水（18.2MQcm)。氯化鐘脅1，> 99% )、磯酸氨二鐘化2冊(cè)〇4,分析純）、 十二烷基-0-〇-麥芽糖巧抑通，>98%)、來自牛屯、臟的細(xì)胞色素〇(巧*(3，〉95%)購自 Si卵a(bǔ)-Al化ich。L(+)-抗壞血酸（> 99% )購自Carl-Ro1:h。1, 2-二植燒酷-sn-甘油-3-磯 酸膽堿（Di化yPC，>99% )和1，2-二油酷-sn-甘油酷-3-磯脂酷己醇胺-N-(l-巧橫酷基） 巧-DOPE(巧，>99%)購自Avanti化larLipids。電位敏感性巧光染料二-8-ANEPPS(二-8-了 基-氨基-蒙基-亞己基-化晚嗦-丙橫酸醋），二-4-ANBD孤S(4- (1- [2-(二-正了基）-6-蒙 基]-4-了二締基）-1-(4-了橫酷基）嗟咐鐵甜菜堿），和磯脂NBD-PE(1，2-雙十六碳酷-sn-甘 油酷-3-磯酷-(N-[4-硝基苯-2-曠-1, 3-二挫基）己醇胺）購自Invitrogen。根據(jù)IXlrr 等人（JournalofMolecularBiology2008, 384, 865-877)表達(dá)并純化來自脫氮副球菌 (Paracoccusdenitrificans)的具有工程化至亞基IC末端的His標(biāo)簽的細(xì)胞色素C氧化酶 肪0)。
[0080] 用天然CcO制備物免疫后，獲得兔多克隆第一抗體，此處作為與亞基I和II特異 性反應(yīng)的富集IgG級(jí)分使用。第二抗體，山羊抗兔IgGH&L(切5)，購自Abeam。50-150 ym 瓊脂糖珠化sPurNi-NTA樹脂購自ThermoScientific。用于蒸鍛的金粒子巧9.99% )購 自MateckGmbH(Juelich，德國）。根據(jù)Wuskell等人（JournalofNeuroscienceMethods 2006, 151，200-215)合成二-8-AN抓地SoSU8 光阻劑購自microchem。
[0081]實(shí)施例2 ;制備載有細(xì)胞色素c氧化酶的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠（PLBs):
[008引將20%己醇中混懸的0. 5血His化rNi-NTA樹脂反復(fù)地淋洗，在5xl03巧m離屯、 化eraeus化esco微量離屯、機(jī)，ThermoScientific)l分鐘并重懸，首先在超純水中，隨后在DPK緩沖溶液中（0. 05M馬冊(cè)04,0. 1MKC1，抑=8)和最終在孤MDPK緩沖液（0. 05M馬冊(cè)04， 0. 1MKC1，抑=8,0. 1%孤M)中。此后，將溶解于孤MDPK緩沖液中的CcOW終濃度197nM 吸附到Ni-NTA官能化表面。在2小時(shí)吸附時(shí)間后，將珠再次淋洗，離屯、并重懸于孤M磯酸 鹽緩沖液中，W移除非特異性吸附的蛋白質(zhì)。
[0083]透析；
[0084]從Carl Roth獲得的Spectra/化r Float-A-Lyzer (MWC0 ;500-1000Da)(體積5ml) 用4ml Di化yPC-巧DOPE在孤M-DPK緩沖液中的溶液（1:10)和載有CcO的瓊脂糖珠填 充。在N抓-PE標(biāo)記的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠的情況下，將2. 6化1. 9mM N抓-PE母液在灌注 Float-A-Lyze之前添加至DiWiyPC-巧DO陽溶液至N抓-陽終濃度12. 2 y M。樣品在1L DPK 緩沖溶液中在室溫透析24小時(shí)，在1、2、4、14、18和22小時(shí)后完全更換透析液六次。
[00財(cái)用電位敏感性巧光染料任S抑）標(biāo)記；
[0086] 在無水己醇溶液中W 2mg/10血的濃度制備PS抑二-4-AN抓地S的母液。通過W下 方式制備二-8-A肥PPS的母液：將粉末溶解W 2mg/10mL比例在DMS0中。將20 y L母液添加 至載有CcO的PLB懸液至終濃度分別是6. 6 y M和6. 9 y M二-8-ANEPPS或二-4-AN抓地S。 在溫育15-20分鐘后，通過淋洗、離屯、和重懸，將PLB在無染料的PBS緩沖溶液中洗漆3次。
[0087] 實(shí)施例3 ;激光掃描共聚焦巧光顯微術(shù)（LSM)
[008引LSM測量在具有l(wèi)Ox干式物鏡的直立式LeicaTCSSP5II顯微鏡（Leica，肥 PLAP010X/0.40C巧中實(shí)施。疏水性巧錯(cuò)定基團(tuán)，將蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠連接至流動(dòng)小室 的疏水性表面（y-slideupri曲t,ibidiGmbH,Munich,德國），因此耐受由緩沖水溶 液流通直至流速500]il/分鐘所引起的流體應(yīng)力（IPC,Ismatec,IdexHealth&Science group,Glat憂urg，瑞± )。多重氣氣激光器458nm或488nm光束或可選地化-Ne激光器的 紅色633nm光束分別用于激發(fā)NBD-PE、二-8-ANEPPS或二-4-AN抓地S。
[0089] 在二-8-A肥PPS標(biāo)記的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠情況下，測量W雙通道比率計(jì)模式 巧50-580nm和620-650nm)進(jìn)行。因?yàn)槎?4-AN抓地S的發(fā)射譜帶寬，測量W單通道高模式 實(shí)施化80-720nm)(圖5C)。為了分析背景噪聲在二-4-AN抓地S的情況下，測量也W比率計(jì) 模式化30-636nm和 680-720nm)進(jìn)行。
[0090] 實(shí)施例4 ;表面等離子體增強(qiáng)型巧光光譜法（SPF巧
[0091]SPFSW定制設(shè)置使用所述的拉'etschmann-布局巧eather, 1977,引自；Haas,G. ,Francombe,M.,比，Hoffmann,R. ,W.,(編著）PhysicsofThinFilms,第 9 卷.Academic Press,NewYork,第 145 頁）進(jìn)行。用 43nm金（HHVEdwardsAuto306，Crawley,UK)涂 鍛的玻璃載片（來自化lima化tic,Jena的LaSFN9玻璃，在633皿時(shí)折射率n= 1. 8385) 是光學(xué)上匹配于45。玻璃棱鏡（LaSFN9)基部。二-4-AN抓地S標(biāo)記的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠 黏附于金層（SpincoatG3,SpecialtyCoatingSystemsInc. ,Indiana,美國）頂部旋鍛 的光阻劑薄膜（來自microchem的SU8,25nm)的疏水性表面上。通過棱鏡導(dǎo)引來自He/Ne 激光器扣niphase，SanJose,CA，A= 632. 8nm)的單色光并由訂制的光電二極管檢測器 檢測。從該表面發(fā)射的巧光經(jīng)流動(dòng)小室由透鏡（數(shù)值口徑NA0.3)采集，通過陷波濾波器 化32. 8nm)和帶通濾波器（傳輸波長A694/10nm)導(dǎo)引并最終由光電倍增管化amamatsu冊(cè)240-01，日本）檢測到。在SPFS動(dòng)力學(xué)的情況下，用PBS淋洗9分鐘，用3. 3mMPBS-抗 壞血酸溶液淋洗6分鐘和用105yMPBS-抗壞血酸-細(xì)胞色素C溶液淋洗20分鐘的同時(shí)， W入射角0 = 65. 5°測量反射率變化和巧光強(qiáng)度變化（圖5B)。
[009引實(shí)施例5 ;巧光光譜法
[0093] 使用He-NeRed632. 8nm、10加激光（1135P，JDSUni地aseCo巧oration， Milpitas,美國）實(shí)施巧光測量，W激發(fā)與如上所述的流動(dòng)小室疏水性表面連接的 二-4-AN抓地S標(biāo)記的蛋白質(zhì)-脂質(zhì)-珠。從該表面發(fā)射的巧光信號(hào)由物鏡采集并借 助二色分光鏡江(：-6600化口-25，激光器亞基，01油1叫，德國）和632.8皿陷波濾波器 (RugateTechnologiesInc. ,Oxford,美國）與反射的激光分離。還使用lOx物鏡（MPlan NlOx0. 25NA，OlympusCo;rporation，東京，日本）。通過光譜攝制儀（Andor化amrock 303i，AndorTechnologypic.，Belfast,UK)和冷卻至-70°C的CCD光譜法檢測器系統(tǒng) (LOTOrielNewton920P,LOTOrielGmbH,Darmsta化，德國）測量巧光光譜。歸因于 二-8-AN抓地S的量子產(chǎn)率低，將數(shù)據(jù)在10個(gè)光譜范圍內(nèi)平均，每個(gè)光譜W10秒曝光時(shí)間 拍攝。
[0094] 用W下每種水溶液W流速500y1/分鐘淋洗5分鐘后測量巧光光譜：首先是化飽 和的PBS緩沖溶液，其次是PBS中的33mM抗壞血酸溶液并且第S是PBS中的33mM抗壞血 酸連同105yM細(xì)胞色素C溶液（圖5C)。
[0095] 時(shí)間解析巧光光譜法（tr-F巧
[0096] 在時(shí)間解析巧光光譜法的情況下，使用769/41nm帶通巧dmund化tics GmbH, 卡爾斯魯厄，德國）作為發(fā)射濾光片。通過與口控時(shí)間100ms的225MHz通用頻率計(jì)數(shù)器 巧3131A，Agilent Technologies,BSblillgen,德國）連接的單光子計(jì)數(shù)模塊（SPAD) (COUNT20C-FC，激光器亞基，Olching，德國）檢測巧光信號(hào)。用W下溶液淋洗的同時(shí)測量 巧光發(fā)射光子計(jì)數(shù)的變化；首先用化飽和的PBS緩沖溶液淋洗3. 5分鐘，其次用PBS中的 33mM抗壞血酸溶液淋洗4分鐘并且用PBS中的33yM抗壞血酸連同105yM細(xì)胞色素C溶 液淋洗3分鐘（圖5A)。
[0097] 實(shí)施例6 (比較例）；在設(shè)計(jì)用于表面增強(qiáng)型FTIR光譜法的平面狀雙層金表面上 類球紅細(xì)菌反應(yīng)中屯、（RC)和bcl復(fù)合體的共重構(gòu)；
[0098] 從紫色非硫細(xì)菌類球紅細(xì)菌表達(dá)并純化在M-亞基C末端處具有遺傳工程化化S 標(biāo)簽的野生型RC，根據(jù)Crofts等人，（Crofts Protein Expression and Purification 1999, 15, 370)表達(dá)并純化在巧t b亞基C末端上加多His標(biāo)簽的bcl復(fù)合體。根據(jù)Nowak 等人，（Journal of Solid State Elec1:;rochemist;ry 2011, 15, 105)在金表面上固定蛋白 質(zhì)。簡而言之，將金表面在無水DMSO中摩爾比為0. 25的lOmM DTNTA和lOmM DTP溶液內(nèi) 浸沒20小時(shí)。在用己醇和純化水淋洗后，將該表面在己酸鹽緩沖液巧OmM，抑=5.W中 的40mMNiCls內(nèi)浸沒30分鐘，隨后用純化水徹底淋洗W除去多余的NiCls。將該表面于氣 氣流下干燥，之后在測量小室中組裝并用DDM磯酸鹽緩沖液值DM-DPK) (0. 05M馬冊(cè)〇4,0. 1M KC1，pH= 8,0. 1%孤M)再水化。溶解于孤M-DPK中的RC和bcl復(fù)合物分別W終濃度lOOnM 吸附到NTA-官能化的金珠上。在28°C進(jìn)行吸附4小時(shí)的時(shí)間后，將小室用DDM-DPK淋洗 W移除非特異性吸附的蛋白質(zhì)和本體蛋白質(zhì)。此后，將DDM-DPK更換為DiPhyPC/DDM-DPK 溶液值DM-DPK中的40yMDi化yPC)。在額外泛釀的情況下，將QIO與DiPhyPC-起溶解 值iPhyPC/孤M-DPK中的6yMQ10)。通過添加生物珠至DiWiyPC/孤M-DPK溶液，W原位透 析移除孤M。
[009引實(shí)施例7 (比較例）；在ATR晶體上制備雙層金表面。
[0100]如Nowak等人（AppliedSpectroscopy2009, 63, 1068)先前所描述進(jìn)行制備。將 拋光娃衰減全反射（ATR)晶體在MPTES的10 %己醇溶液中浸沒60分鐘W錯(cuò)定金層。在用 己醇淋洗后，將樣品在氣氣流下干燥并且在l〇〇°C退火60分鐘。在冷卻至室溫后，將晶體 在水中浸沒10分鐘并在氣氣流下干燥。隨后通過電化學(xué)蒸鍛法（HHVEdwardsAuto306， 化awley，UK),將25nm金膜沉積到ATR晶體上。通過W下方式在金膜上長出金納米粒子；在 50ml鹽酸哲胺水溶液化4mM)中浸沒晶體，向所述溶液W2分鐘間隔添加500y1氯化金 (III)水合物水溶液（〇.3mM) 5次。最后，將樣品用水淋洗并在氣氣流下干燥。
[0101] 實(shí)施例8 (比較例）；Au表面上RC和bcl復(fù)合體的ATR-SEIRA-光譜法
[0102] 將Au上固定有RC和bcl復(fù)合體的電化學(xué)小室安裝在梯形單反射娃ATR晶體的頂 部。通過使用先前描述的定制設(shè)置（Nowak等人，ApplSpectrosc2009,63，1068)，將FTIR 譜儀（VERTEX70v，來自化址er，Ettlingen，德國）的IR束W入射角0 =60。偶合至晶體 中。用平行偏振光測量全部光譜。因?yàn)锳TR元件表面用電導(dǎo)體涂鍛