(xì)胞沉淀用20ml PBS洗滌兩次或更多次以從中除去FBS。然后將細(xì)胞再懸浮于50mL DMEM中，37°C在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。
[0180] 通過離心除去細(xì)胞后，上清液在4°C保存?zhèn)溆没蛘吡⒓从糜诳贵w的分離和純化。使 用配備有親和柱（G蛋白瓊脂糖柱；Pharmacia, USA)的AKTA system(GE Healthcare)從 50-300mL上清液中純化抗體，然后使用過濾器（Amicon)濃縮。將抗體的PBS溶液貯存好， 以備下述實(shí)施例所用。
[0181] L 2.構(gòu)建chAbF46, 一種針對(duì)c_Met的嵌合抗體
[0182] 小鼠抗體易于在人中激發(fā)免疫原性。為了解決該問題，用人IgGl抗體的氨基酸序 列替換恒定區(qū)而不是對(duì)抗體特異性負(fù)責(zé)的可變區(qū)，從而從參考例1. 1.4所產(chǎn)生的小鼠抗體 AbF46構(gòu)建嵌合抗體chAbF46。
[0183] 為此，將基因設(shè)計(jì)成包括重鏈核苷酸序列"EcoRI-信號(hào)序 列-VH-NheI-CH-TGA-XhoI"（SEQ ID NO:38)和輕鏈核苷酸序列 "EcoRI-信號(hào)序 列-VL-BsiWI-CL-TGA-XhoI "（SEQ ID NO: 39)，并合成。然后，具有重鏈核苷酸序列 (SEQ ID NO: 38)的DNA片段和具有輕鏈核苷酸序列（SEQ ID NO: 39)的DNA片段被 EcoRI (NEB, R0101S)和XhoI (NEB, R0146S)消化，然后被分別克隆至OptiCHO?抗體表達(dá)試 劑盒（目錄號(hào)12762-019, Invitrogen)中的p0ptiVEC?-T0P0 TA克隆試劑盒中，和克隆至 pcDNA?3.3-T0P0 TA克隆試劑盒（目錄號(hào)8300-01)中。
[0184] 所構(gòu)建的載體每一個(gè)都用Qiagen Maxiprep試劑盒（目錄號(hào)12662)擴(kuò)增，并用 Freestyle? MAX293表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。293F細(xì)胞用于表達(dá)并以懸浮 培養(yǎng)的方式在FreeStyl eTM293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在瞬時(shí)表達(dá)的前一天，以5x10s細(xì)胞/ ml的濃度提供細(xì)胞，24小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到IxlO 6細(xì)胞/ml時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。通過脂 質(zhì)體試劑法使用Freestyle? MAX試劑（invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中在一個(gè)15ml管中，將 1:1 的 DNA 混合物（重鏈 DNA:輕鏈 DNA)與 2ml OptiPro? SFM(invitrogen)混合（A 管）， 在另一 15ml 管中，ΙΟΟμΙ (微升）Freestyle? MAX試劑和 2ml OptiPro? SFM混合（B 管）， 隨后將A管和B管混合并保溫15分鐘。將所獲得的混合物緩慢地與瞬時(shí)表達(dá)前一天提供 的細(xì)胞緩慢混合。在結(jié)束轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在37°C、80%濕度和8% CO2的條件下在130rpm培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
[0185] 然后將細(xì)胞在37°C在5% CO2條件下在補(bǔ)充有10% (v/v) FBS的DMEM中培養(yǎng)5小 時(shí)，然后在37°C在5% CO2條件下在無FBS的DMEM中培養(yǎng)48小時(shí)。
[0186] 離心后，將上清液應(yīng)用于AKTA prime (GE Healthcare)以純化抗體。為 此，將IOOmL上清液以5mL/min的流速上樣至配備有蛋白A柱的AKTA Prime (GE healthcare, 17-0405-03)，隨后用 IgG洗脫緩沖液（Thermo Scientific, 21004)進(jìn)行洗脫。 將所述緩沖液與PBS交換，以純化嵌合抗體AbF46 (以下稱為"chAbF46"）。
[0187] 1. 3.從嵌合抗體chAbF46構(gòu)建人源化抗體huAbF46
[0188] 1.3. 1.重鏈的人源化
[0189] 為設(shè)計(jì)兩個(gè)域Hl-重鏈和H3-重鏈,分析了與參考例1. 2中純化的小鼠抗體AbF46 的VH基因享有最高同一性/同源性的人種系基因。一項(xiàng)Ig BLAST (www. ncbi. nlm. nih. gov/ igblast/)結(jié)果顯示，VH3-71在氨基酸水平具有83%的同一性/同源性。小鼠抗體AbF46 的⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3根據(jù)Kabat編號(hào)法定義。設(shè)計(jì)將小鼠抗體AbF46的⑶R引入 VH3-71的框架中。于是，在位置30(S -T)、48(V -L)、73(D -N)和78(T -L)處進(jìn)行了 小鼠 AbF46的氨基酸序列的回復(fù)突變。然后，Hl進(jìn)一步在位置83 (R - Κ)和84 (A - Τ)處 突變，以最終建立Hl-重鏈（SEQ ID N0:40)和H3-重鏈（SEQ ID N0:41)。
[0190] 為了設(shè)計(jì)H4-重鏈，通過BLAST搜索分析多個(gè)人抗體框架。結(jié)果顯示，已知的最穩(wěn) 定的VH3亞型在框架和序列方面與小鼠抗體AbF45非常相似。小鼠抗體AbF46的⑶R-H1、 ⑶R-H2和⑶R-H3根據(jù)Kabat編號(hào)法定義并被引入至VH3亞型以構(gòu)建H4-重鏈（SEQ ID N0:42)。
[0191] 1.3. 2.輕鏈的人源化
[0192] 為了設(shè)計(jì)兩個(gè)域Hl-輕鏈（SEQ ID NO: 43)和H2-輕鏈（SEQ ID NO: 44)，分析了與 小鼠抗體AbF46的VH基因享有最高同一性/同源性的人種系基因。Ig BLAST搜索結(jié)果顯 示，VK4-1在氨基酸水平具有75%的同一性/同源性。小鼠抗體AbF46的⑶R-L1、⑶R-L2 和⑶R-L3根據(jù)Kabat編號(hào)法定義。設(shè)計(jì)將小鼠抗體AbF46的⑶R引入VK4-1的框架中。于 是，在位置36 (Y - H)、46 (L - M)和49 (Y - I)處進(jìn)行了小鼠AbF46的氨基酸序列的回復(fù) 突變。僅在H2-輕鏈的位置49 (Y - I)處進(jìn)行一個(gè)回復(fù)突變。
[0193] 為了設(shè)計(jì)H3-輕（SEQ ID N0:45)，通過BLAST搜索分析了多個(gè)與小鼠抗體AbF46 的VL基因享有最高同一性/同源性的人種系基因。結(jié)果，選擇了 VK2-40。發(fā)現(xiàn)小鼠抗體 AbF46的VL與VK2-40在氨基酸水平具有61 %的同一性/同源性。所述小鼠抗體的⑶R-Ll、 CDR-L2和CDR-L3根據(jù)Kabat編號(hào)法定義并被引入至VK2-40的框架中。在H3-輕的位置 36 (Y - H)、46 (L - M)和49 (Y - I)處進(jìn)行回復(fù)突變。
[0194] 為了用于設(shè)計(jì)H4-輕鏈（SEQ ID NO: 46)，分析了多個(gè)人抗體框架。BLAST搜索顯 示，已知的最穩(wěn)定的Vkl亞型在框架和序列方面與小鼠抗體AbF46非常相似。小鼠抗體 AbF46的CDR-LUCDR-L2和CDR-L3根據(jù)Kabat編號(hào)法定義并被引入至Vkl亞型中。于是， 在H4-輕鏈的位置36 (Y - H)、46 (L - M)和49 (Y - I)處進(jìn)行回復(fù)突變。
[0195] 此后，具有重鏈核苷酸序列（H1-重鏈：SEQ ID N0:47, H3-重鏈：SEQ ID N0:48，H4-重鏈：SEQ ID N0:49)的DNA片段和具有輕鏈核苷酸序列（Hl-light:SEQ ID N0:50，H2-light:SEQ ID N0:51，H3-light:SEQ ID N0:52，H4-light:SEQ ID N0:53)的DNA 片段經(jīng)EcoRI (NEB, R0101S)和XhoI (NEB, R0146S)消化，然后被分別克隆至OptiCHO?抗體 表達(dá)試劑盒（目錄號(hào)12762-019, Invitrogen)中的p0ptiVEC?-T0P0 TA克隆試劑盒中，和 克隆至pcDNA?3.3-T0P0 TA克隆試劑盒（目錄號(hào)8300-01)中，從而構(gòu)建多個(gè)重組載體以表 達(dá)人源化抗體。
[0196] 所構(gòu)建的載體每一個(gè)都用Qiagen Maxiprep試劑盒（目錄號(hào)12662)擴(kuò)增，并用 Freestyle? MAX293表達(dá)系統(tǒng)（invitrogen)進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。293F細(xì)胞用于表達(dá)并以懸浮 培養(yǎng)的方式在FreeStyleTM293表達(dá)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在瞬時(shí)表達(dá)的前一天，以5x10 s細(xì)胞/ ml的濃度提供細(xì)胞，24小時(shí)后，當(dāng)細(xì)胞數(shù)目達(dá)到IxlO6細(xì)胞/ml時(shí)，進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)。通過脂 質(zhì)體試劑法使用Freestyle? MAX試劑（invitrogen)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，其中在一個(gè)15ml管中，將 1:1 的 DNA 混合物（重鏈 DNA:輕鏈 DNA)與 2ml OptiPro? SFM(invitrogen)混合（A 管）， 在另一 15ml 管中，ΙΟΟμΙ (微升）Freestyle? MAX試劑和 2ml OptiPro? SFM混合（B 管）， 隨后將A管和B管混合并保溫15分鐘。將所獲得的混合物緩慢地與瞬時(shí)表達(dá)前一天提供 的細(xì)胞緩慢混合。在結(jié)束轉(zhuǎn)染后，將細(xì)胞在37°C、80%濕度和8% CO2的條件下在130rpm培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天。
[0197] 離心后，將上清液應(yīng)用于AKTA prime (GE Healthcare)以純化抗體。為 此，將IOOmL上清液以5mL/min的流速上樣至配備有蛋白A柱的AKTA Prime (GE healthcare, 17-0405-03)，隨后用 IgG 洗脫緩沖液（Thermo Scientific, 21004)進(jìn)行洗脫。 將所述緩沖液與PBS交換，以純化人源化抗體AbF46 (以下稱為"huAbF46"）。以下實(shí)施例 中所用的人源化抗體huAbF46包括H4-重鏈（SEQ ID N0:42)和H4-輕鏈（SEQ ID N0:46) 的組合。
[0198] L 4.構(gòu)建huAbF46抗體的scFV文庫(kù)
[0199] 為了用于從huAbF46抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)構(gòu)建huAbF46抗體的scFV,將一個(gè) 基因設(shè)計(jì)成對(duì)于每個(gè)重鏈和輕鏈可變區(qū)具有"VH-連接子-VL"的結(jié)構(gòu)，該連接子具有氨基 酸序列 "GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS"（SEQ ID N0:54)。在 Bioneer 中合成編碼所設(shè)計(jì)的 huAbF46的scFV的多核苷酸序列（SEQ ID NO:55)并且該多核苷酸的表達(dá)載體具有SEQ ID NO:56的核苷酸序列。
[0200] 在表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物對(duì)c-Met展現(xiàn)出特異性。
[0201] 1. 5.用于親和力成熟的文庫(kù)基因的構(gòu)建
[0202] 1. 5. 1.靶⑶R的選擇和引物的合成
[0203] 在以下步驟中實(shí)現(xiàn)huAbF46的親和力成熟。首先，6個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R)根據(jù) Kabat編號(hào)法定義。在下表1中給出所述⑶R。
[0204] 表 1
[0205]

【權(quán)利要求】
1. 一種消耗靶膜蛋白的組合物，其包含一種二元結(jié)合分子，其中： 所述二元結(jié)合分子包含結(jié)合驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的第一結(jié)合域和結(jié)合靶膜蛋白的第二結(jié)合 域，且 所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白與細(xì)胞膜上有靶蛋白的部位結(jié)合，且當(dāng)所述二元結(jié)合分子的第一結(jié) 合域結(jié)合所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白時(shí)，所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白被內(nèi)在化到細(xì)胞中并被降解。
2. 依照權(quán)利要求1的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述驅(qū)動(dòng)物蛋白和所述靶膜蛋白各 自獨(dú)立地選自下組：受體、通道蛋白、膜酶、脂蛋白、整聯(lián)蛋白、以及細(xì)胞表面標(biāo)志物，且所述 驅(qū)動(dòng)物膜蛋白通過與配體、抗體、非抗體蛋白質(zhì)或肽的相互作用而被內(nèi)在化。
3. 依照權(quán)利要求2的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述驅(qū)動(dòng)物蛋白和所述靶膜蛋白 各自獨(dú)立地選自下組：受體酪氨酸激酶（RTK)、G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR)、運(yùn)鐵蛋白受體、低 密度脂蛋白（LDL)受體和分化抗原簇（cluster of differentiation, CD)、四穿膜區(qū)蛋白 (tetraspanin)、以及抗體藥物偶聯(lián)物（ADC)的膜靶物。
4. 依照權(quán)利要求3的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述靶膜蛋白選自下組：表皮生長(zhǎng) 因子受體（EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR)、HER2蛋白（人表皮生長(zhǎng)因子受體2蛋 白）、HER3蛋白（人表皮生長(zhǎng)因子受體3蛋白）、血小板來源的生長(zhǎng)因子受體（PDGFR)、CD9、 CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NETl、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、Tspan3、TM4B、 CD22、CD79b、CD22、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、CD74、TACSTD2、CEA、葉酸受體 1、CD37、 粘蛋白 16、ETB、STEAPI、CD70、SLC44A4、柄蛋白 4 (Nect in4)、AGS-16、鳥苷酰環(huán)化酶 C、粘蛋 白 l、EGFRvIII、和間皮素（Mesothelin)。
5. 依照權(quán)利要求3的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白選自下組：c-Met 蛋白、c-Met蛋白突變體、表皮生長(zhǎng)因子受體、HER2、HER3、血小板來源的生長(zhǎng)因子受體、血 管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體、ephrin受體、運(yùn)鐵蛋白受體、低密度脂蛋白受 體、CDlla、CD20、CD3、CD33、CD44、CD59、CD73、CD152 (CTLA4)、NTRK2 (神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)性酪氨酸激 酶）、CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、Tspan2、 Tspan3、TM4B、CD22、CD79b、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、CEA、葉 酸受體1、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAP1、CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鳥苷酰環(huán)化酶C、 粘蛋白l、EGFRvIII、和間皮素。
6. 依照權(quán)利要求1的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述二元結(jié)合分子是包含第一和第 二結(jié)合域的雙特異性抗體，且 所述第一結(jié)合域是針對(duì)所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段，且 所述第二結(jié)合域是針對(duì)所述靶膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段。
7. 依照權(quán)利要求6的消耗靶膜蛋白的組合物， 其中針對(duì)所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的抗體或其抗原結(jié)合片段是抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合 片段。
8. 依照權(quán)利要求7的消耗靶膜蛋白的組合物， 其中所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段與包含c-Met蛋白SEMA域（SEQ ID NO:79) 內(nèi)的5個(gè)或更多個(gè)連續(xù)氨基酸且包含SEQ ID NO:73所示氨基酸序列（EEPSQ)的表位特異 性結(jié)合。
9. 依照權(quán)利要求8的消耗靶膜蛋白的組合物， 其中所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段與包含SEQ ID NO: 71的5至19個(gè)連續(xù)氨基 酸且包含SEQ ID ON: 73所示氨基酸序列的表位特異性結(jié)合。
10. 依照權(quán)利要求8的消耗靶膜蛋白的組合物， 其中所述抗c-Met抗體或其抗原結(jié)合片段包含： 至少一個(gè)選自下組的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)（⑶R) : (a)⑶R-H1，包含SEQ ID N0:4的氨基酸 序列；（b)CDR-H2,包含SEQ ID NO:5、或SEQ ID NO:2的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:2 的包括第3至第10位在內(nèi)的8-19個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列；和（c)⑶R-H3,包含SEQ ID NO:6、或SEQ ID NO:85的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:85的包括第1至第6位在內(nèi)的 6-13個(gè)連續(xù)氨基酸的氨基酸序列，或含有所述至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)的重鏈可變區(qū)； 至少一個(gè)選自下組的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)：(a)⑶R-L1，包含SEQ ID N0:7的氨基酸序列； (b)CDR-L2，包含SEQIDN0:8的氨基酸序列，和（c)CDR-L3，包含SEQIDN0:9、或SEQID NO:86的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:89的包括第1至第9位在內(nèi)的9-17個(gè)連續(xù)氨基酸 的氨基酸序列，或含有所述至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的輕鏈可變區(qū)； 所述至少一個(gè)重鏈互補(bǔ)決定區(qū)與所述至少一個(gè)輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)的組合；或 所述重鏈可變區(qū)與所述輕鏈可變區(qū)的組合。
11. 依照權(quán)利要求1的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述第一結(jié)合域是結(jié)合所述驅(qū)動(dòng) 物膜蛋白的抗體，而所述第二結(jié)合域是與結(jié)合所述驅(qū)動(dòng)物膜蛋白的所述抗體的c端相連 的、結(jié)合所述祀膜蛋白的scFv、（scFv) 2、Fab、Fab'、F(ab'）2或抗體模擬物。
12. 依照權(quán)利要求11的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述第一結(jié)合域是抗c-Met抗體。
13. 依照權(quán)利要求1的消耗靶膜蛋白的組合物，其中所述第一結(jié)合域是抗c-Met抗體而 所述第二結(jié)合域是抗EGFR抗體、抗HER2抗體、抗HER3抗體、抗VEGFR抗體、抗TOGFR抗體、 抗IGF-IR抗體、或其抗原結(jié)合片段。
14. 依照權(quán)利要求13的消耗靶膜蛋白的組合物，其中， 所述抗EGFR抗體是西妥昔單抗（cetuximab)、帕尼單抗（panitumumab)、馬妥珠單 抗（matuzumab)、奈昔木單抗（necitumumab)、尼妥珠單抗（nimotuzumab)、扎魯木單抗 (zalutumumab)、MM-151，或包含以下的抗體：包含 SEQ ID N0:109 或 SEQ ID N0:111 的氨 基酸序列的重鏈可變區(qū)和包含SEQ ID NO: 110或SEQ ID NO: 112的氨基酸序列的輕鏈可變 區(qū)， 所述抗HER2抗體是曲司珠單抗（trastuzumab)或帕妥珠單抗（pertuzumab)， 所述抗HER3抗體是RG-7597， 所述抗VEGFR抗體是雷莫蘆單抗（ramucirumab)， 所述抗F1DGFR抗體是奧拉圖單抗（olaratumab)，和 所述抗IGF-IR抗體是西旭木單抗（cixutumumab)。
15. -種用于預(yù)防或治療癌癥的組合物，其包含依照權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)的消耗 靶膜蛋白的組合物。
16. -種包含連接至第二結(jié)合域的第一結(jié)合域的二元結(jié)合分子，其中所述第一結(jié)合域 是結(jié)合c-Met蛋白的抗體或抗原結(jié)合片段，而所述第二結(jié)合域是結(jié)合以下的抗體或抗原結(jié) 合片段：表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR)、HER2蛋白（人表皮 生長(zhǎng)因子受體2蛋白）、HER3蛋白（人表皮生長(zhǎng)因子受體3蛋白）、血小板來源的生長(zhǎng)因子 受體（PDGFR)、CD9、CD81、CD151、CD63、CD37、CD53、NET1、NET2、NET4、NET5、NET6、TM4SF6、 Tspan2、Tspan3、TM4B、CD22、CD79b、GPNMB、CD19、CD56、CD138、PSMA、EGFR、CD74、TACSTD2、 CEA、葉酸受體l、CD37、粘蛋白16、ETB、STEAPl、CD70、SLC44A4、柄蛋白4、AGS-16、鳥苷酰環(huán) 化酶C、粘蛋白l、EGFRvIII或間皮素。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK104211814SQ201410234917
【公開日】2014年12月17日 申請(qǐng)日期:2014年5月29日 優(yōu)先權(quán)日:2013年5月29日
【發(fā)明者】鄭光鎬, 李承炫, 趙美英, 高榮脧, 林柏瑋, C.李黃載雄 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社