診斷增殖性紊亂的方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】診斷增殖性奈亂的方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及診斷和/或預(yù)測(cè)增殖性素亂尤其是腦癌例如膠質(zhì)瘤的方法。本發(fā)明還 設(shè)及相關(guān)的診斷試劑盒和有關(guān)的分析工具（例如數(shù)據(jù)庫(kù)、計(jì)算機(jī)軟件等）。
[000引發(fā)明背景
[0003] 增殖性素亂例如癌癥由不受控制的和不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞增殖引起。該樣的細(xì)胞增殖 可W導(dǎo)致相關(guān)受試者中的腫瘤形成。
[0004] 通常，腫瘤例如腦腫瘤最初在臨床上通過(guò)多種熟知的預(yù)篩成像技術(shù)的方式在受試 者中被鑒定出，所述預(yù)篩成像技術(shù)例如計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT)、磁共振成像（MRI)、X-射線(xiàn)和 正電子放射成像（PET)。然而，該樣的成像技術(shù)考慮到設(shè)備自身和操作其所需要的人力資源 的高成本，部署是昂貴的。一些該樣的成像技術(shù)需要有高等資質(zhì)的專(zhuān)業(yè)人員的復(fù)雜操作，并 且一些在可W得出結(jié)論之前需要耗時(shí)的分析。此外，如果有的話(huà)，該樣的技術(shù)很少區(qū)分良性 和惡性腫瘤。該樣，總是需要最終的活組織檢查W確認(rèn)給定的腫瘤的惡性或良性。
[0005] 活組織檢查需要侵入性手術(shù)W提取相關(guān)組織樣品。在腦腫瘤的情況下，活組織檢 查通常需要鉆孔進(jìn)入受試者的顧骨，其是高度危險(xiǎn)的且需要技能的外科手術(shù)操作。經(jīng)歷該 樣的活組織檢查的受試者之后通常需要住院兩至=天，其提出不期望的護(hù)理負(fù)擔(dān)?；罱M織 檢查被成功執(zhí)行之后，在相關(guān)腫瘤的惡性或良性被實(shí)際確定之前可能耗費(fèi)很長(zhǎng)一段時(shí)間。
[0006] 因此，提供有成本效益的、需要最少的人力資源和技術(shù)來(lái)操作并且不包括耗時(shí)分 析的預(yù)篩工具是高度期望的。此外，提供有助于W適當(dāng)?shù)母邷?zhǔn)確度而沒(méi)有活組織檢查固有 的缺點(diǎn)的相對(duì)快速確定腫瘤的惡性或良性的預(yù)篩技術(shù)是期望的。
[0007] 在近期，血液中的多種生物標(biāo)志物已經(jīng)被鑒定為特定疾病的有用指示物。例 如，細(xì)胞因子、趨化因子和生長(zhǎng)因子是介導(dǎo)一系列生理反應(yīng)的細(xì)胞信號(hào)蛋白，并且與多種 疾病相關(guān)。該樣的分子通常通過(guò)生物測(cè)定或免疫測(cè)定來(lái)檢測(cè)，生物測(cè)定或免疫測(cè)定二者 考慮到通常一次僅可W分析一種分析物而可能是耗時(shí)的。然而，在更近的時(shí)期，被設(shè)計(jì) W測(cè)量如血清、血漿和組織培養(yǎng)物上清液的多種基質(zhì)中的多種細(xì)胞因子、趨化因子和生 長(zhǎng)因子的基于磁珠的多重測(cè)定方法已經(jīng)變得更易于W試劑盒，例如Bio-Plex Pro?(參 見(jiàn)Bio-PlexPro?AssayHandbook-http://www.bi〇-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/ literature/10014905.pdf)獲得。然而，與特定生物標(biāo)志物與特定疾病的關(guān)聯(lián)有關(guān)的復(fù)雜 性已經(jīng)推遲了醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的發(fā)展，并且該樣的關(guān)聯(lián)目前是固有地不可預(yù)測(cè)的。此外，該樣 的測(cè)定依舊需要合理水平的技術(shù)，并且該樣的測(cè)定也破壞調(diào)查中的樣品，使得對(duì)同一樣品 進(jìn)行重復(fù)測(cè)定是不可能的。因此結(jié)果的驗(yàn)證是更難的。
[0008] 在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域中的其他發(fā)展中，最近研究已經(jīng)顯示紅外（IR)光譜法在血清 分析W區(qū)分屯、肌梗塞與其他胸痛中的潛力[PetrichW,Lewan化owski邸,Muhlestein JB,HammondMED,JanuzziJL,LewandrowskiEL,PearsonRR,OlenkoB,FruhJ,Haass M,HirschiMM,KohlerW,MischlerR,MocksJ,Ordonez-LlanosJ,Quarder0,Somorjai R，StaibA,SylvenC,WernerG，ZerbackRAnalyst, 134 (6) ,2009; 1092-109引。如果諸 如此類(lèi)的光譜診斷方法可W在臨床上是可行的，其對(duì)于臨床醫(yī)生和患者則可W是高度期望 的，因?yàn)樗鼈儩撛诘靥峁┓瞧茐男?、快速、有成本效益的、易于操作的床旁（point-of-care) 狀況診斷。然而，目前看來(lái)，考慮到面對(duì)樣品方差時(shí)其可疑的可靠性，該樣的光譜診斷技術(shù) 的適用性在某些范圍中是稍微受限的。
[0009] 因此，本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)所固有問(wèn)題的至少一種。另一個(gè)目的是提供 簡(jiǎn)單的、可靠的和有成本效益的床旁診斷方法，所述方法需要最少的人力資源和技術(shù)來(lái)操 作，是不耗時(shí)的，并且所述方法有助于W適當(dāng)?shù)母邷?zhǔn)確度快速確定腫瘤的惡性/良性。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種診斷和/或預(yù)測(cè)受試者中腦癌的方法，所述 方法包括在一種或更多種（合適地預(yù)先指定的）細(xì)胞因子和/或血管生成因子方面測(cè)定受 試者的血液樣品（或其組分）。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種診斷和/或預(yù)測(cè)受試者中增殖性素亂的方 法，所述方法包括對(duì)所述受試者的血液樣品（或其組分）執(zhí)行光譜分析W產(chǎn)生所述血液樣 品（或其組分）特有的光譜特征。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的第=方面，提供了一種檢測(cè)受試者中癌細(xì)胞的方法，所述方法包括 第一方面或第二方面的診斷和/或預(yù)測(cè)腦癌或增殖性素亂的方法的步驟。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種診斷腫瘤（合適地腦瘤，例如膠質(zhì)瘤）是惡性 的還是良性的方法，所述方法包括第一方面或第二方面的診斷和/或預(yù)測(cè)腦癌或增殖性素 亂的方法的步驟。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的第五方面，提供了一種監(jiān)測(cè)受試者對(duì)增殖性素亂的手術(shù)或治療性處 理的反應(yīng)性的方法，所述方法包括第一方面或第二方面的診斷和/或預(yù)測(cè)腦癌或增殖性素 亂的方法的步驟。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的第六方面，提供了用于診斷和/或預(yù)測(cè)受試者中腦癌的診斷試劑 盒，所述診斷試劑盒包括被配置W接收來(lái)自受試者的血液樣品（或其組分）并且在一種或 更多種（合適地預(yù)先指定的）細(xì)胞因子和/或血管生成因子方面測(cè)定所述血液樣品（或其 組分）的裝置；和將所述血液樣品（或其組分）中所述一種或更多種細(xì)胞因子和/或血管 生成因子的量與有利的或不利的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)或有助于所述血液樣品（或 其組分）中所述一種或更多種細(xì)胞因子和/或血管生成因子的量與有利的或不利的診斷結(jié) 果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)的裝置（任選地，與前述提到的相同）。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的第走方面，提供了用于診斷和/或預(yù)測(cè)受試者中增殖性素亂的診斷 試劑盒，所述診斷試劑盒包括被配置W接收來(lái)自受試者的血液樣品（或其組分）并且對(duì)所 述受試者的血液樣品（或其組分）執(zhí)行光譜分析W產(chǎn)生血液樣品（或其組分）特有的光譜 特征的裝置；和將所述血液樣品（或其組分）特有的光譜特征與有利的或不利的診斷結(jié)果 和/或預(yù)測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)或有助于所述血液樣品（或其組分）特有的光譜特征與有利的或不利 的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果的關(guān)聯(lián)的裝置（任選地，與前述提到的相同）。
[001引根據(jù)本發(fā)明的第八方面，提供了來(lái)自在一種或更多種（合適地預(yù)先指定的）細(xì)胞 因子和/或血管生成因子方面測(cè)定受試者的血液樣品（或其組分）的數(shù)據(jù)用于確定受試者 中腦癌的有利的或不利的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果的用途。
[0019]根據(jù)本發(fā)明的第九方面，提供了受試者的血液樣品（或其組分）的光譜特征用于 確定受試者中增殖性素亂的有利的或不利的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果的用途。
[0020] 根據(jù)本發(fā)明的第十方面，提供了數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包括多個(gè)數(shù)據(jù)集，每一個(gè)集與 特定受試者的特定血液樣品（或其組分）中的一種或更多種細(xì)胞因子和/或血管生成因子 有關(guān)，每一個(gè)集與設(shè)及所述特定受試者中的腦癌的有利的或不利的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié) 果關(guān)聯(lián)。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第十一方面，提供了數(shù)據(jù)庫(kù)，所述數(shù)據(jù)庫(kù)包括多個(gè)光譜特征，每一個(gè) 特征與特定受試者的特定血液樣品（或其組分）有關(guān)，每一個(gè)特征被與設(shè)及所述特定受試 者中的增殖性素亂的有利的或不利的診斷結(jié)果和/或預(yù)測(cè)結(jié)果關(guān)聯(lián)。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明的第十二方面，提供了計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)（例如光盤(pán)），所述計(jì)算機(jī)可讀 介質(zhì)包括如本文定義的數(shù)據(jù)庫(kù)。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的第十=方面，提供了安裝有診斷計(jì)算機(jī)軟件的計(jì)算機(jī)，所述診斷計(jì) 算機(jī)軟件被配置W操作計(jì)算機(jī)基于受試者的血液樣品的光譜特征執(zhí)行與增殖性素亂有關(guān) 的預(yù)測(cè)性診斷和/或預(yù)測(cè)。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明的第十四方面，提供了計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)，所述計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)含有如 本文定義的診斷計(jì)算機(jī)軟件。
[002引合適地，增殖性素亂是癌癥，合適地人類(lèi)癌癥，合適地腦癌（和/或相關(guān)的腫瘤）。
[0026] 與本發(fā)明的一個(gè)方面有關(guān)的特征（包括任選的、合適的和優(yōu)選的特征）也可W是 與本發(fā)明的任何其他方面有關(guān)的特征（包括任選的、合適的和優(yōu)選的特征）。
[0027] 附圖簡(jiǎn)述
[0028] 本發(fā)明的實(shí)施方案在下文進(jìn)一步參考附圖被描述，其中：
[0029] 圖1至7分別顯示了關(guān)于IL-8、血管生成素、卵泡抑素、HGF、瘦蛋白、PDGF-BB和 PECAM-1的"對(duì)照均值"（淺灰）和"膠質(zhì)瘤均值"（深灰）W及誤差線(xiàn)的圖形表示。
[0030]圖7A至7F分別顯示了關(guān)于FGF、G-CSF、s肥R2neu、s比-6Ra、催乳素和sVEGFRl的 "對(duì)照均值"（深灰-左）、"低級(jí)別膠質(zhì)瘤均值"（淺灰-中）W及"高級(jí)別膠質(zhì)瘤均值"（中 灰-右）W及誤差線(xiàn)的圖形表示。
[0031] 圖8是陽(yáng)CAM-1和PDGF-BB的散布圖形相關(guān)性圖（scatter-graphical correlationchart)，顯示了 50名膠質(zhì)瘤患者中陽(yáng)CAM-1和PDGF-BB水平之間的關(guān)系并且 展示了線(xiàn)性程度和0. 45的相關(guān)系數(shù)。
[0032] 圖8A-8G顯示了膠質(zhì)瘤和非癌性腦組織之間的攝像免疫組織化學(xué)的比較，即；a) 顯示陽(yáng)性染色和未染色的腫瘤細(xì)胞的放大40倍的膠質(zhì)瘤腫瘤切片；b)顯示陰性染色的血 管的放大40倍的膠質(zhì)瘤腫瘤切片；C)顯示陰性染色的血管的放大40倍的非癌性腦組織； d)顯示間質(zhì)性染色的放大40倍的膠質(zhì)瘤腫瘤切片；e)顯示間質(zhì)性染色尤其是軸突束染色 的放大40倍的膠質(zhì)瘤腫瘤切片；f)顯示陰性染色的血管的放大40倍的非癌性腦組織；g) 顯示陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)染色的脈絡(luò)叢組織。
[0033] 圖9顯示了血清樣品1(全血清）的膜的白光干設(shè)圖譜。
[0034] 圖10顯示了血清樣品3(lOkDaW上組分被移除的血清）的膜的白光干設(shè)圖譜。
[0035] 圖11顯示了血清樣品類(lèi)型1-4的每一個(gè)的FTIR光譜特征的代表性樣品。
[0036]圖 12(取自FilikJ,化ogleyMD,等人，Analyst, 2012,137,853)顯示了在ATR晶 體上不同平均膜厚度下的牛血清白蛋白炬SA)的樣品的疊加的FTIR光譜特征。
[0037] 圖 13 (取自Goorma曲ti曲E,等人，BiochimicaetBio地ysicaActa, 1999， 1422,105)是顯示a)存在于血清樣品中的兩種特征性酷胺，酷胺I(1650cnri)和酷胺II(1550cm-i)的面積比如何隨BSA膜厚度而變化；和b)酷胺I(1650cm-i)和TSPA內(nèi)標(biāo) (835cnTi)的面積比如何隨BSA膜厚度而變化的圖形表示。
[0038] 圖14顯示了在室溫干燥0、2、4、6、8、16和32分鐘的人全血清的多種疊加的光譜 特征。
[0039]圖15是闡明當(dāng)使用預(yù)測(cè)模型評(píng)估"盲集"時(shí)，全血清預(yù)測(cè)模型的訓(xùn)練集準(zhǔn)確度的 圖表。
[0040] 圖16是闡明當(dāng)針對(duì)預(yù)測(cè)模型評(píng)估相關(guān)的"盲集"時(shí)，血清類(lèi)型3預(yù)測(cè)模型的訓(xùn)練 集準(zhǔn)確度的圖表。
[0041] 圖17顯示了在離屯、過(guò)濾器中（左）的0.5ml血清，并且其被離屯、使得過(guò)濾器截留 大于千道爾頓范圍（100、10或3kDa)的所有血清成分，僅允許含有在最大范圍W下的成分 的血清濾液通過(guò)。
[0042] 圖18顯示了在室溫干燥0、2、4、6、8、16和32分鐘的人全血清的多種疊加的 ATR-FTIR光譜特征。光譜已經(jīng)被偏調(diào)（offset)W便易于可視化。
[004引圖19A-D顯示了（A)全血清光譜（900-3900cm-i)和做相比于預(yù)處理的數(shù)據(jù)（噪 音降低（30PC)和矢量歸一化）的指紋區(qū)（900-1800cnTi)似預(yù)處理的全血清光譜和做預(yù) 處理的指紋區(qū)的原始的且未加工的光譜數(shù)據(jù)。可變的CA區(qū)（2300-2400cnTi)已經(jīng)被移除。
[0044] 發(fā)明詳述
[0045] 定交
[0046] 除非另外說(shuō)明，說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中使用的W下術(shù)語(yǔ)具有W下陳述的下面的含 義。
[0047] 本文中，"診斷"或"預(yù)測(cè)"通常包括確定腦癌或增殖性素亂的存在、程度、嚴(yán)重性和 /或侵襲性。該樣，確定有利的或不利的診斷結(jié)果或預(yù)測(cè)結(jié)果通常包括確定腦癌或增殖性素 亂的存在、程度、嚴(yán)重性和/或侵襲性。在特定的實(shí)施方案中，"診斷"或"預(yù)測(cè)"可W指僅存 在腦癌或增殖性素亂。
[0048] 本文中，關(guān)于"血液樣品"包括全血樣品或其組分（例如血清或血漿）的樣品。
[0049] 本文中，"血漿"指的是通常W懸液的形式將血細(xì)胞容納在全血中的血液的淡黃色 /淺黃色液體組分。它構(gòu)成總血容量的約55%。它是細(xì)胞外液（所有的細(xì)胞外體液）的血 管內(nèi)液部分。它大部分是水（按體積計(jì)93%)并且含有溶解的蛋白（主要蛋白是纖維蛋 白原、球蛋白和白蛋白）、葡萄糖、凝血因子、礦質(zhì)離子（Na\Ca+\Mg+\肥(V、等）、激素 和二氧化碳（血漿是用于排泄產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)闹饕橘|(zhì)）。需要注意的是，對(duì)于血漿樣品，邸TA 血漿和巧樣酸鹽血漿二者均是合適的，而肝素血漿是次優(yōu)選的，因?yàn)樵摲N血漿可W吸收某 些細(xì)胞因子。
[0050] 本文中，"血清"指的是既不是血細(xì)胞（血清不含有白細(xì)胞或紅細(xì)胞）也不是凝血 因子的組分；它是纖維蛋白原被移除的血漿。
[0051] 本領(lǐng)域中熟知"細(xì)胞因子"為由大量細(xì)胞分泌的細(xì)胞信號(hào)蛋白分子，并且是細(xì)胞間 通訊中廣泛使用的一類(lèi)信號(hào)分子。細(xì)胞因子可W歸類(lèi)為蛋白、膚或糖蛋白；術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞因子" 包括遍及體內(nèi)由不同胚胎來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生的大的和不同家族的調(diào)節(jié)因子。一些"細(xì)胞因子" 還可W被認(rèn)為是"血管生成因子"，并且反之亦然。
[0052] 本領(lǐng)域中熟知"血管生成因子"為血管生長(zhǎng)因子。在本發(fā)明的上下文中，考慮到"細(xì) 胞因子"與"血管生成因子"作為增殖性素亂的生物標(biāo)志物的聯(lián)合作用，通常它們被共同地 考慮，如在實(shí)施例中和整個(gè)說(shuō)明書(shū)中所展示的。
[0053] 本文中，關(guān)于"測(cè)定（assay)"或"測(cè)定（assaying)"包括任何形式的分析，包括標(biāo) 準(zhǔn)生物測(cè)定（例如生物測(cè)定、免疫測(cè)定等）和甚至光譜分析。在特定的實(shí)施方案中，測(cè)定不 設(shè)及光譜分析。
[0054] 如本文使用的，"受試者"指的是動(dòng)物，優(yōu)選地哺乳動(dòng)物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，受 試者是人類(lèi)受試者。在其他實(shí)施方案中，受試者是非人類(lèi)哺乳動(dòng)物，包括但不限于狗、貓、馬 等。
[0055] 遍及本說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求，詞語(yǔ)"包括"和"包含"和它們的變形意指"包括 但不限于"，并且它們不預(yù)期（并且不）排除其他部分、添加劑、組分、整數(shù)或步驟。遍及本 說(shuō)明書(shū)的描述和權(quán)利要求，單數(shù)包含復(fù)數(shù)，除非上下文另外要求。尤其，在使用不定冠詞時(shí)， 說(shuō)明書(shū)被理解為意指復(fù)數(shù)形式W及單數(shù)形式，除非上下文另外要求。
[0056] 聯(lián)合本發(fā)明的特定的方面、實(shí)施方案或?qū)嵗枋龅奶卣?、整?shù)、特性、化合物、化學(xué) 部分或基團(tuán)被理解為適用于本文描述的任何其他方面、實(shí)施方案或?qū)嵗桥c其不相容。 本說(shuō)明書(shū)（包括任何附隨的權(quán)利要求書(shū)、摘要和附圖）中公開(kāi)的所有特征、和/或該樣公開(kāi) 的任何方法或過(guò)程的所有步驟可W在任何組合中被組合，除了其中該樣的特征和/或步驟 中的至少一些是互相排斥的組合。本發(fā)明不受任何前述實(shí)施方案的細(xì)節(jié)的限制。本發(fā)明延 伸至本說(shuō)明書(shū)（包括任何附隨的權(quán)利要求書(shū)、摘要和附圖）中公開(kāi)的特征的任何新穎的一 個(gè)或任何新穎的組合，或延伸至該樣公開(kāi)的任何方法或過(guò)程的步驟的任何新穎的一個(gè)或任 何新穎的組合。
[0057] 讀者的注意力關(guān)注到當(dāng)前與本說(shuō)明書(shū)一起遞交或在本說(shuō)明書(shū)之前遞交的與本申 請(qǐng)有關(guān)的并且隨本說(shuō)明書(shū)公開(kāi)供公眾查閱的所有論文和文件，并且所有該樣的論文和文件 的內(nèi)容通過(guò)引用被并入本文。
[0058] 為免生疑問(wèn)，在此聲明，本說(shuō)明書(shū)中前文在標(biāo)題"背景"下公開(kāi)的信息是與本發(fā)明 相關(guān)的并且被理解為本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容的部分。
[0059] 如本文使用的，"膚"和"蛋白"可W互換被使用并且意指通過(guò)膚鍵連接的至少兩 個(gè)共價(jià)附接的氨基酸。術(shù)語(yǔ)蛋白包含純化的天然產(chǎn)物或使用重組或合成技術(shù)可W部分地或 全部地制備的產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)膚和蛋白可W指蛋白的聚集物，例如二聚體或其他多聚體；融合蛋 白；蛋白變體或其衍生物。該術(shù)語(yǔ)還包括蛋白的修飾形式，例如通過(guò)糖基化、己酷化、磯酸 化、聚己二醇化、泛素化等修飾的蛋白。蛋白可W包含不通過(guò)核巧酸密碼子編碼的氨基酸。
[0060]"蛋白修飾"或"蛋白突變"意指多膚序列中的氨基酸取代、插入、和/或缺失，或化 學(xué)地連接至蛋白的部分的改變。例如，修飾可W是附接至蛋白的改變的碳水化合物或PEG 結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的蛋白可W包括至少一種該樣的蛋白修飾。
[0061] 保守取代；一個(gè)或更多個(gè)氨基酸取代（例如1、2、5或10個(gè)殘基）具有相似生物化 學(xué)特性的氨基酸殘基。通常，保守取代對(duì)獲得的多膚的活性具有很少至沒(méi)有的影響。例如， 接觸階段因子（contact地asefactor)抑制性膚中的保守取代可W是基本上不影響膚抑 制接觸階段因子的能力的氨基酸取代或氨基酸取代的組合。
[0062] 取代的變體是其中氨基酸序列中至少一個(gè)殘基已經(jīng)被移除并且不同的殘基插入 其位置的那些?？蒞取代蛋白中初始氨基酸并被認(rèn)為是保守取代的氨基酸的實(shí)例包括；Ser取代Ala;Lys取代Arg;Gln或His取代Asn;Glu取代Asp;Asn取代Gin;Asp取代Glu;Pro 取代Gly;Asn或Gin取代His;Leu或Val取代lie;Ile或Val取代Leu;Arg或Gin取代 Lys;Leu或lie取代Met;Met、Leu或Tyr取代化e;T虹取代Ser;Ser取代"T虹；Tyr取代 hp;T巧或Phe取代Tyr 及l(fā)ie或Leu取代Val。
[0063] 在一個(gè)實(shí)施方案中，取代可W是在Ala、ValLeu和lie中；在Ser和T虹中；在Asp 和Glu中；在Asn和Gin中；在Lys和Arg中；和/或在Phe和Tyr中。
[0064] 關(guān)于在其他位置中的保守取代的另外的信息可見(jiàn)于Ben-Bassat等人 (J.Bacteriol. 169:751-7, 1987)、0'Regan等人（Gene77:237-51, 1989)、S址in-Toth等 人（ProteinSci. 3:240-7, 1994)、Hochuli等人炬io/Technology6:1321-5, 1988)、W0 00/67796 (化rd等人）W及可見(jiàn)于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)。
[006引術(shù)語(yǔ)"修飾的蛋白"或"突變的蛋白"包括具有氨基酸的至少一種取代、插入和/或 缺失的蛋白。修飾的或突變的蛋白可W具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)或更多個(gè)氨基酸 修飾（選自取代、插入、缺失和其組合）。
[0066] 功能上等同的：具有等同的功能。在接觸階段因子抑制性膚的情況下，功能上等同 的分子包括保持抑制相同接觸階段因子的功能的不同分子。例如，功能等同物可W通過(guò)接 觸階段因子抑制性膚中的序列改變來(lái)提供，其中具有一種或更多種序列改變的膚保持未改 變的膚抑制一種或更多種接觸階段因子的能力。
[0067] 序列改變的實(shí)例包括，但不限于保守取代、缺失、突變和插入。在一個(gè)實(shí)例中，給定 的多膚結(jié)合一種活性物，且功能上等同的是結(jié)合相同活性物的多膚。因此功能等同物包括 與多膚具有相同結(jié)合特異性并且可W被用于取代所述多膚的膚。在一個(gè)實(shí)例中，功能等同 物包括其中結(jié)合序列是不連續(xù)的多膚，其中活性物結(jié)合線(xiàn)性表位。
[0068] 純化的：術(shù)語(yǔ)純化的不需要絕對(duì)純度；而是，它預(yù)期作為相對(duì)術(shù)語(yǔ)。因此，例如純 化的膚制品是其中膚或蛋白比該膚或蛋白在其細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中更富集，使得膚與可能伴隨其 的細(xì)胞組分（核酸、脂類(lèi)、碳水化合物和其他多膚）基本上分離的制品。在另一個(gè)實(shí)例中， 純化的膚制品是其中膚基本上不含污染物的制品，所述污染物例如可W在膚的化學(xué)合成之 后存在的那些。
[0069]本發(fā)明設(shè)及與本公開(kāi)內(nèi)容的蛋白或膚具有至少75%、至少80%、至少85%、至少 90%、至少95%的同一性的蛋白和膚（例如細(xì)胞因子和/或血管生成因子），例如96%或更 多、97%或更多、98%或更多或99%或更多；該樣的蛋白可W具有本公開(kāi)內(nèi)容的對(duì)應(yīng)的蛋 白或膚的活性。
[0070] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解該些序列同一性范圍被提供僅用于指導(dǎo)；可能的是可W獲 得落在提供的范圍之外的非常重要的同系物。兩個(gè)氨基酸序列基本上相同的可選（并且不 需要是累積的）含義是第一序列的多膚與第二序列的多膚在免疫學(xué)上是交叉反應(yīng)的。
[0071] 變體、片段或融合蛋白；公開(kāi)的蛋白包括其變體、片段和融合物。
[0072] 一般方法學(xué)
[0073]本發(fā)明提供了僅