web/pdf/ ls:r/literature/10014905.D壯從Bio-RadL油oratories,Inc可獲得。該說明手冊的方案 遵循有關(guān)"Bi〇-PlexPro?人、小鼠和大鼠細胞因子測定炬i〇-PlexPro?Human,Mouse,and Rat切tokineAssays)"。Bio-Plex?系統(tǒng)按照說明手冊中描述的制備，合適地校準并且如 描述的驗證。將存在于96孔Bio-PlexPro平底板的磁珠使用Bio-PlexPro洗漆站（wash station)的磁性裝置通過磁性分離洗漆。將96孔Bio-PlexPro平底板合適地布局，其中 孔被合適地分配。Bio-plex系統(tǒng)提供的合適的標準物根據(jù)列在說明手冊中的方案制備。
[0195] 如說明手冊中描述的，將Bio-Plex?懸浮陣列系統(tǒng)圍繞xMAP技術(shù)的S個核屯、元素 來建立：
[0196] ?巧光染色的微球（也稱為珠），每一個具有獨特的顏色代碼或光譜地址W允許區(qū) 別多重懸浮液中的單個測試。該允許在96孔微板的單個孔中同時檢測多于100種不同類 型分子
[0197] ?具有兩種激光和相關(guān)的光學(xué)器件的專用流式細胞儀W測量結(jié)合在珠的表面的不 同分子
[019引 ?有效控制巧光數(shù)據(jù)的高速數(shù)字信號處理器
[0199]Bio-PlexPro?細胞因子、趨化因子和生長因子測定本質(zhì)上是在磁珠上設(shè)計的免 疫測定。測定原理與夾屯、化ISA的測定原理相似（圖1)。針對期望的生物標志物的捕獲 抗體被共價偶聯(lián)至珠。偶聯(lián)的珠與含有感興趣的生物標志物的樣品反應(yīng)。在一系列洗漆w移除未結(jié)合的蛋白之后，加入生物素化的檢測抗體W產(chǎn)生夾屯、復(fù)合物。通過加入鏈霉親和 素-藻紅蛋白（SA-P巧綴合物形成最終檢測復(fù)合物。藻紅蛋白用作巧光指示物或報告物。
[0200] 還如在說明手冊中解釋的，來自反應(yīng)的數(shù)據(jù)使用Bio-Plex系統(tǒng)或類似的基于 Luminex的讀取器獲得。例如，當多重測定懸浮液被吸入Bi〇-Plex200讀取器時，紅色 化35nm)激光照亮每一個珠中的巧光染料W提供珠分類并因此提供測定鑒定。同時，綠色 巧32nm)激光激發(fā)PE產(chǎn)生通過光電倍增管（PMT)檢測的報告物信號。高速數(shù)字處理器控制 數(shù)據(jù)輸出并且Bio-PlexManager?軟件將數(shù)據(jù)呈現(xiàn)為平均巧光強度（MFI)W及濃度（pg/ mL)。結(jié)合至每一個珠的分析物的濃度與報告物信號的平均巧光強度（MFI)成比例。
[0201] 說明手冊將測定的初始制備概括如下：
[0202] 1.規(guī)劃板的布局
[0203] 2.啟動/加熱Bio-Plex系統(tǒng)（多達30min)
[0204] ?同時，平衡測定試劑至室溫（RT)
[0205] ?開始解凍樣品
[0206] 3.準備好洗漆站或校準真空歧管
[0207] 4.校準系統(tǒng)（現(xiàn)在或之后在解育期間）
[020引 5.在500 的合適的稀釋劑中重構(gòu)單個小瓶的標準物，禍旋并且在冰上解育 (30min)
[0209] ?對于血清和血漿樣品（按照本實施例），使用Bio-Plex標準物稀釋劑
[0210] 6.制備8點標準物稀釋系列和空白。
[0211] ?向管S1加入72y1稀釋劑，并且向管S2-8和空白加入150y1稀釋劑。
[0引引?將128y1重構(gòu)的標準物轉(zhuǎn)移進入S1
[0213] ?然后通過在管之間轉(zhuǎn)移50y1而從S1至S8連續(xù)稀釋4倍。在轉(zhuǎn)移之間禍旋
[0214] 7.解凍之后，制備1X樣品
[0215] .WBio-Plex樣品稀釋劑稀釋血清、血漿和裂解物
[021引8.制備在測定緩沖液中的IX偶聯(lián)的珠，避光[0217] ?從10X儲液；將575 y1珠加至5, 175y1緩沖液
[0引引?從20X儲液；將288 y1珠加至5, 472y1緩沖液
[0219] 9.確保在分配之前樣品和標準物處于室溫
[0220] 說明手冊將測定的運行概括如下：
[0221] 1.用100y1測定緩沖液預(yù)濕濾板（跳過平底）
[0222] 2.將50y1的1X珠加至測定板
[022引 3.用100y1洗漆緩沖液洗漆2次[0224] 4.加入50y1樣品、標準物、空白、對照
[022引 5.加蓋并在室溫在黑暗中解育，同時在300RPM振蕩
[0226] ? 30min-人類組I、II和小鼠組I、II
[0227] 用剩余的lOmin，制備在檢測抗體稀釋劑中的1X檢測Ab
[022引 ?從10X儲液；將300 y1Ab加至2, 700y1稀釋劑
[0229] ?從20X儲液；將150 y1Ab加至2, 850y1稀釋劑
[0230] 6.用100y1洗漆緩沖液洗漆3次
[0231] 7.加入25y1的檢測抗體
[023引8.加蓋并在室溫在黑暗中解育，同時在300RPM振蕩
[023引? 30min-人類組I、II;小鼠組I、II
[0234] 同時，準備軟件方案；輸入歸一化的標準S1值
[0235] 用剩余的lOmin，制備測定緩沖液中的1XSA-PE，從100X儲液；將60y1SA-PE 加至5, 940y1測定緩沖液。避光
[023引9.用100y1洗漆緩沖液洗漆3次
[0237] 10.加入50y1的鏈霉親和素-PE
[023引11.加蓋并在室溫在黑暗下解育，同時在300RPM振蕩
[0239] ?lOmin-人類組I、II;小鼠組I、II
[0240] 12.用100y1洗漆緩沖液洗漆3次
[0241] 13.將珠重懸在125y1測定緩沖液中，在1100RPM振蕩30sec
[0242] 14.讀取板
[0243] ?低PMT(低RP1)-人類組 1、11 ;小鼠組 1、11
[0244] 根據(jù)說明手冊，用于人類、小鼠和大鼠細胞因子測定的Bio-PlexPro?測定試劑盒 提供的試劑包括（表1): 陽24引表1-用于人類、小鼠巧大鼠細胸肉子測定的Bio-PlexPro?測定試劑念搖供的試 Mj
[0246]
[0247] 地io-PiexPro?高度稀釋試劑盒包括70ml基于血清的稀釋劑替代標準物稀釋劑 和樣品稀釋劑
[024引根據(jù)說明手冊，可測試的細胞因子包括（表2): 陽24引表2-可檢杳的細胸肉子
[0巧0]
[0251] 然而，另外的細胞因子和血管生成因子實際上被測試，并且相關(guān)的標準物和方案 相應(yīng)地被開發(fā)。該些另外的細胞因子和血管生成因子詳細描述在結(jié)果部分。 。巧引倉血取樣
[0253] 全血樣品收集自50名膠質(zhì)瘤患者和27名健康受試者。 。巧4] 從倉血樣品制各血漿樣品
[0255] 50名膠質(zhì)瘤患者和27名健康受試者的每一名的血漿樣品通過W下制備；將對應(yīng) 的新鮮全血樣品添加至含有抗凝劑的管中，并且于4°C在13, 200巧m下旋轉(zhuǎn)lOmin直到血細 胞落至管的底部W清除沉淀的樣品。然后將血漿傾倒出或吸出。獲得的血漿具有約1025kg/ m3或1. 02化g/1的密度。然后將血漿樣品立即測定或另外等分并且在-70°C下W單獨使用 的等分試樣儲存用于之后使用，然而避免重復(fù)冷凍/解凍循環(huán)。
[0巧6] 在實施測定之前，將1體積血漿樣品用3體積樣品稀釋劑稀釋（例如，50yL樣品 +150UL樣品稀釋劑）。 。巧7] 制各偶巧的妹
[0巧引現(xiàn)在使用Bio-Plex?Pro說明手冊中采取的方案描述偶聯(lián)的珠的制備。
[0259] 每一個試劑盒包括1管偶聯(lián)的珠。提供了用于稀釋偶聯(lián)的珠至IX濃度的說明。
[0260] 當使用10個包裝試劑時，保證只有需要的體積的偶聯(lián)的珠、檢測抗體、鏈霉親和 素-PE和緩沖液從管或瓶移出。例如，轉(zhuǎn)移足夠執(zhí)行測定程序的所有步驟（即，預(yù)濕過濾 板、稀釋偶聯(lián)的珠，稀釋鏈霉親和素-PE和重懸珠）的一次體積的測定緩沖液進入50ml貶 液器。
[0261] 1.使用W下顯示的計算工作表計算所需偶聯(lián)的珠和測定緩沖液的體積。
[0262] 2.將所需體積的測定緩沖液加至15ml聚丙締管。
[0263] 3.在中速下禍旋偶聯(lián)的珠30sec。小屯、打開蓋子并且用移液管將落入蓋子中的任 何液體用移液管吸回至管中。該對保證最大珠回收是重要的。不要離屯、小瓶；該么做會引 起珠成團。
[0264] 4.用移液管吸取所需體積的偶聯(lián)的珠的儲液進入含有測定緩沖液的15ml管W將 偶聯(lián)的珠稀釋至1X濃度。每一個孔需要使用測定緩沖液調(diào)整至50y1最終體積的5y1 偶聯(lián)的珠（10X)或2. 5yl偶聯(lián)的珠（20X)。參考下表3-6中的示例珠計算，其包括20 % 過量W補償轉(zhuǎn)移損失。 巧]表3-從10X儲液制各IX偶巧的妹。預(yù)先混合的板或一個單電測定
[0266]
[0273] 5.用侶巧避免珠受光照。在使用之前在室溫平衡20min 。的4] 甚于磁妹的《電測定
[02巧]然后如Bio-Plex?Pro說明手冊（也在W下列出）中描述的來運行測定。
[0276] 在使用之前將所有緩沖液、稀釋的標準物、稀釋的偶聯(lián)的珠和樣品恢復(fù)至室溫。為 保證最佳的性能，用校準的移液管小屯、的吸?。ū苊馄鹋荩?，并且使用新的移液管吸頭。
[0277] 將偶聯(lián)的珠、標準物和樣品加入并且然后：
[027引1.用密封帶覆蓋未使用的孔。
[0279] 2.預(yù)濕濾板。
[0280] 3.在中速下禍旋稀釋的偶聯(lián)的珠30sec。
[0281] 將稀釋的偶聯(lián)的珠傾倒入試劑貶液器并且每一個孔添加50y1。
[0282] 提示；由于易于使用和效率多通道移液管是高度推薦的。
[0283] 4.用選擇的洗漆方法洗漆孔兩次。
[0284] 5.輕輕禍旋稀釋的標準物、空白、樣品和對照（如果適用）l-3sec。將50y1稀釋 的標準物、對照或樣品加至每一個孔，在每一體積轉(zhuǎn)移之后更換移液管吸頭。
[02財6.在室溫下在搖床上解育，如下面表7中詳細說明的。 陽28引表7-測定的僻育時間
[0287]
[028引注解;解育時間已經(jīng)被優(yōu)化用于每一個測定并且應(yīng)該不超過化r。與此解育時間 一致，W用于優(yōu)化再現(xiàn)性。
[0289] 制備和添加檢測抗體。
[0290] 每個試劑盒包含1管檢測抗體。提供了用于稀釋檢測抗體至IX濃度的說明。
[0291] 1.在解育樣品時，使用W下顯示的計算工作表計算檢測抗體和所需檢測抗體稀釋 劑的體積。檢測抗體應(yīng)該在使用之前l(fā)〇-15min制備。
[0292] 2.將所需體積的檢測抗體稀釋劑添加至15ml管。
[0293] 3.在中速下禍旋檢測抗體15-20sec，然后執(zhí)行30sec旋轉(zhuǎn)則女集在小瓶底部的全 部體積。
[0294] 4.從每一個檢測抗體管中用移液管吸取所需體積進入15ml聚丙締管。測定的 每一個孔需要被調(diào)整至最終體積25y1的2. 5y1檢測抗體（10X)或1. 25y1檢測抗體 (20X) 〇
[0295] 參考下面表8-11中的示例檢測抗體計算。該些計算包括25%過量W補償轉(zhuǎn)移損 失。
[0296] 表8-11概括了從單獨的lOX或20X儲液制備IX檢測抗體所需的體積。還顯 示了當混合兩種10X或兩種20X儲液時制備IX抗體的體積。對于從不同濃度的兩種 儲液（例如，當混合人糖尿?。?0X)與人類組I測定（10X))制備IX抗體的說明，參見 Bio-PlexPro糖尿病說明手冊（公告號10010747)。 。297]表8-從10X儲液制各IX偶巧的妹。預(yù)先混合的板或一個單電測定[0298]
[0305] 5.在解育樣品之后，緩慢移除并且棄去密封帶。
[0306] 6.用選擇的洗漆方法洗漆=次。
[0307] 7.輕輕禍旋稀釋的檢測抗體l-3sec。將稀釋的檢測抗體傾倒入試劑貶液器并且 使用多通道移液管向每一個孔添加25y1。
[030引8.用一張新的密封帶覆蓋板并且密封孔。在室溫下在搖床上解育，如下面表12中 詳細說明的。 陽30引表12-測定僻育時間
[0310]
[0311] 制備和添加鏈霉親和素-PE
[0312] 1.在解育檢測抗體時，使用W下顯示的計算工作表計算鏈霉親和素-PE(IOOX) 和需要的測定緩沖液的體積。每一個孔需要用測定緩沖液調(diào)整至最終體積50y1的0. 5y1 鏈霉親和素-PE(IOOX)。鏈霉親和素-PE(IOOX)應(yīng)該在使用之前l(fā)Omin制備。
[0313] 2.將所需體積的測定緩沖液添加至15ml管。
[0314] 3.在中速下禍旋鏈霉親和素-PE管15-20sec。執(zhí)行30sec旋轉(zhuǎn)W收集在小瓶底 部的全部體積。
[0315] 4.用移液管吸取所需體積的鏈霉親和素-PE進入含有測定緩沖液的15ml聚丙締 管W將鏈霉親和素-PE稀釋至1X濃度。
[0316] 下面的表13顯示了稀釋鏈霉親和素-PE的示例計算，其包括25%過量W補償轉(zhuǎn)移 損失。使鏈霉親和素-PE避光直到準備使用。 陽317] 表13-從100X儲液制各鏈霉親巧素-PE
[031引
。引引~ 5.在檢測抗體解育之后，緩慢移除并且棄去密封帶。
[0320] 6.用選擇的洗漆方法洗漆=次。
[0321] 7.在中速下禍旋稀釋的鏈霉親和素-PE3-5sec。將稀釋的鏈霉親和素-陽傾倒 入試劑貶液器并且使用多通道移液管向每一個孔添加50y1。
[0322] 8.在室溫下在搖床上解育持續(xù)如下面表14中詳細說明的時間。 防32引表14-測定僻育時間
[0324]
[0325] 9.在鏈霉親和素-陽解育步驟之后，緩慢移除并且棄去密封帶。
[0326] 10.用選擇的洗漆方法洗漆孔=次。
[0327] 11.將125U1測定緩沖液添加至每一個孔。用一張新的密封帶覆蓋板。在 1，lOOrpm于室溫振蕩板30sec并且緩慢移除密封帶。保證在將板置于讀取器上之前板蓋已 經(jīng)被移除。 防32引選取測定板
[0329] 根據(jù)如W下描述的說明手冊讀取測定板。
[0330] 推薦Bio-PlexManager?軟件用于所有Bio-PlexPro測定數(shù)據(jù)獲取和分析。還包 括用于LuminexxPONENT軟件的說明。對于使用其他xMAP系統(tǒng)軟件包的說明，聯(lián)系Bio-Rad 技術(shù)支持或你的區(qū)域的Bio-Rad領(lǐng)域應(yīng)用專家。
[0331] 應(yīng)該提前準備方案，使得實驗一完成即讀取板。方案文件詳細說明了讀取過程中 使用的分析物、被讀取的板孔、樣品信息、標準物和對照的值、W及儀器設(shè)置。
[0332] 方案可W從6. 0版Bio-Plex管理軟件獲得或從文件菜單中創(chuàng)建。6. 0版Bio-Plex 管理軟件包含用于大部分Bio-Plex測定的方案。方案應(yīng)該選擇應(yīng)創(chuàng)建的新方案。
[0333] 方案通過下面的步驟來準備：
[0334] 1.描述方案并且輸入關(guān)于測定的信息。
[0335] 2.選擇分析物（來自W上表2)。
[0336] 3.根據(jù)創(chuàng)建的用于測定的板布局模板設(shè)計板的格式。
[0337] 4.輸入標準物的細節(jié)-例如每一種分析物的最高濃度、稀釋因子、批號等。
[033引 5.輸入對照信息，包括對于每一個測定的每一個用戶專用的對照的濃度和稀釋信 息。
[0339] 6.輸入樣品信息，包括合適的稀釋因子。
[0340] 7.運行適于關(guān)注的分析物的軟件方案。
[0341] 數(shù)據(jù)通過下面的步驟來獲?。?br>[0342] 1.將測定板在1，10化pm振蕩30sec并且目測檢查板W保證測定孔填充有緩沖液。
[0343]2.運行方案W開始獲取數(shù)據(jù)。
[0344] 3.在每一個板運行之后使用"板之間的洗漆"功能W降低堵塞。
[0345] 然后執(zhí)行數(shù)據(jù)分析和離群值移除。
[0346] 離群值被定義為不滿足準確度和精密度要求的標準數(shù)據(jù)點并且當執(zhí)行曲線擬合 時被認為是無效的。該樣，它們應(yīng)該被移除W產(chǎn)生更真實的和準確的標準曲線。該可導(dǎo)致 延伸的測定工作范圍并且允許可能否則被認為是范圍外（00R)的樣品的定量。
[0347] 在6. 0版Bio-Plex管理軟件中，離群值可W通過選擇標準曲線窗口中的優(yōu)化按鈕 來自動移除。在6. 0和更早版本的Bio-Plex管理軟件中，離群值還可W在報告表中手動選 擇。
[034引計算
[0349]Bio-Plex?Pro說明手冊詳細描述了W下計算： 。巧0]規(guī)劃板巧局
[0351] 1.如在規(guī)劃板布局部分（第13頁）中說明的，填充96孔板模板（第43頁）。
[0巧2] 如果使用預(yù)混合的板或一個單重測定，遵循該些指導(dǎo)。
[0巧3] 輸入將在測定中使用的孔的數(shù)目：_(1) 。巧4] 計算偶巧的妹
[0巧5] 1.確定需要的IX偶聯(lián)的珠的體積。
[0巧引 a.每一個孔需要50y1的偶聯(lián)的珠（1X) ;_(l)x50y1 =_y1似
[0357]b.包括20%過量W保證足夠的體積：_yl(2)x0. 20 =_y1 (3)
[0巧引 C. 1X偶聯(lián)的珠的總體積；_y1(2) +_y 1 (3) =_y 1(4)
[0359] d. 20X偶聯(lián)的珠儲液的體積；_y 1(4)/20 =_y 1妨
[0360] e.需要的測定緩沖液的體積；_y1(4) -_y1巧）=_化） 陽36。 計算偶巧的妹
[0362] 1.確定需要的IX偶聯(lián)的珠的體積。
[036引 a.每一個孔需要50 的偶聯(lián)的珠（IX) ;_(l)x50y1 =_似
[0364] b.包括20%過量w保證足夠的體積：_yl(2)x 0.20 =_U1(3)
[036引 C. 1X 偶聯(lián)的珠的總體積；_y1(2) +_y 1(3) =_y 1(4)
[036引 d. 20X偶聯(lián)的珠儲液的體積；_y 1(4)/20 =_y 1妨
[0367] e.需要的測定緩沖液的體積：_y 1(4) -_U1巧）=_(6) 陽36引 計算偶巧的妹
[0369] 1.確定需要的IX偶聯(lián)的珠的體積。
[0370] a.每一個孔需要50y1的偶聯(lián)的珠（1X) ;_(l)x50y1 =_y1似
[0371] b.包括20%過量W保證足夠的體積：_yl(2)x 0. 20 =_y1 (3)
[037引 c. 1X 偶聯(lián)的珠的總體積；_y1(2) +_y 1 (3) =_y 1(4)
[0；37引 d. 20X偶聯(lián)的珠儲液的體積；_y 1(4)/20 =_y 1妨
[0374] e.需要的測定緩沖液的體積；_y 1(4) -_y1巧）=_化）
[0375] 如果混合單重測定，遵循該些指導(dǎo)。 37引 計算偶巧的妹
[0377] 1.確定需要的IX偶聯(lián)的珠的體積。
[0；37引 a.每一個孔需要50y1的偶聯(lián)的珠（1X) ;_(l)x50y1 =_y1似
[0379] b.包括20%過量W保證足夠的體積：_yl(2)x 0. 20 =_y1 (3)
[0380] c. 1X 偶聯(lián)的珠的總體積；_y1(2) +_y 1 (3) =_y 1(4)
[0381] d.輸入將被多重化的糖尿病單集（或分析物）管的數(shù)目=_(5)
[038引e.從每一個偶聯(lián)的珠的管獲得的20X偶聯(lián)的珠的體積；_y1(4)/20 = _y1(6)
[038引f.需要的糖尿病珠儲液的總體積；__(5)X_y1化）=_y1(7)
[0384] g.需要的測定緩沖液的體積；__y 1(4) -_y1(7) =_y1(8) 陽3財 計算檢測杭體
[0386] 2.確定需要的IX檢測抗體的體積。
[0387] a.每一個孔需要 25y1 的檢測抗體（1X) ;_(l)x25y1 =_U1(9)
[038引b.包括25%過量W保證足夠的體積：_yl(9)x0.25 =_U1(10)
[0389] C.1X檢測抗體的總體積；_y1(9) +_yl(lO) =_y1(11)
[0390] d.輸入將被多重化的糖尿病單集（或分析物）管的數(shù)目=_(5)
[0391]e.從每一個檢測抗體管獲得的20X檢測抗體的體積；_y1(11)/20 =_ y 1(12)
[039引f.糖尿病檢測抗體儲液的總體積：__y1(12)X_(5) =_y1 (蝴
[039引g